Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ " 8
1.1 Микробиологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов и повышения урожайности 8
1.2 Микробиологические препараты для биологической рекультивации нефтезагрязненных почв 19
1.3 Сухие препаративные формы микробиологических препаратов 28
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 34
2.1 Объекты исследований 34
2.2 Характеристика биопрепаратов Елена, Азолен, Ленойл 36
2.3 Исследование антагонистической активности микроорганизмов биопрепаратов Елена и Азолен 36
2.4 Определение стабильности видового состава консорциума микроорганизмов - нефтедеструкторов 37
2.5 Исследование окислительной активности микроорганизмов -деструкторов нефти и нефтепродуктов 37
2.6 Исследование процесса концентрирования биомассы микроорганизмов в лабораторных условиях 38
2.7 Изучение способов хранения в лабораторных условиях микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов Елена, Азолен, Ленойл 39
2.8 Исследование влияния процесса сушки биопрепаратов на их функциональные характеристики 40
2.9 Оценка эффективности применения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена и Азолен против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях полевого эксперимента 41
2.10 Статистическая обработка результатов 42
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛОКУЛЯНТОВ 43
3.1 Изучение процесса концентрирования биомассы микроорганизмов биопрепарата Ленойл 45
3.2 Исследование процесса концентрирования биомассы бактерий -антагонистов рода Pseudomonas и Azotobacter 50
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИЙ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ ОСНОВОЙ БИОПРЕПАРАТОВ ЛЕНОЙЛ, ЕЛЕНА И АЗОЛЕН, НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ 65
4.1 Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Ленойл 67
4.2 Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Елена 72
4.3 Изучение способов хранения и разработка рецептуры сухой препаративной формы биопрепарата Азолен 75
4.4 Оценка эффективности применения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена и Азолен против возбудителей корневых гнилей пшеницы в условиях полевого эксперимента 79
4.5 Опытно-промышленное производство сухих биопрепаратов Ленойл и Елена 81
5. ВЫВОДЫ 86
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 87
ПРИЛОЖЕНИЕ 108
- Микробиологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов и повышения урожайности
- Объекты исследований
- Изучение процесса концентрирования биомассы микроорганизмов биопрепарата Ленойл
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современное развитие биотехнологии способствовало появлению нового поколения высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства. Использование для создания таких препаратов природных штаммов микроорганизмов обеспечивает им высокую экологическую безопасность. Прогресс в производстве и применении биопрепаратов, во многом, связан с разработкой высокотехнологичных, сохраняющих долгое время их исходные свойства препаративных форм. Одним из наиболее удачных решений этой проблемы является производство биопрепаратов в порошкообразном виде, удобном для хранения, транспортировки и применения.
Разработка технологий производства сухих препаративных форм биопрепаратов, способных длительно сохранять жизнеспособность и функциональную активность клеток микроорганизмов различных системных групп является актуальной задачей современной биотехнологии.
Цель исследования. Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл (консорциум бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5), Елена (на основе Pseudomonas aureofaciens ИБ 51), Азолен (Azotobacter vinelandii ИБ 4).
Задачи исследования.
Разработать способ концентрирования биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости, позволяющий сохранять на исходном уровне активность бактерий-антагонистов по отношению к грибным фитопатогенам.
Разработать технологию концентрирования биомассы микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен.
Исследовать в лабораторных условиях жизнеспособность и активность клеток бактерий, составляющих основу биопрепаратов, иммобилизованных на твердых носителях.
Разработать технологию получения сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен.
Оценить эффективность применения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена, Азолен в полевых условиях для защиты пшеницы от болезней и повышения ее урожайности.
Научная новизна. Впервые предложен новый способ выделения биомассы бактерий рода Pseudomonas, предусматривающий использование в качестве флокулянта реагента Гивпан, обеспечивающий сохранение антагонистической активности бактерий по отношению к грибным фитопатогенам (Пат. РФ №2245916).
Изучены процессы концентрирования биомассы бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter при использовании реагента Гивпан, консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5 с применением флокулянта Каустамин-15.
Изучено влияние процесса иммобилизации клеток на жизнеспособность и функциональную активность бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Azotobacter vinelandii ИБ 4, Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5.
Практическая значимость. Разработана технология производства сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен, в течение длительного времени сохраняющих жизнеспособность и функциональную активность микроорганизмов, составляющих их основу.
Совместно с предприятием-производителем ГУП "Опытный завод АН РБ" разработаны, согласованы с контролирующими организациями и утверждены технические условия на сухую препаративную форму биопрепарата Ленойл (ТУ 9291-020-22357427-2004).
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на II Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов " (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), II Всероссийской научной Internet-конференции "Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем" (Уфа, 2003), XVII Международной научно-технической конференции "Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии" (Уфа, 2004), Международной научно-практической конференции "Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем" (Краснодар, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано И научных работ, в том числе 2 патента Российской Федерации.
Микробиологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов и повышения урожайности
Химико-техногенная интенсификация растениеводства обеспечивает высокие урожаи сельскохозяйственной продукции, но связана с опережающим ростом затрат материальных ресурсов и невозобновляемой энергии на единицу продукции, а широкое применение пестицидов вызывает загрязнение продуктов питания и окружающей среды вредными для живых организмов соединениями. Интенсивная антропогенная нагрузка нарушила природные сбалансированные процессы растительно-микробного взаимодействия в агрофитоценозах и привела к снижению плодородия и упрощению микробоценозов почвы. В сложившихся условиях для получения биологически полноценной продукции и сохранения плодородия почв необходимо создание и применение в растениеводстве микробиологических препаратов, улучшающих корневое питание растений, стимулирующих их рост, защищающих от болезней и вредителей.
На сегодняшний день, использование биопрепаратов вместо химических средств защиты или наряду с ними, зачастую еще не нашло массового применения, и многие примеры пока имеют отношение только к научным изысканиям ученых.
Развитие микробиологического метода защиты растений началось в нашей стране с середины 70-х годов прошлого века. Тогда это направление считалось очень перспективным, объемы применения биопрепаратов планировались весьма высокие. Так, в 70-80-е годы на заводах Бердском и "Прогресс" выпускали до 10 тыс. т микробиологических средств защиты растений. Эти препараты широко применялись в сельском и личных подсобных хозяйствах, лесном ведомстве, однако начиная с 1995 г. в связи с общей разрухой, и в сельском хозяйстве в частности, объем использования биопрепаратов стал значительно снижаться. Так, доля биометода в общем объеме защитных работ снизилась за 1994-2002 гг. с 20 до 4%. На этом фоне идет усиленная пропаганда химических препаратов, соответственно, растет их импорт, тогда как в развитых странах отмечается противоположная тенденция (Ткачева, 2004).
Результаты анализа свидетельствуют о снижении объемов продаж пестицидов и затрат на разработку новых действующих веществ ведущими химическими концернами - в среднем с 9,4% (1998 г.) до 8,2% (2002 г.) от объема продаж в стоимостной оценке. Одновременно затраты на биотехнологические, селекционные и биологические исследования увеличились за этот период с 17,4 до 24,9%. Так, в 2002 г. крупнейшая на рынке средств защиты растений фирма "Байер" продала пестицидов на сумму 6001 млн долл., семян и биотехнологических продуктов, соответственно, - на 175 и 75 млн долл., затратила на проведение научных изысканий 665 млн долл., в том числе на исследования в области биологии — 166 млн долл. (The newsletter of Phillips McDouglall-AgriService, 2003)
Еще в 1994 г. коллегией Министерства сельского хозяйства России было принято "Постановление о мерах по расширению производства и применения биологических средств защиты растений", где отмечено, что биологическую защиту следует считать приоритетным направлением в интегрированной борьбе с вредителями и болезнями.
На сегодняшний день Госхимкомиссией разрешены к применению на территории Российской Федерации следующие биофунгициды и биоудобрения: Фитоспорин-М, Бактофит, Бинорам, Вермикулен, Псевдобактерин-2, Агат-25К, Планриз, Фитолавин-300, Триходермин, Азотовит, Бактофосфин, Байкал ЭМ-1, биоудобрение "Возрождение", Ризоторфин, Экстрасол, Ургаса, ФИТО Плюс (Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2001).
Бактерии p.Pseudomonas относятся к числу наиболее перспективных агентов биологического контроля заболеваний сельскохозяйственных растений. Среди представителей этой группы микроорганизмов встречаются не только антагонисты почвенных фитопатогенов (Osburn et al.,1989; Zaspel, 1989; Elsherif M, 1991), многие штаммы псевдомонад активно способствуют улучшению роста и развития растений (Пат. № 20511586 РФ; Pietr, 1987; Renato de Freitas, 1991). По данным ряда исследований известно, что, являясь типичными представителями ризосферы растений и обладая высокой скоростью роста, интродуцированные псевдомонады успешно колонизируют ризосферу растения-хозяина, вытесняя оттуда фитопатогенов (Caponlgro, 1986).
Объекты исследований
Исследования проводились в условиях лабораторных и полевых опытов в течение 2002-2005 гг. Лабораторные эксперименты были осуществлены в лаборатории биологически активных веществ Института биологии УНЦ РАН. Полевой опыт проводили на опытном поле Учебного хозяйства Башкирского Государственного Аграрного Университета (поселок Миловка, Уфимский район, Республика Башкортостан). Определение углеводородокисляющей способности консорциума бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies проводили в контрольно-аналитической лаборатории Института Биологии УНЦ РАН.
Объектами исследований служили микроорганизмы родов Pseudomonas, Azotobacter, Bacillus, Arthrobacter, выделенные из различных источников в лаборатории биологически активных веществ и депонированные в Коллекцию микроорганизмов ИБ УНЦ РАН.
Все нижеперечисленные штаммы микроорганизмов, использованные в исследованиях, запатентованы в Российской Федерации:
1. Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 (Пат. РФ 2203945);
2. Pseudomonas putida ИБ 17 (Пат. РФ 2213774);
3. Azotobacter vinelandii ИБ 1 (Пат. РФ 2224791);
4. Консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5 (Пат. РФ 2232806);
5. Azotobacter vinelandii ИБ 4 (Пат. РФ 2245918);
6. Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 (Заявка №2003101144/13). Штаммы-антагонисты рода Pseudomonas выращивали на среде Кинг В
(Смирнов, 1990) следующего состава, г/л: пептон - 2, глицерин - 1, К2НР04 -0.15, MgS04- 7НгО - 0.15, вода дистиллированная - до 1л.
Штаммы-антагонисты рода Azotobacter выращивали на среде 40 (Каталог культур микроорганизмов, 1992) следующего состава, г/л: сахароза - 20, дрожжевой экстракт - 0.5, К2НР04 - 0.8, КН2Р04 - 0.2, MgS04- 7Н20 -0.2, CaSCV 7Н20 - 0.1, FeCl3 - 0.001, Na2Mo04 - 0.001, вода дистиллированная - до 1л.
Биомассу консорциума бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies получали культивированием на жидкой среде Раймонда (Егоров, 1976) следующего состава, г/л: Na2C03 - 0.1, СаС12 - 0.01, MnS04- 7Н20 - 0.02, FeS04- 7Н20 - 0.02, Na Н2Р04 - 1.5, К2НР04 - 1.0, MgS04- 7Н20 - 0.2, NH4N03 - 2, дрожжевой автолизат - 1.0, источником углерода служило дизельное топливо — 1%, вода дистиллированная — до 1л.
В качестве тест-объектов для определения антагонистического действия штаммов псевдомонад и азотобактера, составляющих основу вышеуказанных биопрепаратов, служили следующие мицелиальные грибы:
X.Fusarium oxysporum ВКМ 137,
2. Bipolaris sorokiniana,
3. Alternaria alternata.
Все микромицеты хранятся в Коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН.
Для выращивания грибов использовали агаризованную среду Чапека (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1983), следующего состава, г/л: сахароза - 30.0 или глюкоза - 20.0, NaN03 - 2.0, К2НР04 - 1.0, MgS04- 7Н20 - 0.5, КС1 - 0.5, FeSCV 7Н20 - 0.1, вода дистиллированная - до 1л.
В качестве флокулянтов на стадии выделения биомассы микроорганизмов использовали катионогенные водорастворимые полиэлектролиты ВПК-402 по ТУ 6-05-2009-86, Каустамин-15 по ТУ 2227-222-00203312-2002 и водорастворимый полимер Гивпан по ТУ 2216-001 04698227-99. В качестве адсорбента микроорганизмов применяли каолин технический по ГОСТ 19608-84.
Изучение процесса концентрирования биомассы микроорганизмов биопрепарата Ленойл
В работе использовали промышленный образец биопрепарата Ленойл, полученный при культивировании консорциума микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter spesies ИБ ДТ 5-3, общий титр клеток в котором составил 7-1010КОЕ/мл. До внесения флокулянта в КЖ, его разводили 2-7 объемами воды. Затем смесь (КЖ с флокулянтом) перемешивали в течении 2 мин для того, ч чтобы обеспечить равномерное движение объемов раствора с активными центрами полиэлектролитов, где происходит столкновение и слипание частиц. Далее смесь выдерживали во времени, периодически отбирая пробы и определяя полноту осаждения биомассы. Процесс осаждения проводили при комнатной температуре и при рН культуральной жидкости (рН=6,8-7,3)
Степень осветления КЖ определяли по уменьшению оптической плотности культуральной жидкости консорциума по сравнению с супернатантом, полученным при ее центрифугировании. увеличением вязкости культуральной жидкости, не позволяющей образованным флокулам осесть, либо это обусловлено зарядом клеток микроорганизмов входящих в состав консорциума биопрепарата Ленойл, их морфологическими свойствами, составом и физико-химическими характеристиками культуральной жидкости в целом.
Результаты экспериментов (рис.3.1) показали, что использование коагулянта — сернокислого алюминия в процессе концентрирования биомассы микроорганизмов консорциума осложняется образованием стойкой эмульсии на поверхности раздела фаз. В процессе седиментации степень осветления КЖ, составляющая около 57%, достигалась по прошествии 150 мин. Так, титр микроорганизмов в осадке составил 9-Ю10 КОЕ/мл, а в надосадочной жидкости - 6,7-1010 КОЕ/мл. Биомассу отделяли декантацией.
Похожие диссертации на Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл, Елена, Азолен
