Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение закономерностей ветвления тела высших растений, а также выявление клеточных и гормональных механизмов регуляции процессов роста, пролиферации и дифференциации клеток в ходе формирования его тканей является важной и актуальной проблемой современной биологии развития растений. Данная работа посвящена исследованию ключевых событий в инициации подземных органов растений — боковых корней.
Важнейшей функцией корня является обеспечение минерального питания растения. Почва является гетерогенной средой с неравномерным распределением питательных веществ. Необходимость компенсации неравномерности среды приводит к ветвлению главного корня и, впоследствии, к формированию корневой системы.
Выделяют две основные стратегии ветвления главного корня в зависимости от расположения зоны инициации примордиев боковых корней (ПБК) в кончике главного корня. К представителям первой стратегии относят большинство видов однодольных и двудольных травянистых растений, для которых характерна инициация ПБК выше зоны растяжения. Под влиянием стимула неизвестной природы (в качестве такого стимула чаще всего рассматривается фитогормон ауксин) клетки перицикла, вышедшие из митотического цикла в фазе G1 в конце меристемы, возобновляют пролиферацию и участвуют в инициации ПБК (Демченко, Демченко, 2001; Himanen et al, 2002). К представителям второй стратегии относят виды, у которых инициация ПБК происходит в апикальной меристеме главного корня. Такой тип закладки боковых корней характерен для видов семейства Тыквенные (Cucurbitaceae), Гречишные (Polygonaceae) и некоторых водных растений (Гуляев, 1964; O'Dell, Foard, 1969; Mallory et al, 1970; Дубровский, 1987; Демченко et al, 2001). В случае данной стратегии при инициации ПБК определение места инициации и инициальных для примордия клеток происходит в системе пролиферирующих клеток апикальной меристемы корня.
Исследования последнего десятилетия структурных, физиологических и молекулярно-генетических механизмов, определяющих ветвление главного корня, проводилось, в основном, на представителе первой стратегии ветвления - модельном объекте генетики развития Arabidopsis thaliana. На этой экспериментальной модели была показана важнейшая роль ауксина в регуляции инициации и развития боковых корней (Reed et al, 1998; Casimiro et al, 2003; Dubrovsky et al, 2008; Laskowski et al, 2008; Fukaki, Tasaka, 2009). Полученные данные могут быть экстраполированы и на виды семейства злаковые, для которых также характерна инициация ПБК за зоной растяжения (Coudert et al, 2010; Sreevidya et al, 2010). Однако, практически ничего не известно о механизмах, определяющих ветвление корня, у видов с инициацией боковых корней в апикальной меристеме родительского корня.
Вовлечение клеток различных тканей материнского корня (перицикла, эндодермы, коры и т.д.) в инициацию бокового корня в случае обеих стратегий
является примером переключения программы их развития. В случае первой стратегии ветвления клетки тканей переходят к инициации примордия на фоне возобновления пролиферации клеток, предположительно, под действием ауксина. При инициации ПБК в апикальной меристеме родительского корня все ещё остаётся неизвестной последовательность наиболее ранних морфогенетических событий, приводящих к формированию примордия.
Несмотря на многочисленные данные о роли ауксина в инициации и формировании боковых корней, остаётся неизученным вопрос, является ли ауксин необходимым и достаточным триггером, определяющим вовлечение клеток перицикла и других тканей в процесс инициации ПБК или для этого необходим другой механизм. Для второй стратегии не изучена гормональная регуляция процесса инициации ПБК: не известно, происходит ли локальное накопление ауксина в отдельных клетках перицикла или иной ткани, приводящее к смене программы развития этой клетки, или осуществляется другое пространственное распределение ауксина. Кроме того, не известно, влияют ли цитокинины на инициацию ПБК в апикальной меристеме родительского корня и не ингибируют ли они данный процесс.
Сравнительное изучение клеточных и физиологических основ инициации боковых корней и формирования корневых меристем de novo у представителей этих двух стратегий позволит выявить универсальные механизмы, обеспечивающие регуляцию клеточного цикла, пролиферации и дифференциации клеток растений.
Цель и задачи работы. Целью данной работы является выяснение клеточных и физиологических механизмов инициации боковых корней в меристеме родительского корня. Для реализации поставленной цели, в качестве модельного растения, у которого инициация и формирование бокового корня происходит в непосредственной близости к кончику корня, был выбран кабачок (Cucurbita реро L. var. giromontind). Для достижения поставленной цели исследования решались следующие задачи:
-
Выявить последовательности начальных структурных событий процесса инициации боковых корней в апикальной меристеме главного корня Cucurbita реро.
-
Провести анализ пролиферативной активности клеток окружающих место инициации примордия бокового корня Cucurbita реро.
-
Создать технологию получения композитных растений Cucurbita реро с трансгенными корнями, позволяющими визуализировать локализацию клеточного ответа на ауксин и цитокинины.
-
Изучить распределение клеточного ответа на ауксин и цитокинины в связи с инициацией и развитием боковых корней путём локализации экспрессии репортерных генов под контролем синтетического ауксин-чувствительного промотора DR5 и промотора гена первичного ответа на цитокинины ARR6, соответственно.
-
Определить влияния экзогенного ауксина и блокатора транспорта ауксина на инициацию и развитие боковых корней у Cucurbita реро.
Научная новизна диссертационной работы. Результаты данной работы вносят существенный вклад в наши знания о клеточных и физиологических механизмах ветвления корневых систем (инициации и развития боковых корней) у высших растений. В ходе выполнения данной работы были впервые выявлены первые анатомические события, приводящие к инициации бокового корня в меристеме родительского, а также показана последовательность вовлечения клеток различных тканей корня в формирование ПБК. Изучена пролиферативная активность клеток окружающих место инициации бокового корня и показано, что инициация ПБК происходит в окружении активно пролиферирующих клеток меристемы родительского корня. Впервые показано распределение максимумов клеточного ответа на ауксин и цитокинины в ходе инициации и формирования бокового корня в меристеме родительского, иллюстрирующее независимость места инициации бокового корня от максимума клеточного ответа на ауксин и при этом необходимость накопления ауксина в клетках примордия для его дальнейшего развития. Предложены новые модели для изучения ветвления корневой системы.
Научно-практическое значение. Результаты данной работы важны для практического использования, поскольку являются теоретической базой для создания основ инновационного сельского хозяйства в Российской Федерации. Кроме того, результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Физиология и биохимия растений», а также «Генетика развития растений». Созданная в ходе выполнения работы методика получения композитных растений и молекулярные конструкции могут быть использованы широким кругом исследователей для изучения молекулярно-генетических механизмов развития корневой системы.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Международной конференции «Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine» (Санкт-Петербург, 2009); HI Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные вопросы биобезопасности» (Москва, 2010); Международной конференции Plant Transformation Technologies II (Вена, Австрия, 2011); VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школе «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011); 7-м Международном Симпозиуме «Structure and Function of roots» (Novy Smokovec, Словакия, 2011); Второй Международной конференции «АСТАНА БИОТЕХ 2011» (Астана, Казахстан, 2011).
Работа выполнена при финансовой поддержке: Российского фонда фундаментальных исследований (11-04-02022); Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие» и «Живая природа: современное состояние и проблемы развития», ФЦП «Научные и педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (П289, 14.740.11.1226), Фонда содействия отечественной науке.
Работа выполнена с использованием научного оборудования Центров коллективного пользования: «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» Отделения биологических наук Российской академии наук Ботанического института им. В.Л. Комарова, а также «Геномные технологии и клеточная биология» ГНУ ВНИИ Сельскохозяйственной микробиологии Отделения земледелия Россельхозакадемии (государственный контракт Министерства образования и науки 16.552.11.7047).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 1 статья в международном рецензируемом научном журнале. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах текста, иллюстрирована 41 рисунком (в Приложении) и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (243 источника, в т.ч. 222 на иностранных языках).
