Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Биологические эффекты облучения организмов в сублетальных дозах 12
1.2. Радиочувствительность мембран 18
1.2.1. Гиперрадиочувствительность биомембран при действии малых доз ионизирующей радиации 18
1.2.2. Мембранный механизм индукции радиоадаптивного ответа... 21
1.2.3. Биомембраны в осуществлении «эффекта свидетеля» 23
1.2.4. Неспецифическая реакция биомембран на облучение в малой дозе 24
1.3. Радиационные нарушения структурного состояния биомембран 25
1.3.1. Радиационно-индуцированные изменения состояния липидных компонентов 25
1.3.2. Изменения белков биомембран в условиях воздействия ионизирующей радиации в малых дозах 29
1.4. Функциональные особенности биомембран их изменение при воздействии ионизирующих излучений в малой дозе 33
1.4.1. Влияние низкодозового ионизирующего излучения на состояние барьера ионной проницаемости биомембран 33
1.4.2. Активность мембраносвязанных ферментов при действии малых доз ионизирующей радиации 36
1.5. Ключевой фермент плазматических мембран клеток высших растений - Н+-АТФаза 39
1.5.1. Молекулярная структура и свойства Н+-АТФазы плазматических мембран клеток высших растений 39
1.5.2. Функциональная роль Н+-АТФазы плазматических мембран клеток высших растений 43
1.5.3. Регуляция работы Н+-АТФазы плазматических мембран клеток высших растений 51
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 55
2.1. Объект исследования 55
2.2. Методы исследования 55
2.2.1. Выделение фракции, обогащенной плазматическими мембранами, методом дифференциального ультрацентрифугирования 55
2.2.2. Определение гидролитической активности Н+-АТФазы по методу Лоури - Лопец 58
2.2.3. Определение белка в пробе по методу Лоури 59
2.2.4. Оценка степени чистоты полученной микросомальной фракции плазматических мембран 60
2.2.5. Оценка градиента рН в везикулярной фракции плазматических мембран с помощью 9-аминоакридина 61
2.2.6. Определение содержания малонового диальдегида в микросомальной фракции плазматических мембран 62
2.2.7. Регистрация интенсивности флуоресценции оснований Шиффа в микросомальной фракции плазматических мембран 63
2.2.8. Обработка фракции изолированных плазматических мембран ионизирующим излучением 63
2.2.9. Статистическая обработка результатов 63
ГЛАВА 3. Изменение непроницаемости и содержания продуктов перекисного окисления липидов в везикулах плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации 65
3.1. Модификация Непроницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации 66
3.2. Регистрация изменения продуктов перекисного окисления липидов в результате радиационного воздействия 75
3.2.1. Содержание малонового диальдегида в везикулах плазматических мембран в норме и при облучении 75
3.2.2. Определение содержания оснований Шиффа в микросомальной фракции плазматических мембран в норме и при облучении 78
ГЛАВА 4. Действие малых доз ионизирующего излучения на функционирование Н+-атфазы плазматических мембран клеток высших растений 83
4.1. Изменение гидролитической активности Н+-АТФазы при облучении. 84
4.2. Кинетические параметры работы фермента в норме и при облучении 90
4.3. Модифицирующее влияние ионов Са на гидролитическую активность Н+-АТФазы в условиях воздействия ионизирующей радиации 93
Заключение 99
Выводы 103
Список цитированной литературы 104
- Изменения белков биомембран в условиях воздействия ионизирующей радиации в малых дозах
- Выделение фракции, обогащенной плазматическими мембранами, методом дифференциального ультрацентрифугирования
- Модификация Непроницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации
- Модифицирующее влияние ионов Са на гидролитическую активность Н+-АТФазы в условиях воздействия ионизирующей радиации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее изучаемых вопросов в радиационной биологии является природа структурно-функциональных изменений, которые происходят в мембране под действием ионизирующего излучения. Результаты исследований, полученные в последние годы, весьма определенно свидетельствуют о том, что облучение в малых дозах вызывает многочисленные структурные перестройки в клеточных мембранах, сохраняющиеся длительное время после облучения и приводящие к изменению функциональной активности клеток (Бурлакова, 1994; Кузин, 1995; Burlakova, 2000; Кудряшов, 2004). В структурно-метаболической теории А. М. Кузина (1986), а также в концепции «мембранного механизма биологического действия малых доз» Л. X. Эйдуса (2001) приводятся доказательства, что первичной мишенью действия радиации в малых дозах является не ДНК, а именно клеточные мембраны, и в этом состоит принципиальное отличие эффектов, вызываемых облучением в малых дозах по сравнению с большими. Следует отметить, что эксперименты по изучению действия ионизирующей радиации в малых дозах до сих пор в основном проводились на объектах животного происхождения. Практически отсутствуют работы в этом направлении, выполненные на растительных объектах, которым обычно отводится роль «переносчиков» радионуклидов по пищевым цепям. Между тем радионуклиды, поступая в растения из почвы и накапливаясь в их тканях, оказывают влияние излучением в малых дозах на многие процессы, которые происходят непосредственно в растительном организме.
Ионизирующая радиация в летальных и сублетальных дозах вызывает увеличение в мембране окислительных процессов, в частности усиление процессов перекисного окисления липидов, в результате которого происходит окислительная деградация мембранных структур (Кудряшов, 2004). Специфика нарушения окислительно-восстановительного равновесия при действии малых доз ионизирующей радиации пока не представляется однозначной.
Важнейшим показателем, от которого зависит нормальное функционирование клетки, является состояние барьера ионной проницаемости плазмалеммы Изменение проницаемости мембраны тесно связано с её структурным состоянием (Владимиров, 2002). На настоящий момент недостаточно изученными остаются молекулярные механизмы биологического действия радиации в малых дозах на проницаемость мембраны и системы активного транспорта ионов в клетках высших растений. Известно, что на роль такой транспортной системы в растительных клетках претендует протонный насос, представленный Н -АТФазой (Palmgren, 1991; Morsomme, Boutry, 2000). Большинство клеток растений характеризуется низкой проницаемостью для протона по сравнению с другими катионами, что определяет в значительной мере эффективность работы протонной АТФазы и поддержание рН-стата на оптимальном уровне (Воробьев, 1988; Опритов и др., 1991).
В этой связи вполне правомерно ожидать, что под действием ионизирующей радиации в малой дозе в плазматической мембране (ИМ) растительной клетки будут активироваться окислительные процессы, которые неизбежно отразятся на структурно-функциональном состоянии мембраны.
Исходя из этого, было проведено исследование влияния ионизирующей радиации при облучении малыми дозами на структурное состояние плазматических мембран, связанное с ним изменение барьера протонной проницаемости и активность ключевой транспортной системы плазматических мембран Н -АТФазы в везикулах ИМ клеток высшего растения.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении изменения ряда основных структурно-функциональных показателей плазматических мембран клеток высшего растения {Cucurbita реро) в результате воздействия малых доз ионизирующей радиации.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Анализ нарушения Н -проницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации.
Регистрация изменения содержания продуктов перекисного окисления липидов в результате радиационного воздействия.
Анализ действия низкодозового ионизирующего излучения на гидролитическую активность Н -АТФазы плазматических мембран.
Определение характера изменений кинетических параметров работы фермента в норме и при облучении.
Изучение модифицирующего влияния ионов Са на гидролитическую активность Н-АТФазы в условиях воздействия ионизирующей радиации.
Все исследования проводились на изолированной фракции везикул плазматических
мембран, что позволило разделить изучение пассивного транспорта ионов Н и
функционирование системы активного переноса протона через мембрану, и исключить при
этом эффекты действия малых доз радиации немембранной природы.
Основные положения, выносимые на защиту:
S Под действием ионизирующей радиации в малой дозе (0,5 мГр/час) происходит
активация процессов липопероксидации ПМ в первые минуты облучения. S Значительные изменения в структуре ПМ в связи с активацией ПОЛ в результате низкодозового облучения приводят к возрастанию протонной проницаемости ПМ, и увеличению входящего потока ионов Н в клетку. S Закисление цитозоля в результате «протонной вспышки», а также изменения в структуре ПМ приводят к увеличению гидролитической активности Н -АТФазы -ключевой транспортной системы ПМ растительной клетки. S Выявленный феномен стимуляции активности Н-АТФазы может быть связан как с изменением конформации фермента под действием облучения, так и нарушением регуляторного контроля за его работой. S В результате воздействия ионизирующей радиации в малой дозе происходит активация протонной сигнальной системы, вследствие чего можно ожидать изменение функционального статуса растительной клетки в целом. Научная новизна. Впервые обнаружено, что в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации происходит быстрое и значительной изменение протонной проницаемости плазматических мембран клеток высшего растения. Показано, что даже незначительная по величине доза облучения вызывает резкое возрастание Н -проводимости мембраны. Уже в первые минуты облучения происходит быстрая потеря протонного градиента везикул, а при последующих сроках облучения скорость пассивного транспорта ионов Н замедляется.
Получены новые данные, согласно которым в результате воздействия ионизирующего излучения происходит активация процессов липопероксидации в ПМ растительных клеток, о чем свидетельствует повышение содержания продуктов ПОЛ - МДА и оснований Шиффа. Изменения в структуре плазмалеммы, в результате активации процессов ПОЛ происходят в первые минуты при облучении малыми дозами и могут лежать в основе нарушения проницаемости мембраны для протона.
Впервые исследован характер изменения активности транспортной системы ПМ растительных клеток Н -АТФазы в условиях низкодозового ионизирующего излучения. Выявлен феномен активирующего действия малых доз ионизирующего излучения на работу
фермента. Показано, что модулирующее влияние малых доз ионизирующего излучения на Н -АТФазу мембранных везикул проявляется в том, что ее гидролитическая активность возрастает. Прирост активности зависит от времени облучения.
Установлено, что в результате воздействия ионизирующей радиации происходит изменение кинетических и регуляторных свойств Н -АТФазы. Показано возрастание регуляторного эффекта ионов кальция в отношении данной ферментной системы под действием малых доз ионизирующего излучения. Изменение кинетических параметров работы фермента: скорости распада фермент-субстратного комплекса и сродства фермента к субстрату может свидетельствовать о том, что в результате воздействия радиации в малой дозе произошли структурные перестройки активного центра ІҐ-АТФазьі.
На основании полученных данных сделан вывод об активации протонной сигнальной системы в растительной клетке в результате воздействия ионизирующей радиации в малой дозе.
Сформулировано и обосновано положение о высокой чувствительности структурного состояния, а также систем пассивного и активного транспорта ПМ клеток высшего растения к низкодозовым радиационным воздействиям.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты изучения структурно-функциональных изменений ПМ при действии малых доз ионизирующей радиации имеют важное значение для понимания различия в особенностях воздействия малых и больших доз ионизирующего излучения. Они вносят вклад в расшифровку мембранного механизма действия малых доз ионизирующей радиации. В условиях повышения уровня радиоактивного загрязнения природных экосистем все живые организмы подвергаются дополнительному воздействию малых доз ионизирующего излучения, поэтому очень важным представляется выяснение процессов, происходящих при этом в растительной клетке.
Наблюдаемый феномен активации работы фермента Н -АТФазы, а также нарушение Н -проницаемости и активация процессов липопероксидации в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации, свидетельствует о необходимости с осторожностью относиться к применению метода радиационной стимуляции в сельском хозяйстве. Любое вмешательство в тонко отрегулированную систему поддержания окислительно-восстановительного равновесия, а также в процессы пассивного и активного транспорта ионов через мембрану, может иметь весьма существенные функциональные последствия для растительной клетки и растения в целом. Основные результаты работы могут быть включены в соответствующие разделы спецкурсов и лекций общего курса радиобиологии и физиологии растений.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на VI и IX Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2001, 2004), III сессии школы-семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), III международной междисциплинарной конференции «НБИТТ-21» (Петрозаводск, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения (2 главы), заключения, выводов и списка литературы (196 работ, в том числе 64 иностранных). Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков и 3 таблицы.
Изменения белков биомембран в условиях воздействия ионизирующей радиации в малых дозах
Молекулы белка, являясь гидрофильными коллоидами, в основном находятся в клетке в окружении воды, что обусловливает легкость реакций продуктов радиолиза воды с клеточными белками. Поглощение кванта энергии белковой макромолекулой или реакции с продуктами радиолиза воды, приводят к образованию свободного радикала, наиболее вероятно в месте локализации атома серы (цистина и цистеина). Под влиянием облучения наступают следующие нарушения белковой структуры: разрывы водородных связей, разрывы дисульфидных мостиков, разрывы и сшивки пептидных цепей, окисление сульфгидрильных групп, конформационные изменения вторичной и третичной структуры (Кузин, 1979; Фоменко, Акоев, 1982; Кудряшов, 2004).
Установлено, что после облучения in vitro эритроцитов или препаратов мембран уменьшается количество SH-групп суммарных мембранных белков, что связано с образованием дисульфидных связей. На мембранах эритроцитов с использованием флуоресцентного зонда (ANS) и специфических SH-блокаторов, было показано что радиационный эффект в БМ инициируется окислением мембранных SH-групп (Palecz, Leyko 1983; Yoneietal., 1984).
В пострадиационный период меняется также доступность белковых аминогрупп для их мечения тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Этот реагент связывается с аминогруппами белков внешней поверхности мембраны. Снижение количества связываемой мембранными белками метки заметно снижалось при облучении, что может быть связано с усилением экранировки белков расположенным над ними олигосахаридным слоем.
Из других изменений, вызываемых радиацией, следует отметить увеличение доступности белков внешней поверхности эритроцитов для протеолитических ферментов (Фоменко, Акоев, 1982). Возникшие при облучении дефекты в структуре белковой молекулы приводят к изменению её конформации, лабильности, гидрофильности, что в свою очередь проявляется в изменении биологически значимых свойств белка, таких как энзиматическая активность, рецепторные свойства и др.
Принимая во внимание существующие представления о радиационно-индуцированных изменениях белков и липидов мембран, можно выделить следующие этапы формирования повреждений в мембране при облучении (Рис. 2). Данная схема развития событий при радиационном воздействии на мембраны клеток животных была предложена ещё в 1982 году и учитывает варианты радиационного поражения, как в присутствии кислорода, так и в условиях аноксии.
При облучении на первом этапе в мембранных молекулах появляются модифицированные группы, связанные с гидроксилированием, декарбоксилированием, дезаминированием при облучении в отсутствии кислорода и окислением SH-групп, разрывом пептидных связей в белках и окислением жирных кислот, разрывом эфирных связей в фосфолипидах при облучении в присутствии кислорода (Кузин, 1986; Коломийцева, 1989; Поливода, 1990; Мазурик, 1999).
Второй этап включает появление локальных перестроенных участков в молекулах, вовлечение в этот процесс смежных молекул, нарушение взаимодействия между молекулами белков и липидов. Следует также отметить, что благодаря наличию сложных взаимодействий в мембране между молекулами может происходить обратный процесс - усиление изменений в модифицированных радиацией местах (Фоменко, Акоев, 1982). На третьем этапе происходит активация процессов ПОЛ, причиной которой могут служить свободные радикалы, индуцированные радиацией и структурные перестройки мембран. Роль ПОЛ в поражении мембран хорошо известна (Владимиров, Арчаков, 1972; Бурлакова, Храпова, 1975; Поливода и др., 1990).
Выделение фракции, обогащенной плазматическими мембранами, методом дифференциального ультрацентрифугирования
Функционирование НҐ-АТФазьі находится в клетке под контролем многих факторов. Активность фермента in vivo зависит от величины мембранного потенциала и внутриклеточного рН (Опритов и др., 1997; Sze et al., 1999; Portillo, 2000). Существует ряд исследований, посвященных выяснению роли мембранного потенциала в регуляции работы Н+-АТФазы ПМ (Blatt, 1987; Slayman, 1987; Треушников и др., 1994; Briskin et al., 1996; Опритов и др., 1997). При исследовании влияния индуцированного валиномицином К+-диффузионного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы было показано, что повышение ED с нуля до 41 и 87 мВ стимулировало гидролиз АТФ, что может быть связано с изменением конформационной подвижности фермента. Следует также отметить существование модулирующего влияния Ер, формируемого в ходе работы Н+-АТФазы на активность фермента по принципу обратной связи (Опритов и др., 1997).
Н+-АТФаза, являясь интегральным белком ПМ, обнаруживает высокую чувствительность к изменениям фазово-структурного состояния липидного матрикса мембраны. Результаты экспериментов, в которых использовалось охлаждение, показали тесную корреляцию изменения вязкости липидного матрикса и гидролитической активности фермента. Постепенное умеренное охлаждение (от 30 до 10С) вызывает уменьшение жидкостности липидов и приводит к снижению активности Н+-АТФазы (Опритов и др., 1992). Кроме того существуют данные свидетельствующие о регуляторном влиянии перекисного окисления липидов на активность Н+-АТФазы в условиях стресса. Установлено, что при тепловом шоке происходит активация процессов ПОЛ и также увеличивается активность Н -АТФазы. Предварительная обработка растений синтетическим антиоксидантом ионолом приводит к угнетению развития процессов ПОЛ и также в значительной степени снимает активацию Н+-АТФазы. Полученные данные свидетельствуют о том, что интенсификация ПОЛ может непосредственно или опосредованно влиять на активность Н+-АТФазы в условиях стресса (Веселов и др., 2002).
В настоящее время считается подтвержденным тот факт, что С-терминальный домен Н+-АТФазы функционирует как автоингибиторный домен (Palmgren et al., 1991). Изменение активности Н+-АТФазы ПМ растительных клеток наблюдается при частичном протеолизе, полном удалении или точечных мутациях С-терминальной области, при фосфорилировании и связывании с ней эффекторных молекул. Существует гипотеза, что С-терминальный домен может взаимодействовать с реакционным центром фермента, снижая его активность. Удаление С-концевого сегмента путём обработки плазмалеммы трипсином приводит к активации как гидролиза АТФ, так и транспорта протонов (Palmgren et al., 1990). Существует, по-видимому, несколько различных механизмов фосфорилирования фермента. Один вид фосфорилирования имеет место в реакционном цикле, такое фосфорилирование вызывает активацию фермента. Другое, описанное выше, фосфорилирование по С-концевому регуляторному сегменту угнетает ферментативную активность.
Ионы Са2+ являются непосредственными участниками и регуляторами большого числа процессов, протекающих в растительной клетке - от ионного транспорта, до генной экспрессии (Левицкий, 1990; Muir et al., 1997; Trewavas, 1999; Опритов и др., 1991). По имеющимся данным, увеличение концентрации Са (кальциевый сигнал) в цитозоле растительных клеток при возбуждении под влиянием раздражающих стимулов приводит к заметному угнетению как гидролитической, так и транспортной активности Н+-АТФазы плазматической мембраны. Исследования влияния ионов Са на работу Н -АТФазы, свидетельствуют об ингибировании активности этого фермента Са2+-стимулируемым фосфорилированием (Lino, 1998; Qiu, Su, 1998; De Nisi, 1999). Было показано, что Са2+-стимулируемое фосфорилирование Н+-АТФазы (вероятно связанное с работой Са -зависимой протеинкиназы (CDPK)) ингибирует ее активность непосредственно или через различные белки, влияющие на работу Н+-АТФазы, например белок 14-3-3 (Aitken, 1996; Lino et al., 1998; De Nisi et al., 1999).
Обнаруженный в цитоплазме растительных клеток белок 14-3-3, участвует в регуляции многих процессов протекающих в клетке, может связываться с С-терминальным доменом Н+-АТФазы, образуя активный комплекс фермент-белок. В таком состоянии фермент способен связывать с высокой специфичностью фузикокцин, который стабилизирует данный комплекс (Sze et al., 1999; Morsomme, Boutry, 2000; Portillo, 2000). В условиях абиотического стресса (к примеру, осмотического или температурного шока) в плазматических мембранах растительных клеток возрастает количество комплексов Н+-АТФазы с димером белков 14-3-3, что сопровождается возрастанием активности Н+-насоса (Челышева, 2001; Шанько, Бабаков, 1-Х 2002). Ионы Са могут оказывать регуляторное влияние на работу фермента, связываясь непосредственно с молекулой 14-3-3 белка (Morsomme, Boutry, 2000).
Из вышеизложенного материала следует, что протонный насос, представленный Н+-АТФазой плазматических мембран клеток высших растений является физиологически важной, тонко регулируемой транспортной системой растительной клетки. Активность этой ферментной системы in vivo находится под контролем многих факторов, включая ионы Са . В то же время известно, что регуляторные связи могут быть подвергнуты существенной модуляции с помощью физико-химического воздействия на биологическую систему, в той или иной мере нарушающего ее нативные свойства.
Таким образом, биологический эффект излучений малых величин и мощностей проявляется в узких интервалах доз и имеет нелинейный, немонотонный характер, отличаясь от действия больших доз не только количественно, но и качественно. Это касается как эффектов, вызываемых действием малых доз ионизирующей радиации на живые организмы, так и механизмов их модифицирующего действия, которые не могут быть объяснены с общепринятых в настоящее время позиций и требуют разработки новых концепций. Анализ существующих данных об эффектах облучения в малых дозах позволил прийти к выводу, что в проявлении системного ответа на облучение биологические мембраны играют роль чувствительной радиобиологической системы. В последнее время активно исследуется действие облучения в малых дозах на транспорт различных ионов в клетках млекопитающих. Существует очень мало работ в этом направлении, выполненных на растительных объектах, поэтому особый интерес представляют исследования состояния плазматических мембран и их проницаемости, а также изучение работы ключевого фермента плазматических мембран растительных клеток - Н+-АТФазы в условиях воздействия малых доз ионизирующей радиации.
Модификация Непроницаемости везикул плазматических мембран клеток растений при действии малых доз ионизирующей радиации
Данные о высокой радиочувствительности биомембран и их ранней реакции на облучение начали появляться уже вскоре после получения первых электронно-микроскопических снимков клетки. Ещё в 50-х годах прошлого столетия высказывались предположения, что пусковой механизм, ведущий к лучевому поражению клетки, сводится к нарушению структурно-функциональных свойств биомембран, главным из которых является возрастание проницаемости и окислительное повреждение структуры мембран. В развиваемой концепции «мембранного механизма биологического действия малых доз» Л. X. Эйдус (2001) пришел к выводу, что первичной мишенью действия радиации в малых дозах является не ДНК, а клеточные мембраны, и в этом состоит принципиальное отличие эффектов, вызываемых облучением в малых дозах по сравнению с большими.
Существуют сведения, подтверждающие, что нарушения транспортных функций плазматических мембран могут наступать уже в первые секунды и минуты после облучения. В современной литературе изменение проницаемости мембраны относят к начальным физико-химическим эффектам облучения. Изменение проницаемости мембраны тесно связано с её структурным состоянием, ни у кого из исследователей-радиобиологов не вызывает сомнения тот факт, что ионизирующая радиация в летальных и сублетальных дозах вызывает увеличение в мембране окислительных процессов, в частности усиление процессов перекисного окисления липидов, в результате которого происходит окислительная деградация мембранных структур. Специфика нарушения окислительно-восстановительного равновесия при действии малых доз ионизирующей радиации пока не представляется однозначной. В изложенном ниже материале приведены данные наших исследований по влиянию малых доз ионизирующей радиации на процессы пассивного транспорта протона, в связи с нарушением структурной организации мембраны.
Известно, что поверхностная (плазматическая) мембрана растительной клетки, выполняя барьерную функцию, является весьма чувствительной мишенью для внешних воздействий, и любые её повреждения могут иметь существенные последствия и оказывать влияние на жизнедеятельность всей клетки. Важнейшим показателем, от которого зависит нормальное функционирование клетки, является состояние барьера ионной проницаемости плазмалеммы. В современной литературе активно обсуждается действие однократного и хронического облучения в малых дозах на транспорт различных ионов в клетках млекопитающих (Дворецкий и др., 2002; Мирзоев и др., 2002). Практически отсутствуют работы в этом направлении, выполненные на растительных объектах. Как известно, большинство клеток растений характеризуется низкой проницаемостью для протона по сравнению с другими катионами, что определяет в значительной мере эффективность работы локализованной в плазматической мембране протонной АТФазы, и поддержание величины внутриклеточного рН на оптимальном уровне (Воробьев, 1988, Опритов и др., 1991). Исходя из этого нами было проведено исследование влияния ионизирующей радиации, при однократном облучении малыми дозами, на проницаемость ПМ растительных клеток для протонов. Для характеристики реакции плазматических мембран на облучение большой интерес представляют исследования радиочувствительности упрощенных мембранных структур - везикулярных препаратов. Такие препараты позволяют сохранить барьерные свойства мембраны и смоделировать события, происходящие в мембране при облучении. Исследования, проводимые на везикулярных препаратах, позволяют изучить отдельные процессы, происходящие при облучении на уровне плазмалеммы, исключив при этом метаболическую составляющую эффектов. Принимая во внимание существующие литературные данные, можно предположить, что пострадиационные перестройки мембран не обязательно обусловлены нарушением внутриклеточных процессов. В облученных препаратах мембран происходят те же изменения (активация ПОЛ, изменение подвижности липидной и белковой фаз, нарушение работы мембраносвязанных ферментов и т.п.), что и в мембранах интактных клеток после облучения (Фоменко, Акоев, 1982).
На рис. 8 приведены записи кинетических кривых изменения интенсивности флуоресценции (1фл) зонда 9-аминоакридина (9-АА) в везикулах ПМ, подвергнутых облучению в течение 5, 10, 20 и 40 мин стандартным контрольным источником Р-излучения (90Sr - 90Y), мощность поглощенной дозы 0,5 мГр/час. Как видно из рисунка 8 (А), внесение в среду необлученной фракции ПМ сопровождается быстрым увеличением интенсивности флуоресценции 9-АА, которое обусловлено поступлением зонда в везикулы. При завершении процесса накопления зонда в везикулах 1фЛ зонда становится стабильной и дальнейшего изменения ее уровня не наблюдается. Последующее добавление протонофора карбонилцианид-(т)-хлорфенилгидразона (КЦХФГ) вызывает тушение флуоресценции зонда, что указывает на наличие градиента рН на мембране везикул и его последующую диссипацию.
Модифицирующее влияние ионов Са на гидролитическую активность Н+-АТФазы в условиях воздействия ионизирующей радиации
Итак, под действием ионизирующей радиации в малой дозе плазматическая мембрана растительных клеток претерпевает значительные структурно-функциональные перестройки. Ионизирующие излучения вызывают окислительное повреждение липидной структуры ПМ и нарушение её барьерных функций.
Анализируя изменение пассивного транспорта протона через мембрану, можно говорить об увеличении протонной проницаемости ПМ, происходящей в первые минуты после облучения. Наиболее быстрая потеря градиента протона везикул происходит после 5-ти минутного облучения, а при последующих сроках облучения скорость пассивного транспорта ионов Н+ замедляется. В наибольшей степени барьер пассивной протонной проницаемости мембраны везикул оказывается нарушенным при 20 и 40-минутном облучении, вследствие значительной потери градиента Н+ по сравнению с исходным.
В норме ПМ растительных клеток обладает весьма низкой проницаемостью для протона, что является необходимым фактором для поддержания внутриклеточного рН, от которого зависит функциональный статус многих метаболических процессов, протекающих в растительной клетке. Увеличение протонной проницаемости ПМ, в результате действия малых доз ионизирующей радиации может иметь весьма существенные последствия для метаболизма растительной клетки в целом. Изменение пассивной проницаемости ПМ, происходящее в первые минуты облучения может быть рассмотрено в качестве пускового механизма в проявлении лучевого поражения при действии облучений в малых дозах. В первую очередь, нарушение барьера проницаемости ПМ для протона может быть связано со структурными перестройками липидного бислоя, вызванными усилением окислительных процессов под действием облучения.
Зарегистрированное увеличение содержания продуктов ПОЛ, таких как МДА и основания Шиффа свидетельствуют об активации в мембране процессов липопероксидации в результате радиационного воздействия.
Значительное увеличение содержания продуктов ПОЛ при небольшой временной экспозиции облучения свидетельствует о быстром нарушении окислительно-восстановительного баланса плазмалеммы в условиях повреждающего действия ионизирующей радиации и подтверждает предположение о более высокой чувствительности окислительных процессов к действию низкодозового облучения, чем механизмов репарации, систем антиоксидантной защиты. Вызванное облучением увеличение Непроницаемости везикул ПМ в результате активации процессов ПОЛ приводит к модификации работы протонного насоса, представленного Н+-АТФазой, который обеспечивает поддержание Н+-градиента на плазмалемме. Кроме того, зарегистрированное увеличение интенсивности процессов липопероксидации также оказывает существенное воздействие на работу Н+-АТФазы, которая являясь интегральным белком зависима от липидного окружения в мембране. Результаты исследования работы фермента в условиях воздействиях облучения свидетельствуют о высокой чувствительности Н+-АТФазы, как ключевого фермента плазматических мембран растительной клетки, к воздействию радиации даже в небольшой дозе. Показано, что действие излучения приводит к существенному росту гидролитической активности Н+ АТФазы, причем прирост активности имеет немонотонный характер и зависит от времени облучения. Изучение кинетики ферментативной реакции показало, что облучение плазматических мембран в малой дозе, вероятно, вызывает структурные изменения активного центра Н -АТФазы, сопровождающиеся увеличением скорости распада фермент-субстратного комплекса, но не приводит к значительному изменению сродства фермента к субстрату. В качестве одной из вероятных причин феномена стимулирующего влияния, излучения в малых дозах на активность Н+ АТФазы, является нарушение регуляторного контроля за её работой. Предварительное облучение везикул плазматических мембран малой дозой радиации приводит к увеличению ингибирующего эффекта Са2+ на гидролитическую активность Н+-АТФазы. В условиях воздействия ионизирующего излучения вероятно подключаются ранее не задействованные, дополнительные механизмы ингибирующего влияния ионов Са2+ на работу фермента. Таким образом, суммируя полученные данные, схема событий развивающихся в условиях воздействия низкодозового ионизирующего излучения на плазмалемме растительной клетке представляется нам следующей (Рис. 16). Плазматическая мембрана является весьма чувствительной мишенью действия ионизирующего излучения в малой дозе. В результате такого воздействия происходят изменения как в липидной, так и в белковой компоненте мембраны. Вызванная облучением активация ПОЛ приводит к нарушению протонной проницаемости ПМ, а также изменению вязкости и состава фосфолипидов. Увеличение пассивного транспорта протонов вызывает активацию протонного насоса, представленного Н+ АТФазой. Кроме того, активность данной ферментной системы зависит от вязкости и состава липидного окружения. Непосредственное действие ионизирующей радиации на белковую молекулу фермента способно приводить к изменению конформации активного центра фермента, что также неизбежно скажется на его чувствительности к регуляторным факторам и как следствие приведет к изменению активности Н+-АТФазы. В результате изучения событий, происходящих под действием облучения в малой дозе можно говорить об активации протонной сигнальной системы, которая является одной из ранних реакций растительных клеток на внешние раздражающие стимулы (Тарчевский, 2002). В рамках активации протонной сигнальной можно ожидать изменения метаболизма растительной клетки в целом.
