Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ИММУНОГЛОБУЛИНЫ, ИХ СВОЙСТВА И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1 Иммуноглобулиновые препараты в медицине 14
1.2. Физико-химические свойства иммуноглобулинов 20
1.3. Препаративные методы выделения иммуноглобулиновых композиций, содержащих три основных класса иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM 26
1.3.1. Методы фракционирования неорганическими солями.. 26
1.3.2. Фракционирование органическими растворителями 28
1.3.3. Выделение иммуноглобулиновой фракции полимерами. 30
1.3.4. Метод ионообменной хроматографии 31
1.4. Стабилизация физико-химических и биологических свойств иммуноглобулиновых препаратов 32
1.5. Методы стерилизации иммунобиологических препаратов и способы инактивации вирусов 37
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 42
2.1. Материалы 42
2.1.1. Материалы и реактивы 42
2.1.2. Экспериментальные животные 44
2.2. Методы исследований 44
2.2.1. Иммунохимические методы 44
2.2.2. Химические методы 46
2.2.3. Физико-химические методы 46
2.2.4. Физические методы 49
2.2.5. Биологические методы 49
2.2.6. Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов 52
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНО - ГЛОБУЛИНОВОЙ ФРАКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КИП 52
3.1. Сравнительная оценка качественного состава осадков Б и выбор критериев их пригодности в качестве исходного сырья для получения КИП 53
3.2. Исследование эффективности фракционирования иммуноглобулинов солями двухвалентных металлов 61
3.3. Разработка метода выделения очищенной иммуноглобули- новой фракции с использованием сульфата меди 78
3.4. Определение содержания в препарате ионов меди 87
ГЛАВА 4. СТАБИЛИЗАЦИЯ СВОЙСТВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУХИХ ДОЗИРОВАННЫХ ФОРМ КИП 97
4.1. Влияние стабилизаторов на физико-химические и биологические свойства КИП при сублимационном обезвоживании
4.2. Оценка эффективности стерилизации КИП у-облучением 102
4.3. Приготовление твердых дозированных форм КИП 106
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ КИП 110
5.1. Испытание токсичности препарата на мышах 110
5.2. Изучение безвредности и эффективности комплексного иммуноглобулинового препарата на обезьянах 111
5.2.1. Испытание безвредности препарата на обезьянах 111
5.2.2. Изучение терапевтического эффекта КИП при лечении острой кишечной инфекции с диарейным синдромом 117
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125
ВЫВОДЫ 133
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 134
ПРИЛОЖЕНИЕ 145
- Иммуноглобулиновые препараты в медицине
- Материалы и реактивы
- Сравнительная оценка качественного состава осадков Б и выбор критериев их пригодности в качестве исходного сырья для получения КИП
Введение к работе
В настоящее время клиницисты уделяют все больше внимания иммуноглобулиновым препаратам. Этому способствует постоянно регистрируемый рост иммунодефицитных состояний, вызываемых взаимодействием организма с внешней средой и процессом развития генофонда микроорганизмов [51]. Кроме того, применяемые в терапии острых и хронических инфекционных заболеваний химпотерапевтические препараты, в том числе антибиотики, обладают супрессорной активностью в отношении иммунной системы. Антибиотики угнетают фагоцитарную активность лейкоцитов и комплементарную активность сыворотки крови. Длительная и интенсивная антибиотикотерапия у ряда больных обусловливает развитие лекарственной резистентности возбудителей, дисбактериоза, кандидоза, аллергических реакций [57].
Важное значение в настоящее время приобрели инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами, госпитальные инфекции, феномен суперинфицирования. По мнению клиницистов, будущее - за препаратами и схемами лечения, объединяющими в себе как специфическое действие на конкретный возбудитель, так и одновременное иммуномодулирующее действие [8]. Одним из наиболее перспективных направлений является разработка пероральных форм иммуноглобулиновых препаратов, так как данный способ введения имеет ряд преимуществ перед парентеральным [67,101]: непосредственная и быстрая доставка препарата в ЖКТ; простота введения; хорошая переносимость препарата; возможность добавления препарата в пищу; возможность увеличения объема вводимого препарата.
Комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП) для парентерального применения был разработан на базе лаборатории- биохимии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под руководством проф. Н. В. Холчева в 70-х годах. В 90-х годах В.А. Алешкиным была предложена концепция пероралыюго применения КИП, в соответствии с которой препарат используется для профилактики и терапии острых кишечных инфекций (ОКИ) и ряда других заболеваний [63, 39].
КРІП содержит три класса иммуноглобулинов G, А, М, что обеспечивает высокий терапевтический эффект при его оральном и ректальном применении, убедительно демонстрируемый клиницистами уже более 10 лет [57]. В связи с высоким уровнем заболеваемости ОКИ, участившимися тяжелыми и затяжными формами инфекционного процесса комплексный иммуноглобулиновый препарат используется все шире. Есть данные о том, что КИП эффективен не только для детей первых лет жизни, как считалось ранее, но и для взрослых [39].
Существующая технология производства КИП характеризуется длительностью, многостадииностью и имеет ряд недостатков, делающих се непригодной для приготовления твердых дозированных форм препарата. В частности, на стадии выделения иммуноглобулинов в качестве основного фракционирующего агента используется органический растворитель -хлороформ в концентрации, обусловливающей необходимость соблюдения особых условий, усложняющих проведение процесса. Сублимационное обезвоживание препарата в стеклянных флаконах чрезмерно продолжительно (до 2 суток) и не предусматривает возможности получения сухой субстанции КИП в количествах, необходимых для производства твердых дозированных форм (таблетки, капсулы).
В последние годы особое внимание уделяется биологической безопасности препаратов, получаемых из биологических жидкостей человека, и методам их стерилизации [70]. Наиболее экономически выгодным и наиболее щадящим из всех существующих методов стерилизации препаратов, по мнению ряда авторов, признан метод с использованием у-облучения [46]. Однако, отсутствуют сведения о возможности применения его для обработки сухого КИП.
Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности проведения исследовательской работы по усовершенствованию технологии получения комплексного иммуноглобулинового препарата и создание новых лекарственных форм.
Цель исследования: разработка технологии получения сухой субстанции КИП, пригодной для создания твердых дозированных лекарственных форм препарата, и оценка терапевтической эффективности КИП в таблетках и капсулах на обезьянах, страдающих ОКИ.
Задачи исследования:
Предложить критерии оценки качества осадков "Б", получаемых на различных предприятиях по производству иммуноглобулина по методу Кона, как исходного сырья для приготовления КИП.
Изучить возможность использования солей двухвалентных металлов для выделения фракций, содержащих три основных класса иммуноглобулинов и предложить оригинальную технологию получения субстанции КИП.
Оценить возможность интенсификации процесса сублимационного обезвоживания КИП с подбором необходимых стабилизаторов для сохранности физических и биологических свойств полученного материала.
Исследовать возможность стерилизации субстанции КИП методом гамма-облучения, оценить его влияние на биологическую активность , микробиологическую чистоту и биологическую безопасность.
Изучить механическую устойчивость иммуноглобулинов в сухой субстанции и приготовить различные лекарственные формы препарата (во флаконах, таблетках и капсулах).
Провести оценку токсичности всех полученных лекарственных форм препарата КИП на мышах и изучить безвредность и лечебную эффективность на обезьянах, больных ОКИ.
Научная новизна
Впервые показано, что соли двухвалентных металлов могут быть использованы для одновременного выделения иммуноглобулинов трех основных классов IgG, IgA и IgM. При этом фракционирование возможно из концентрированных субстанций, к которым, в частности, относится осадок Б. Наиболее эффективным фракционирующим агентом с точки зрения полноты выделения антител и чистоты получаемой фракцииявляется сульфат меди.
Экспериментально обоснован выбор из ряда веществ различной природы (сахара, аминокислоты) стабилизирующих компонентов, определены их сочетания и концентрации, оказывающие наибольший защитный эффект от действия на иммуноглобулины неблагоприятных факторов технологических процессов переработки сухой субстанции КРІП, приготовления готовых форм препарата и их хранения.
Впервые показано, что повышение температуры греющей поверхности полки до 55С на этапе сублимации влаги из лиофильно высушиваемого препарата не оказывает негативного влияния на специфические свойства иммуноглобулинов, что вносит коррективы в существующее представление об их слабой устойчивости к обезвоживанию.
Предложена стерилизация сухой субстанции КИП гамма-облучением. Доза поглощенной радиации 20 кГр вызывает, в зависимости от вида использованных защитных веществ, потерю антпсальмонеллезной активности иммуноглобулинов на 1-3 двукратных разведения и может приводить к изменению соотношения классов иммуноглобулинов. Наибольший защитный эффект оказывает комбинация 1% глицина и 2% глюкозы.
Впервые проведенные исследования по созданию твердых дозированных форм КИП дают представление о степени механоустойчивости антител в сухом состоянии. Установлено, что воздействие физико-механических факторов, возникающих в процессе разрушения сухой субстанции КИП при ее измельчении и в ходе прессования таблеточной смеси при изготовлении таблеток, сопровождается снижением специфической активности иммуноглобулинов не более чем на одно двукратное разведение, но не оказывает влияния на соотношение классов иммуноглобулинов в препарате.
В экспериментах на обезьянах, больных острой кишечной, инфекцией с диарейным синдромом, впервые показано, что разработанные твердые дозированные формы КИП - таблетки и капсулы обладают терапевтической эффективностью, не уступающей таковой препарата, выпускаемого в настоящее время в виде сухой массы во флаконах, и достоверно превосходят эффективность антибиотикотерапии.
Практическая значимость
Предложены критерии оценки осадков Б с целью их дополнительного использования в качестве сырья для производства комплексного иммуноглобулинового препарата.
Использование сульфата медп на стадии выделения иммуноглобулинов из осадка Б, как основного фракционирующего агента, а экстрагента липидов и липо протеидов - хлороформа в концентрации не более 1%, исключает необходимость соблюдения особых условий проведения процесса, что, в свою очередь, обеспечивает снижение трудоемкости и повышение рентабельности всей технологии приготовления препарата.
Экспериментально обоснованный выбор состава и концентрации защитных компонентов обеспечивает стабильность специфических свойств иммуноглобулинов во всех разработанных лекарственных формах препарата в течение более 2 лет хранения.
Интенсивность подвода тепла к высушиваемому препарату на этапе сублимации влаги позволяет сократить длительность не только этого этапа, но и всего процесса высушивания КИП в 2,7 раза до 14 часов.
Доказана принципиальная возможность использования у- стерилизации для иммуноглобулинсодержащих препаратов, что способствует расширению сферы применения данного метода.
Сухая субстанции КИП позволяет приготовить твердые дозированные формы препарата, что удобно в использовании и способствует расширению сферы его применения.
Лекарственные формы комплексного иммуноглобулинового препарата, приготовленные по разработанной технологии, показали эффективность лечения обезьян, больных диарейными заболеваниями, в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН: Рекомендованы проведения клинических испытаний готовых лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата - капсул, таблеток, флаконов на людях.
Внедрение результатов работы.
На базе лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора разработаны и пригоговлены экспериментальные серии комплексного иммупоглобулинового препарата во флаконах, таблетках и капсулах.
На основании проведенных исследований оформлены шесть патентов на изобретения:
1. Патент РФ. № 2189833, А61К 39/395. Способ получения
иммуноглобулинового препарата / А.В. Зорик, В.А. Алешкин, А.Г. Лютов, И.В.
Борисова Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской
Федерации 19 октября 2000. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.
Габричевского Роспотребнадзора.
Патент РФ. № 2255766, МІЖ А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций, иммуноглобулиновый препарат для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций (варианты) и суппозитории на основе иммуноглобулинового препарата / Алешкин В.А.. Новикова Л.И., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Зуева М.М., Зорик А.В. . Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 5 марта 2003. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Патент РФ. № 2247578, МПК А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным действием / Мелихова А.В., Алешкин В.А., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Рубальский О.В., Гаврин А.Г. (Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 марта 2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Патент РФ. № 2334503, МІЖ A61J 3/10. Способ таблетирования медицинских иммунобиологических препаратов / Давыдкин И.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин В.Ю., Рубальский О.В., Гаврин А.Г., Мелихова А.В., Афанасьев С.С. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской
Федерации 27 сентября 2008. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Патент РФ. № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова А.В., Давыдкин В.Ю.. Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009. Патентообладатель ФГУЫ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Патент РФ. № 2371199, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова А.В., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Результаты исследований используются в научно-практической работе ФГУН МНИИЭМ им.Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Экспериментальные серии препаратов КИП прошли успешные испытания при лечении больных ОКИ обезьян в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер) под руководством академика РАМН, профессора Б.А. Лапина и доктора медицинских наук, профессора Э.К. Джикидзе. Акт о доклинических испытаниях от 9 апреля 2009 года.
Метод определения ионов меди используется в лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора с 2001 года для определения качества комплексного иммуноглобулинового препарата.
Методика доклинических испытаний биопрепаратов, разработанная в ходе выполнения работы совместно с сотрудниками ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, легла в основу разработки «Новые алгоритмы доклинических испытаний неинъекционных иммунобиологических препаратов и БАД», награжденной серебряной медалью VII Московского международного салона инноваций и инвестиций на ВВЦ (Москва) в 2007 г.
Положения, выносимые на защиту:
1. Критериями качества осадков Б как сырья для производства
комплексного иммуноглобулииового препарата являются концентрации общего
белка и иммуноглобулинов, распределение иммуноглобулинов по классам IgG,
IgA, IgM, титр антител к сальмонеллам, а также производный показатель,
характеризующий долю иммуноглобулинов от общего белка.
2. Разработанный способ получения комплексного иммуноглобулииового
препарата включает последовательную обработку гомогенизата осадка Б (III
фракция по Кону) хлороформом и сульфатом меди, выделение
иммуноглобулиновой фракции методом ультрафильтрации в присутствии
комплексообразующего соединения с последующим концентрированием и
возможным осаждением фракции полиэтиленгликолем, растворение осадка
иммуноглобулинов, стабилизацию и стерилизующую фильтрацию. {
3. Сухая субстанция комплексного иммуноглобулииового препарата
пригодна для приготовления капсульной и таблстированной форм с
использованием метода стерилизации у-облучением.
4. Комплексный иммуноглобулиновый препарат во флаконах, таблетках и
капсулах, приготовленный по разработанной технологии с использованием в
качестве фракционирующего агента сульфата меди, нетоксичен, безвреден и
обладает терапевтическим эффектом при лечении острой кишечной инфекции с
диарейным синдромом у обезьян.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора «Медицинская биотехнология», протокол № 3 от 10 июня 2009г.
Основные положения диссертационной работы доложены на: Российской конференции "Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях", Москва; 2000; научно-практической конференции «Медицина будущего», Краснодар-Сочи, 2002; Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы
использования», Москва, 2002; IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2002; 1-м международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2002; Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003; Научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения», Москва, 2003; XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства», Йошкар-Ола, 2005; Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», Сочи-Адлер, 2007.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, в том числе: 1 в издании, рекомендованном ВАК Российской Федерации, 2 - в периодических изданиях, 2 - в сборник научных трудов, 14 - в материалах конференций , 6 патентов на изобретение.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 152 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 8 рисунками. Список литературы включает 159 работ, в том числе 102 - отечественных и 57 - иностранных авторов.
Выражаю благодарность за помощь в проведении исследований сотруднику КДЦ МИИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора В.П. Насонову, сотрудникам лабораторий МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора: иммунобиологических препаратов (руководитель Л.И. Новикова), биопрепаратов и лекарственных форм (руководитель В.М. Лахтин), клинической лаборатории (руководитель О.В. Логунов), а также сотрудникам лаборатории инфекционной патологии (руководитель Э.К. Джикидзе) НИИ медицинской приматологии РАМН (директор академик РАМН Б.А.Лапин).
Иммуноглобулиновые препараты в медицине
Иммунная система человека - совокупность лимфоидных органов, тканей и клеток, обеспечивающая биохимическую, структурную и функциональную индивидуальность организма путем элиминации из него носителей чужеродной генетической информации [30].
Одну из ведущих ролей в работе иммунной системы человека играет иммунная система желудочно-кишечного тракта [153]. Известно, что пищеварительный тракт является местом постоянного контакта организма со множеством различных антигенов. Строение и функциональная особенность желудочно-кишечного тракта препятствует проникновению основной массы макромолекул во внутреннюю среду организма [49]. Именно иммунная система слизистых является первой «линией обороны» [107]. Пищевые антигены, а вместе с ними и другие чужеродные вещества и патогенные микроорганизмы постоянно воздействуют на слизистую оболочку органов пищеварения. Естественно, что на пути попадания пищи в организм формируются механизмы защиты от всего генетически чужеродного. К таким структурам относится само строение слизистых оболочек пищеварительной системы - ротовой полости, миндалин, желудка, тонкого и толстого кишечника [78].
Большой интерес в связи с этим представляют взаимодействия лимфоидной ткани с эпителиальным покровом органов пищеварительной системы. Лимфоидные клетки находятся в толще эпителиального покрова, в собственной пластинке слизистой оболочки и возле пищеварительных желез, представлены плазматическими клетками, лимфоцитами, макрофагами, тучными клетками, нейтрофилами [34]. Межэпителиальные лимфоциты слизистых оболочек рассматриваются Losonsky G.A. как иммунный аппарат, способный блокировать абсорбцию антигенов [121].
Имеются данные о способности лимфоцитов мигрировать из стенок органов пищеварительного канала в другие лимфоидные органы [108]. Антигены, попадая на слизистую поверхность пищеварительной системы, захватываются макрофагами, которые разрушают их, что ведет к освобождению антигенных детерминант [106]. Наличие макрофагов является необходимым условием для развития иммунной реакции [78]. После захвата антигена макрофаг проникает в эпителиальный покров [32]. Описаны контакты лимфоцитов с макрофагами в «проходах», образуемых ретикулярными эпителиальными клетками. Лимфоциты получают от макрофагов антигенную информацию, после чего пролиферируют в лимфоидных фолликулах. В результате образуются клоны клеток, имеющих специфическую иммунную направленность. В дальнейшем эти лимфоциты мигрируют обратно на поверхность эпителиального покрова [78], где начинают выработку антител. Таким образом слизистые мембраны снабжаются антителами [107]. В-клетки, находящиеся в собственной пластинке, являются главным источником; -иммуноглобулинов [119]. Основным классом иммуноглобулинов на поверхности слизистых является IgA, что составляет 70-90 % от всех синтезируемых иммуноглобулинов [78]. IgA антитела, которые способны проходить сквозь эпителий и посредством этого выделяться на поверхность слизистой пищеварительного тракта, захватывают антигены, что препятствует попаданию антигенов во внутреннюю среду человеческого организма. Это замечательное свойство IgA приобретает благодаря специфическому полимеру, секретируемому В-клетками, так называемому секреторному компоненту [107, 108]. Секреторный компонент (SC) является гликопротеином, который существует как трансмембранный протеин на базальной и латеральной плазматической мембране поверхностного эпителия желудочно-кишечного тракта [34]. При секреции IgA плазматическими клетками секреторный компонент действует как рецептор, после чего комплекс рецептор-лиганд (SC-Ig) транспортируется через апикальную плазматическую мембрану эпителия [125]. Прохождение через апикальную мембрану совпадает с расщеплением секреторного компонента и высвобождением секреторного димерного IgA на слизистую поверхность желудочно-кишечного тракта [107]. В добавление к этому антитела могут связываться с рецепторами на различных лейкоцитах, которые, как показано в некоторых экспериментальных системах [120], могут мигрировать как клетки памяти в экзокринные ткани [125]. Помимо этого антитела действуют и внутри клетки. Известно, что антитела могут нейтрализовать внутриклеточные вирусы, если инфицированные эпителиальные клетки находятся на пути их секреции. Это дает основу для использования моноклональных ангител при местном применении на поверхности слизистых для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний [120].
Материалы и реактивы
В качестве сырья для получения комплексного иммуноглобулинового препарата использовали осадок Б, представляющий собой балластный осадок, получаемый в процессе производства иммуноглобулина при фракционировании сыворотки или плазмы крови здоровых доноров этиловым спиртом при температуре ниже О С. Для фракционирования используют смесь сыворотки или плазмы не менее, чем от 1000 человек. Каждую индивидуальную сыворотку или плазму, входящую в состав смеси, проверяют на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), вирусу гепатита С и поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). I Осадки Б были получены с шести предприятий по производству препаратов крови: Областной станции переливания крови, г. Иваново; Предприятия по производству препаратов крови НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург; ОАО «Биомед» им И.И. Мечникова; ГУП по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского, г. Москва; Предприятия по производству бактерийных и Ї; иммунобиологических препаратов, г. Казань; Предприятия «Имбио», г. Нижний Новгород.
Для осаждения белков применяли полиэтиленгликоль (полиэтиленоксид) 4000 и 6000 (ТУ 2483-166005757587-2000 или ФС 42-1110-72), сульфат меди, сульфат цинка, хлороформ.
При анализе сырья и выделенной иммуноглобулиновой фракции использовали следующие реактивы:
1. моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам человека - IgG, IgM, IgA (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи);
2. сыворотку крови человека с известным содержанием иммуноглобулинов (Предприятие по производству бактерийных препаратов ЦНИИВС им. И.И. Мечникова); 3. антисыворотку ко всем белкам плазмы крови человека, полученную в лаборатории иммунобиологических препаратов МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского (руководитель лаборатории Л.И. Новикова);
4. сыворотку моноспецифическую против альбумина человека (ООО «Микрофлора» при МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского);
5. иммуноглобулин человека нормальный (ГУП по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского).
Для оценки качества полученного препарата использовался диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный О-антигенный жидкий (комплексный) по ФС 42-3408-97, диагностикум эритроцитарный шигеллезный Флекснера 1-5 антигенный жидкий по ФС 42-3403-97 (ГУП по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского).
Содержание липидных примесей определяли с помощью тест-системы ДЛЯ : определения общих липидов Bio-Laest (Lachema, Чехия).
На биохимическом анализаторе COBAS EMIRA с помощью тест системы POINTE SCIENTIFICINC и АРТЕС DIAGNOSTIC определяли: содержание альбумина - по реакции с бром-крезоловым зеленым; содержание холестерина - по реакции с холестериноксидазой; содержание трансферрина и церулоплазмина.
В работе использовали следующие реактивы: глицин, глюкозу, мальтозу, сахарозу, агарозу фирмы «Sigma», США; твин-20, агар фирмы «Difko», США; сульфат двухвалентного железа (ГОСТ 4148-78), сульфат аммония (ГОСТ 20478-75), калий йодистый (ГОСТ 4232-74), сульфат цинка (ГОСТ 4174-77), сульфат меди (ГОСТ 09565-78), амидо-черный 10В (ТУ 6-09-1962-72), соляную кислоту (ГОСТ 3118-77), серную кислоту (ОСЧ 11-5 ГОСТ 14262-78), уксусную кислоту (ГОСТ 61-75), хлористый натрий (ГОСТ 4233-77), веронал (ГФ X, стр.114), мединал (ТУ 6-09-2082-78), едкий натр (ГОСТ 11078-78), трихлоруксусную кислоту (ТУ6-09-2299-65), спирт этиловый ректификат (ГОСТ 5962-67).
Сравнительная оценка качественного состава осадков Б и выбор критериев их пригодности в качестве исходного сырья для получения КИП
В настоящее время комплексный иммуноглобулиновый препарат для перорального применения получают из "осадка Б". Осадок Б представляет собой "фракцию III по Кону", которая является побочным продуктом при производстве нормального иммуноглобулина человека из донорской плазмы крови, не содержащей антител к ВИЧ, HBsAg, гепатиту. Данный материал содержит иммуноглобулины основных классов IgG, IgA, IgM, примесные белки (аир обласні), липиды и липопротеиды.
В работе использовали осадки Б произведенные на шести предприятиях:
1. Предприятие по производству бактерийных и иммунобиологических препаратов, г. Казань
2. Областная станция переливания крови, г. Иваново і 3. ОАО «Биомед» им И.И. Мечникова, г. Красногорск
4. ГУП по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского, г. Москва
5. Предприятие по производству бактерийных и иммунобиологических препаратов, «Имбио», г. Нижний Новгород 1 6. Предприятие по производству препаратов крови НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург.
Осадки Б поступали в виде замороженных конгломератов массой 3-10 кг негомогенного состава. Для изучения качественного и количественного состава исходного сырья определяли следующие характеристики:
1) концентрацию общего белка (мг/мл) - биуретовым методом;
2) суммарную концентрацию иммуноглобулинов Elg (мг/мл) рассчитывали, суммируя концентрацию иммуноглобулинов трех классов, каждую из которых определяли методом радиальной имму но диффузии (РИД);
3) долю иммуноглобулинов от общего белка и долю примесных белков (%) рассчитывали, принимая за 100 % содержание общего белка;
4) распределение иммуноглобулинов (%) рассчитывали, определяя долю содержания каждого отдельного класса Ig от Elg, принятой за 100 %; 5) антисальмонеллезную активность (титр антител Т) определяли методом РПГА;
6) удельную активность находили как отношение параметра 1/Т к концентрации ig;
7) концентрацию общих липидов (мг/мл) определяли соответствующей тест системой.
Было изучено 29 осадков Б, из которых готовили пробы следующим образом: 100 г осадка, отобранного из разных мест конгломерата, гомогенизировали в 900 мл физиологического раствора (1:10) и центрифугировали в течение 20 мин со скоростью вращения ротора 6000 об/мин для удаления нерастворимых примесей. В надосадочной жидкости определяли вышеуказанные характеристики.
Из данных табл. 3.1 видно, что максимальная концентрация общего белка в пробах составляла 47,0 мг/мл, минимальная - 18,0 мг/мл. Суммарная концентрация иммуноглобулинов варьировалась в пределах 29,9 - 7,8 мг/мл. Максимальная доля иммуноглобулинов от общего белка составляла 63,0 % , минимальная - 37,0 %. При этом следует отметить, что максимальному содержанию белка чаще всего соответствовало и максимальное содержание иммуноглобулинов. В пробе с минимальным содержанием белка наблюдались минимальная концентрация суммарных иммуноглобулинов и минимальное содержание иммуноглобулинов в общем белке. Прослеживалась зависимость между концентрацией белка, концентрацией иммуноглобулинов и их долей к общему белку.
Похожие диссертации на Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата
