Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Электрические сигналы у высших растений 12
1.1.1. Общая характеристика биоэлектрогенеза высших растений 12
1.1.2. Потенциал действия 14
1.1.3. Вариабельный потенциал 21
1.2. Электрические сигналы как стрессовые сигналы у растений 24
1.2.1. Стрессовые сигналы у растений и их функциональная роль 24
1.2.2. Участие электрических сигналов в качестве стрессовых сигналов у растений 30
1.2.3. Механизмы влияния электрических сигналов на функциональное состояние растений
2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Объект исследования 42
2.2, Нанесение локальных раздражений 42
2 3. Электрофизиологические измерения 42
2.3.1. Измерение электрических сигналов 43
2.3.2. Электрофизиологический анализ холодоустойчивости 44
2.4. Измерение замедленной флуоресценции 46
2.4.1. Исследование фотосинтетической активности по параметрам замедленной флуоресценции 46
2.4.2. Определения холодоустойчивости растений по параметрам замедленной флуоресценции 47
2.5. Определение содержания АТФ 49
2.5.1. Определение выхода АТФ из семядольных листьев 50
2.5.2. Определение содержания АТФ во флоэмном эксудате 51
2.6. Оценка поглощения Са семядолями методом меченых атомов 52
2.7. Методы введения экзогенной АТФ (АДФ), диурона и ЭГТА 52
2.8. Методы обработки результатов 53
2.8.1. Статистическая обработка результатов 53
2.8.2. Методы численного моделирования 54
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Дистанционное влияние локальных раздражений на холодоустойчивость растений ее
3.1.1. Дистанционное влияние локальных раздражений на холодоустойчивость проростков тыквы
3.1.2. Дистанционное влияние локальных раздражений на холодоустойчивость листьев герани
3.2. Исследование электрических сигналов, вызванных локальными раздражениями
3.2.1. Исследование электрических сигналов у проростков тыквы 59
3.2.2. Исследование электрических сигналов у листьев герани 64
3.3. Связь вызванного электрическими сигналами повышения содер жания АТФ с холодоустойчивостью
3.3.1. Влияние электрических сигналов на содержание АТФ во флоэмном эксудате проростков тыквы
3.3.2. Влияние экзогенных АТФ и АДФ на холодоустойчивость проростков тыквы 66
3.3.3. Особенности повышения холодоустойчивости в условиях затемнения после охлаждения
3.3.4. Влияние экзогенных АТФ и АДФ на холодоустойчивость листьев герани
3.3.5. Теоретический анализ механизмов влияния АТФ на устойчивость растительного объекта к действию стресс-факторов
3.4. Исследование связи возрастания содержания АТФ в растении с фотосинтетической активностью
3.4.1. Связь вызванного электрическими сигналами повышения холодоустойчивости с фотосинтетической активностью
3.4.2. Влияние электрических сигналов на выход АТФ из семядолей 87
3.4.3. Влияние электрических сигналов на параметры замедленной флуоресценции у проростков тыквы 91
3.4.4. Влияние электрических сигналов на параметры замедленной 96 флуоресценции у листьев герани
3.4.5. Теоретический анализ вызванных электрическими сигналами изменений фотосинтетической активности
3.5. Участие Са в развитии индуцированных электрическими сигналами функциональных ответов
3.6. Предполагаемая схема участия электрических сигналов, АТФ, фотосинтеза и Са + в развитии повышения холодоустойчивости растений
Заключение 122
Выводы 125
Список литературы 127
- Участие электрических сигналов в качестве стрессовых сигналов у растений
- Определения холодоустойчивости растений по параметрам замедленной флуоресценции
- Связь вызванного электрическими сигналами повышения содер жания АТФ с холодоустойчивостью
- Влияние электрических сигналов на параметры замедленной флуоресценции у проростков тыквы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Необходимым условием существования организма под действием разнообразных и меняющихся во времени факторов окружающей среды является наличие коммуникационных систем, обеспечивающих его функционирование как единого целого. У животных в качестве таких систем выступают в первую очередь нервная и гормональная системы, которые различны по времени, необходимому для формирования ответа. Так ответ нервной системы может происходить за интервалы времени порядка сек и меньше, а гормональной - порядка мин и часов. Вследствие этого первая обеспечивает ответ на более быстрые, а вторая - на плавные изменения условий среды.
В настоящее время не вызывает сомнений существование гормональной регуляции у растений (Медведев, 2004), однако, распространение фито-гормонов является достаточно медленным процессом, например, для ИУК его скорость составляет около 4 мм/час (Опритов и др., 1991). С другой стороны из литературы известно много примеров когда влияние локального раздражения на функциональное состояние целого растения или его удаленных от зоны раздражения органов может развиваться намного быстрее. Ярким примером этого являются локомоторные растения, ответ которых может формироваться за время порядка сек (Опритов и др., 1991). Достаточно быстрые функциональные изменения (порядка мин) могут развиваться и у нелокомоторных растений (Беликов и др., 1962; Гунар, Синюхин, 1963; Herde et al., 1999а; Koziolek et al., 2004 и др.). Отсюда можно заключить, что и у растительных организмов существуют коммуникационные системы, обеспечивающие генерацию и распространение стрессовых сигналов, которые способны вызывать дистанционные изменения функционального состояния. В то же время, хорошо известно, что и локомоторные, и нелокомоторные растения способны к генерации и распространению электрических сигналов (ЭС) (Опритов и др., 1991), скорость которых может варьировать от мм/сек до см/сек (Синюхин, 1964; Синюхин, Горчаков, 1966, 1968; Lautner et al., 2005). Суще- ствует гипотеза, что именно распространяющиеся ЭС играют ключевую роль в быстром развитии дистанционного функционального ответа при действии локального раздражения (Ретивин, Опритов, 1993; Опритов, 1998), являясь аналогом нервных импульсов у животных. Это предположение согласуется с рядом экспериментальных работ (Fromm, Fei, 1998; Herde et al., 1998; Herde et al., 1999b; Lautner et al., 2005 и др.), однако имеются и другие гипотезы. Так в некоторых работах природу стрессовых сигналов связывают с колебаниями градиента электрического поля, гидравлическими волнами или изменением газового состава в воздушном пространстве листа (Полевой и др., 1997; Bowles, 1998; Stahlberg et al., 2001). Таким образом, вопрос об участии электрических сигналов в индукции дистанционного ответа растительного организма остается актуальным и требует дальнейшего изучения.
Весьма актуальной является и проблема биологического смысла вызванных стрессовыми сигналами изменений функционального состояния у нелокомоторных растений. Так известно, что локальные стрессирующие воздействия могут (возможно, при участии ЭС) влиять на экспрессию генов (Herde et al., 1996, 1999а; Stankovic, Davies, 1996; Davies et al., 1997), поглощение и транспорт ряда веществ (Опритов и др., 1972; Опритов, Крауз, 1974; Опритов, 1982; Fromm, Bauer, 1994), дыхание (Гунар, Синюхин, 1963; Filek, Koscielniak, 1997), содержание АТФ во флоэмном эксудате (Ретивин и др., 1999Ъ) транспирацию и фотосинтетические процессы (Fromm, Eshrich, 1993; Fromm, Fei, 1998) и т.д. При этом механизмы реализации такого влияния остаются в настоящее время слабо изученными. В частности (Fisahn et al., 2004) известно, что одним из ключевых звеньев в развитии вызванных стрессовыми сигналами изменений функционального состояния является, возможно, вход Са2+, однако конкретные механизмы его участия в ответе остаются недостаточно изученными. С другой стороны установлено, что на уровне целого растения локальные раздражения и связанные с ними ЭС способны увеличивать его неспецифическую устойчивость (Ретивин, Опритов, 1993; Ретивин и др., 1997, 1999а; Опритов, 1998). Отсюда можно предположить, что именно повышение устойчивости растительного организма является конечным результатом изменений многих параметров функционального состояния, однако такая гипотеза требует изучения механизмов связи между этими процессами.
Существуют предположение, что определенную роль в развитии такого ответа может играть увеличение энергообеспеченности растения, и, в частности, уровня АТФ (Ретивин и др., 1999b), Так известно, что у животных начальные этапы стресса сопряжены со снижением потребления энергии рядом систем и переводом запасных веществ в легко утилизируемые макроэргиче-ские соединения, что создает избыток доступной энергии, который затем может использоваться в процессах снижения негативного влияния стресс-фактора (Меерсон, Пшенникова, 1988). По данным некоторых авторов (Гар-кави и др., 1998) состояние повышенной энергопродукции (реакции тренировки и активации) может возникать при действии слабых и средних раздражителей и облегчать развитие стрессового ответа при последующем действии более сильных факторов. У растений возможность существования таких механизмов остается неизученной, однако с одной стороны известно, что в ходе закаливания происходит возрастание содержания макроэргов (Климов, 1997), что может играть определенную роль в повышении холодоустойчивости, а с другой - ЭС сигналы способны повышать содержание АТФ во фло-эмном эксудате (Ретивин и др., 1999b).
Таким образом, данные литературы демонстрируют способность локально действующих стресс-факторов вызывать ЭС, разнообразные функциональные ответы и повышение неспецифической устойчивости целого растения, а также его участков, лежащих за пределами зоны раздражения. Гипотетически взаимоотношения между этими процессами можно представить следующим образом: локальное раздражение — ЭС —» функциональные ответы (в том числе, увеличение энергообеспеченности растений) —* повышение неспецифической устойчивости растения
В то же время, экспериментальные исследования такой цепи и механизмов связей между звеньями являются недостаточными.
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение роли ЭС в формировании повышения устойчивости растения к действию стресс-факторов на примере холодоустойчивости.
В задачи работы входило:
Оценить способность повреждающего и неповреждающего локального раздражения вызывать дистанционное изменение холодоустойчивости растительного объекта.
Проанализировать возможность участия электрических сигналов в виде ПД и ВП в развитии ответа.
3. Исследовать влияние локальных раздражений и связанных с ними ЭС на содержание АТФ в гипокотиле.
Исследовать влияние АТФ на холодоустойчивость растений.
Исследовать связь изменений содержания АТФ с фотосинтетической активностью (ФСА).
Исследовать роль Са2+ в развитии ответа.
Научная новизна. В работе впервые предложен возможный механизм участия ЭС, АТФ, ФСА и Са в процессе повышения холодоустойчивости астений. При этом проведен сравнительный анализ влияния на холодоустойчивость повреждающих и неповреждающих локальных раздражений. Впервые показана тесная связь между фактом возникновения ЭС и развитием функционального ответа. Впервые показана двухфазная зависимость холодоустойчивости от содержания АТФ и предложена математическая модель, объясняющая эту зависимость. Впервые выявлено вызванное ЭС увеличение выхода АТФ из листа и участие Са в формировании ответа. Впервые установлена связь вызванного ЭС повышения выхода АТФ и увеличения холодоустойчивости с ФСА, В индуцированных ЭС ответах ФСА (по параметрам замедленной флуоресценции (ЗФ)) выделено три различных этапа и - на основе разработанной авторами модели кривой затухания ЗФ - предложены их возможные механизмы.
Научно-практическое значение. Показанное в работе участие ЭС, АТФ, ФСА и Са + в формировании дистанционного повышения холодоустойчивости растений после действия локального раздражителя способствует развитию представлений о механизмах интеграции растительного организма в единое целое и его адаптации к меняющимся условиям окружающей среды, что помимо научной ценности, может быть полезно для решения ряда практических вопросов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
ЭС (как ПД, так и ВП) участвуют в передаче стрессовых сигналов у растений, индуцируя возрастание холодоустойчивости их участков, лежащих за пределами зоны раздражения.
ЭС вызывают увеличение концентрации АТФ в растении, играющее одну из основных ролей в формировании повышения их холодоустойчивости.
Увеличение содержания АТФ связано с развитием изменений ФСА в листе, которые включают в себя до трех этапов с различными механизмами, а сочетание развившихся этапов зависит от типа ЭС и вида растения.
Необходимым условием развития ответа является, по-видимому, вход Са2+ в клетку.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), III Международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2003), VIII и IX Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2003, 2004), VHI Международной конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), Ш Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), VIII Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2004), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу (Пущино, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав (включая обзор литературы), заключения, выводов и списка литературы. Изложена на 153 странице, содержит 42 рисунка и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 261 работы, из них 167 на иностранных языках.
Участие электрических сигналов в качестве стрессовых сигналов у растений
Как было показано выше, у растений существуют стрессовые сигналы способные при локальном раздражении вызывать системные ответы или ответы в удаленных от зоны раздражения органах, время развития которых составляет порядка мин и, по-видимому, значительно меньше времени, необходимого для распространения фитогормонов. Вопрос о природе таких сигналов в настоящее время дискутируется, однако, основным кандидатом на их роль являются ЭС (Опритов, 1998).
В пользу такого предположения говорят в первую очередь временные характеристики, так как время необходимое для распространения ЭС в эф-фекторный орган, практически всегда много меньше, нежели время развития в нем функционального ответа. Кроме того, существует много работ, показывающих, что генерация и распространение ПД или ВП предшествует возникновению изменений функционального состояния. Такой феномен был показан для некоторых типов ответа ФСА (Koziolek et al., 2004; Lautner et al., 2005), увеличения уровня фитогормонов (Dziubinska et al., 2003), активации дыхания (Fillek, Koscielniak, 1997), экспрессии генов (Vian et al., 1996) и т.д.
Несколько меньше количество работ прямо показывающих связь генерации и распространения ЭС с развитием функциональных ответов в растении. Среди них можно, например, отметить возникновение адаптивной репо-ляризации мембранного потенциала в условиях охлаждения при генерации ПД, и ее отсутствие в тех случаях, когда ЭС в исследуемой зоне не возникали (Опритов, 1998). Другой яркий пример связи электрических сигналов функционального ответа демонстрирует работа Кожелика с соавторами (Koziolek et al., 2004). В ней, с одной стороны, показано распространение ЭС по проводящим пучкам листа, а с другой - более быстрое начало изменений ФСА в их зоне, по сравнению с ответами в удаленных от проводящих пучков участках мезофилла листа (около 90 и 150 сек., соответственно). В ряде работ также была показана связь между типом ЭС (возможно, за счет особенностей временных и амплитудных параметров деполяризации) и особенностями функционального ответа. Так, например, из литературы известно, что у некоторых видов растений ВП (более длительные по времени) способны влиять на экспрессию генов (Vian et al., 1996) или фотосинтетические процессы (Lautner et al., 2005), в то время как ПД (более кратковременные) - нет. Кроме того, имеются отдельные работы (Fromm, Eschrich, 1993) демонстрирующие связь между направлением изменения потенциала в ходе развития ЭС и направленностью ответа ФСА.
Наконец, целесообразно отметить некоторые косвенные аргументы в пользу возможности функционирования ЭС в качестве быстрых стрессовых сигналов. Так начальной фазой и ПД, и ВП является деполяризация (Опритов и др., 1991), в то же время известно, что деполяризация способна индуцировать экспрессию ряда генов (Schaller, Frasson, 2001) и связана с устойчивостью растительного организма к повреждающим факторам (например, А1) (Papernik, Kochian, 1997). Значительное влияние на различные аспекты функционального состояния способны оказывать и другие связанные с генерацией ЭС процессы, например, увеличение содержание Са2+ и ТҐ" в цитоплазме (Da-vies, 1987а, 1987b; Bulychev et al., 2001). Такие данные показывают принципиальную возможность влияния распространяющихся ЭС и связанных с ними процессов на функциональное состояние растения и пути его реализации, дополняя и объясняя имеющиеся факты участия ЭС в модификации функционального состояния растения. Таким образом, в настоящее время имеется достаточно много прямых и косвенных аргументов в пользу участия ЭС в качестве стрессовых сигналов у растений. В то же время, существуют данные, показывающие возможность наличия других путей формирования стрессовых сигналов. Это с одной стороны работы, показывающие возможность быстрого распространения стрессовых сигналов, не связанных прямо с электрическими процессами (гидравлические (Bowles, 1998; Mancuso, 1999), «броски» метаболитов по ксилеме (Malone, 1996), изменения газового состава воздушного пространства листа (Stahlberg et al., 2001), электрические градиенты (Полевой и др., 1997) и др.). С другой стороны это данные о возникновении функциональных ответов в органах, в которых прохождение ЭС не наблюдалось, например, в корнях (Полевой и др., 1997) или листьях (Ретивин и др., 1991; Лобов, 2003). По мнению некоторых авторов (Bowles, 1998) именно такие сигналы, в частности - гидравлические, и влияют на функциональное состояние растения, по-крайней мере, при повреждающих раздражениях.
Обобщая изложенное, можно отметить, что ЭС, по-видимому, являются наиболее вероятным кандидатом на роль стрессовых сигналов у растений. В то же время, существуют данные не вполне укладывающиеся в рамки таких представлений, поэтому вопрос об участии ПД и ВП в качестве стрессовых сигналов в растительном организме требует дальнейшего изучения.
ЭС сигналы являются наиболее вероятной кандидатурой на роль быстрых стрессовых сигналов у растений. Однако и в рамках этой гипотезы вопрос о механизмах влияния ЭС (стрессовых сигналов) на различные аспекты функционального состояния остается весьма актуальным. В настоящее время не существует достаточно полного и непротиворечивого его решения, однако, опираясь на имеющиеся литературные данные, можно сделать некоторые предположения о таких механизмах, Так, непосредственно сопряженными с генерацией ЭС являются такие параметры растительной клетки, как мембранный потенциал и ионные концентрации (Опритов и др., 1991). Как уже отмечалось, из литературы известно (Davies, 1987а, 1987b; Fromm, Eschrich, 1993; Papemik L.A., Kochian L.V., 1997; Bulychev et al., 2001; Schaller, Frasson, 2001), что изменения этих параметров могут участвовать в развитии широкого спектра функциональных ответов. В то же время остается неясным прямо или опосредованно реализуются эти эффекты, и что лежит в их основе.
Определения холодоустойчивости растений по параметрам замедленной флуоресценции
Более сложным является вопрос о вовлечении в повышение устойчивости фотосинтетических процессов. В связи с этим можно выделить два основных пути возможного влияния ФСА на устойчивость растения. Первый из них - это участие в формировании повышения общей устойчивости (например, за счет связи с индуцированной ЭС генной экспрессией, что показано в работе Vian et all (1999)). Одним из механизмов такого влияния может быть, например, продукция активных форм кислорода. Так с одной стороны рядом авторов (Foyer et al., 1994; Badger et al., 2000; Hldeg et al., 2000) было показано ее возрастание в хлоропласте при действии стресса (например, в результате псевдоциклического пути фотофосфорилирования (Веселовский, Весело-ва, 1990; Asada, 1999)). С другой - активные формы кислорода (при не очень высоких концентрациях) могут выступать и как стрессовые сигналы, участвуя в процессах повышения устойчивости растительного объекта к повреждающим факторам (Pastori, Foyer, 2002; Kohler et al., 2003; Himmelbach et al., 2003).
Второй путь влияния ФСА на устойчивость целого организма может быть связан с увеличением собственной устойчивости фотосинтетического аппарата (Murchie et al., 2005; Wentworth et al., 2006). Так известно, что фотоповреждение и обусловленные им процессы играют существенную (Tsonev et al., 2003; Schrader et al, 2004; Wise et al., 2004; Lizana et al., 2006), а по некоторым гипотезам (Климов, 1997) и основную роль в повреждении растительного организма при стрессовых воздействиях. Увеличение устойчивости при этом может реализовываться, например, через возрастание нефотохимического тушения (Herde et al., 1999а), которое является одним из механизмов защиты фотосинтетического аппарата от фотоповреждения (Niyogy et al., 1997; Muller et al., 2001; Medrano et al., 2002). Конкретные механизмы такого процесса могут быть, например, связаны с увеличением тепловой диссипации энергии в ФСП за счет возрастания градиента рН на тилакоидной мембране (Bruce et al., 1997; Delphin et al., 1998) и перехода виолоксантина в зеаксантин (Fisahn et al., 1995; Phillip et al., 1996; Muller et al., 2001; Horton, Ruban, 2004). Другой возможный путь повышения устойчивости фотосинтетического аппарата (и усиления его репарации) может быть связан с изменением пигментного и липидного состава, а также белковым синтезом (Allakhverdiev et al., 1999, 2001; Haubuhl et al., 2001; Allakhverdiev, Murata, 2004; Murhie et al, 2005; Takahashi, Murata, 2005), Наконец, в литературе имеются данные о прямой связи между интенсивностью фотосинтетических процессов и их устойчивостью (Тарусов, Веселовский, 1978), а также о снижении устойчивости фото синтетического аппарата, индуцированном ингибитором переноса е" через ФСІІ диуроном (Веселовский, Веселова, 1990). Возможны и другие пути изменения устойчивости фотосинтетического аппарата, например, перераспределение энергии между ФСІ и ФСП (Рубин, Кренделева, 2003) и т.д.
Следующим, тесно связанным с предыдущим, является вопрос о влиянии на устойчивость растений к действию стресс-факторов макроэргичесикх соединений, в частности - АТФ. Существуют представления (Климов, 1997; Huner et al., 1996), согласно которым изменение АТФ / АДФ или АТФ / НАДФН2 может оказывать определенное влияние на процессы клеточного уровня, например, на экспрессию генов в ядре (Pfannschmidt et al., 2001), и даже являться одним из рецепторов, чувствительных к абиотическому стрессу (Huner et al., 1996). В какой-то степени такая гипотеза согласуется с работами, показывающими возможность сигнальной роли у экзогенной АТФ (Demidchik et al., 2003). Однако, учитывая то, что основной ролью АТФ является энергетическая, весьма актуальным становиться вопрос о возможности ее влияния на устойчивость растительного объекта за счет поддержки адаптационных и репарационных процессов (а при избытке АТФ - и активации их). Такое влияние было бы, в определенной мере, сходно с увеличением доступной энергии, которая наблюдается на первой фазе стресса (Меерсон, Пшенникова, 1988) или при реакции активации (Гаркави и др., 1998) у животных. В связи с этим показано (Allakhverdiev et al., 2005а, 2005b, 2005с), что связанные с влиянием (по-видимому - энергетическим) АТФ на репарацию механизмы могут работать на уровне фотосинтетического аппарата, повышая его устойчивость к действию стресс-факторов. Существует также ряд косвенных аргументов в пользу возможности их функционирования на уровне целой клетки. В частности, можно отметить увеличение содержания АТФ и других макроэргических соединений в ходе закалки (Климов, 1997), а также стрессовую активацию ансамблей генов, кодирующих белки, участвующие в синтезе АТФ (Umeda et al., 1994). Можно предположить, что при функционировании связанного с энергетической функцией АТФ механизма, ее концентрации, способные вызывать изменения устойчивости должны лежать в пределах, соответствующих содержанию АТФ в клетках (около 0,1 - 1 мМ), и в этом отличаться от концентраций, необходимых для реализации сигнальной функции (порядка мкМ (Demidchik et al., 2003)). Таким образом, АТФ, по-видимому, может участвовать в вызванной стрессовыми сигналами изменении устойчивости растения к действию стресс-факторов, однако данные о направленности влияния противоречивы (Климов, 1997; Allakhverdiev et al., 2005а, 2005b, 2005с) и само такое влияние требует дополнительного изучения.
Кроме того, в ряде работ было показано, что восстановительные процессы (адаптивная реполяризация) при постоянном действии низкой температуры, требуют генерации ПД (и, в частности, выхода К 1 ) и сопровождаются увеличением доли ненасыщенных жирных кислот в плазматической мембране, что, вероятно, и повышает ее устойчивость к охлаждению (Пятыгин и др., 1994; Опритов и др., 1994; Опритов, 1998). Возможно, такие процессы могут иметь место и при распространении ЭС, внося определенный вклад в повышение устойчивости. Вопрос о связи этого процесса с увеличением содержания фитогормонов и изменением экспрессии генов остается открытым. Косвенно, в пользу такой возможности говорят временные характеристики ответа - он достигает значительного повышения к 30 - 60-й мин. после начала охлаждения и генерации ПД (Опритов, 1998). Такая кинетика близка к временным характеристикам развития медленной инактивации фотосинтеза (Репа-Cortes et al., 1995; Herde et al., 1999a).
Связь вызванного электрическими сигналами повышения содер жания АТФ с холодоустойчивостью
Изучение влияния охлаждения (7 мин, -8 С) на амплитуду тестовой биоэлектрической реакции показало, что при отсутствии локальных раздражений наблюдается уменьшение величины БЭР до 45 ± 3 % от начальных значений, предшествующих охлаждению (рис. 10). Такое снижение, как было показано в ряде работ (Ретивин, Опритов, 1992; 1993), отражает холодовое повреждение проростка.
Нанесение локального неповреждающего раздражения вызывало изменения величины угнетения БЭР, которые имели сложную динамику и, по-видимому, отражали возрастание холодоустойчивости удаленных от зоны раздражения участков объекта (рис. 10). При этом достоверное повышение холодоустойчивости появлялось приблизительно через 10 мин и достигало максимума через 20 мин после раздражения (величина БЭР составила 85 ± 5 % от начальных значений). Далее (на 30-й минуте) наблюдалась тенденция к снижению устойчивости проростка к холоду, которая на этом этапе не отличалась достоверно от контроля. Через 50 мин после раздражения имела место тенденция к формированию второго, меньшего по величине максимума устойчивости (амплитуда БЭР составила 71 ± 10 % от начальных значений), которая к 70-й минуте сменялась спадом холодоустойчивости до контрольного уровня.
Использование локального повреждающего раздражителя индуцировало изменения холодоустойчивости сходные по своей динамике с ответами, вызванными неповреждающими раздражениями (рис. 10). В то же время повышение холодоустойчивости формировалось медленнее (достоверные различия наблюдались только через 20 мин после раздражения), а его величина была больше (амплитуда БЭР составила 96 ± 11 % и 80 ± 10 % от начальных значений для 20-й и 50-й минуты, соответственно), чем в варианте с действием неповреждающего локального раздражения.
Такие результаты демонстрируют способность как неповреждающих, так и повреждающих локальных раздражений дистанционно вызывать повышение холодоустойчивости у проростков тыквы, т.е. показывают существование у них стрессовых сигналов. При этом общим у ответов является сам факт их возникновения, тенденция к наличию у них двух этапов (времена развития этапов совпадают) и большая величина первого этапа. Специфичность ответа при действии неповреждающего раздражителя проявляется в большей скорости развития и меньшей величине. Важно отметить, что ответ на неповреждающее раздражение (прикосновение льдом) был по ряду параметров (времени развития начала ответа и его максимумов (Ретивин, Опри-тов, 1993)) сходен с повышением холодоустойчивости, вызванным постепенным охлаждением. Такое сходство ответов на использованное нами неповреждающее раздражение (лед) и на умеренное раздражение (постепенное охлаждение), свидетельствует в пользу предположения об электрической природе показанных стрессовых сигналов (Ретивин и др., 1997, 1999а; Репе Cortes et al., 1995; Herde et al., 1999b). Так известно, что ПД могут возникать и при постепенном, и при импульсном охлаждении (Лобов, 2003; Опритов и др., 2005), в то время как ожог (повреждающее раздражение) является одним из известных индукторов ВП (Lautner et al., 2005), т.е. ЭС другого типа. Холодоустойчивость листьев герани оценивали по устойчивости к охлаждению их фотосинтетического аппарата, путем регистрации кривых затухания ЗФ до и после охлаждения (Ретивин и др., 1999а). Было показано, что 25-минутное охлаждение (-8 С) вызывает снижение светосуммы секундной компоненты ЗФ до 32 ± 8 % от величины предшествующей охлаждению (Рис. 11), что отражает повреждение фотосинтетического аппарата (Ретивин и др., 1999а). Исследование влияния локальных раздражений на устойчивость фотосинтетических процессов к холоду показало, что через 5 мин после нанесения повреждающего раздражения охлаждение вызывало значи тельно большее повреждение фотосинтетического аппарата, нежели в контроле (7 ± 2 % от величины до охлаждения) (Рис. 11). Неповреждающее раздражение не вызывало достоверных изменений величины повреждения фотосинтетического аппарата (Рис. 11).
Таким образом, повреждающее раздражение черешка быстро (не более 5 мин) и значительно снижало устойчивость фотосинтетического аппарата клеток листа герани, что, по-видимому, отражало уменьшение его холодоустойчивости. Эти данные демонстрируют существование стрессовых сигналов у листьев герани. В то же время, они в определенной степени противоречат показанным в предыдущем разделе результатам и данным литературы (Ретивин, Опритов, 1993; Ретивин и др., 1997; Акимова и др., 1998, 1999, 2000, 2001), в том числе, полученным с использованием метода регистрации ЗФ (Ретивин и др., 1999а) (холодоустойчивость объекта снижается). Однако, необходимо учитывать, что отделенные листья герани, которые использовали в данном варианте эксперимента, могут значительно отличаться по своим свойствам от целого растения. Так, у них может быть нарушен отток метаболитов из листа, который за счет донорно-акцепторных отношений идет в ин-тактном растении (Мокроносов, Гавриленко, 1992). В свою очередь, такие метаболиты (например, АТФ) могут, как способствовать увеличению устойчивости к стресс-факторам (AllakhvercUev et al., 2005а, 2005b, 2005с), так и, по-видимому, снижать ее (или повреждать растение) при высоких концентрациях (Климов, 1997; Noctor, Foyer, 2000). На основании этого можно предположить, что изменение (в случае интактного растения - повышение) холодоустойчивости может быть связано с возрастанием содержания продуктов фотосинтетических процессов (в частности - АТФ). С другой стороны при отсутствии нормального оттока и - как следствие - избыточном накоплении метаболитов в листе оно, по-видимому, способно вызывать и снижение устойчивости растения. Более подробный экспериментальный и теоретический анализ этой гипотезы будет предпринят далее (разделы 3.3 и 3.4). Другой важный результат этой серии опытов заключается в отсутствии у листьев герани изменений холодоустойчивости при действии неповреж-дающих раздражителей, что хорошо согласуется с данными литературы о неспособности неповреждающих раздражений вызывать распространяющиеся ЭС у черешков отделенных листьев герани (Ретивин и др., 1989). Таким образом, результаты этого раздела (как и экспериментов с проростками тыквы) являются аргументами в пользу участия ЭС в качестве стрессовых сигналов. Подробнее этот вопрос будет проанализирован в следующем разделе (3.2).
Влияние электрических сигналов на параметры замедленной флуоресценции у проростков тыквы
Как было показано в предыдущем разделе (3.2.), ЭС участвуют в формировании дистанционного повышения холодоустойчивости при действии локальных раздражений. При этом остается открытым вопрос - как именно реализуется это влияние? Существует гипотеза (Ретивин и др., 1999b), что одним из промежуточных звеньев в ее реализации является увеличение содержания АТФ в растении. В пользу такой возможности говорят, с одной стороны, данные литературы о модифицирующем влиянии АТФ на устойчивость растений к действию стрессовых факторов (Allakhverdiev et al., 2005а, 2005b, 2005с), а с другой - увеличение содержания АТФ во флоэмном эксудате через несколько минут после индукции ЭС (Ретивин и др., 1999b; Лобов, 2003). В то же время, в проведенных ранее работах (Ретивин и др., 1999b; Лобов, 2003) изменения АТФ оценивали только на 15-минутном временном интервале после индукции ЭС, что не позволяет соотнести их с показанными нами изменениями холодоустойчивости проростков тыквы. Поэтому целью следующего этапа исследования стало изучение содержания АТФ во флоэмном эксудате на длительных временных интервалах после индукции ЭС.
Изучение влияния ЭС на содержание АТФ во флоэмном эксудате показало, что ПД вызывал его увеличение, которое достигало первого максимума через 15 мин после раздражения (приблизительно, в 1.5 раза выше контроля), а на 30-й минуте снижалась до исходного уровня (Рис. 18). Несколько позже, начинало развиваться второе повышение содержания АТФ с максимумом через 60 мин после индукции ПД (приблизительно, в 2.5 раза выше контроля) (Рис. 18). Вызванные ВП изменения содержания АТФ во флоэмном эксудате имели другую динамику. Так изменения начинались позже (через 15 мин после индукции ЭС достоверных от контроля не наблюдалось) и сохраняли стабильно повышенные значения (приблизительно, в 1.5 раза выше контроля) через 30-60 мин после раздражения (Рис. 18).
Такая динамика (и при ПД, и при ВП) близка к динамике вызванных ЭС изменений холодоустойчивости проростков тыквы, что, возможно, свидетельствует в пользу прямой связи этих процессов.
Как было показано в предыдущем разделе, ЭС могут вызывать повышение содержания АТФ в флоэмном эксудате проростков тыквы, причем динамика изменений близка к динамике повышения их холодоустойчивости. Такие ответ свидетельствует в пользу гипотезы о том, что именно возрастание содержания АТФ может быть ответственно за повышение устойчивости растения к действию стресс-факторов (Ретивин и др., 1999b). Задачей следующего этапа исследования стало прямое изучение влияния АТФ на холодоустойчивость изучаемых объектов.
Для проверки предположения о влиянии АТФ на холодоустойчивость проростков тыквы (тестовое охлаждение -8 С, 15 мин) было изучено влияние на нее экзогенных АТФ и АДФ. При этом показано, что АТФ в зависимости от концентрации в омывающем срез гипокотиля растворе ([АТФ] наружная) вызывала двухфазное изменение холодоустойчивости проростка тыквы (Рис. 19а). Так возрастание концентрации экзогенной АТФ до 1 мМ приводило к двукратному увеличению холодоустойчивости растения (201 ± 27 % от контроля). Дальнейшее повышение концентрации АТФ снижало устойчивость. При 3 мМ она становилась достоверно меньше контрольных значений (64 ± 12 % от контроля). Обработка экзогенной АДФ ([АДФ] наружная) вызывала лишь слабые колебания холодоустойчивости объекта, которые были направлены в сторону ее снижения и имели недостоверный характер (Рис. 19а). В условиях отсутствия охлаждения ни АТФ, ни АДФ не вызывали достоверных изменений амплитуды тестовых БЭР у проростков (Рис. 19а). Таким образом, экзогенная АТФ (но не АДФ) действительно влияла на холодоустойчивость проростка тыквы, причем начальным этапам такого влияния было повышение устойчивости растительного объекта к холоду.
В то же время, несмотря на то, что повышение холодоустойчивости является, по-видимому, системным ответом, достаточно интересен вопрос -проходит ли АТФ непосредственно в зону, в которой измерялась холодоустойчивость (индуцировали тестовые БЭР), или ее влияние реализуется каким-либо опосредованным способом (например, через повышение устойчивости других участков проростка)? С целью изучения этой проблемы, была исследована связь между содержанием АТФ в наружном растворе и ее содержанием в гипокотиле (в зоне, где исследовали холодоустойчивость растения). При этом показано, что содержание АТФ в исследованном участке гипокотиля линейно связано с содержанием АТФ в наружном растворе (Рис. 196), т.е. влияние АТФ на холодоустойчивость зоны, в которой индуцировали тестовые БЭР, по-видимому, связано непосредственно с изменением энер-гизации этого участка гипокотиля.
