Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 16
1.Ломефлоксацин, как действующее вещество новой наносомальной ЛФ. Его физико-химические и терапевтические свойства. Методы получения и применения 16
1.1 Ломефлоксацин в клинической практике 16
1.2 Ломефлоксацин. Химическая структура.
Методы получения и физико-химические свойства 22
2 Наносомальная лекарственная форма.
Преимущества и недостатки. 28
2.2. Общие сведения о наночастицах 28
2.2.1. История открытия и изучения наночастиц 28
2.2.2. Механизм действия наносомальных препаратов 30
2.2.3. Требования, предъявляемые к наночастицам и их классификация 34
3. Полимеры, используемые для получения наночастиц. Классификация полимеров 35
3.1. Наночастицы, получаемые на основе полиалкилцианоакрилатов (ПАПА) 38
3.2 Наночастицы, получаемые на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот 42
4. Наносомальные лекарственные формы фторхинолонов на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. 49
5. Методы получения наночастиц на основе полимеров различных типов 54
5.1 Получение наночастиц путем эмульгирования 55
5.2. Получение наночастиц путем нанопреципитации 57
6. Методы изучения и контроля параметров полученных наночастиц 58
II Материал и методы 59
1.Получение наносомальных форм ЛВ. 60
1.1 Метод преципитации 60
1.2 Метод одинарных эмульсий 61
1.3 Метод двойных эмульсий 61
1.3.1 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием PLGA 50:50, PLGA 75:25 и PLA 63
1.3.2 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с изменением соотношения ЛВ:полимер 63
1.3.3 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием различных первичных растворителей для полимера и ЛВ , 64
1.3.4 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием различных режимов гомогенизации 65
1.4 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с применением противоиона 65
1.4.1 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с применением противоиона, вводимого совместно с ломефлоксацином 66
1.4.2 Метод двойных эмульсий, осуществляемый 67
с применением противоиона, вводимого совместно с полимером
1.5 Метод двойных эмульсий, осуществляемый с использованием в качестве ПАВ TWEEN-80, декстрана, альбумина и ПВС 68
1.6 Гельфильтрация наносомального препарата 69
2. Анализ полученных наночастиц 70
2.1 Тест на ресуспендируемость 70
2.2 Определение размера наночастиц 70
3.1 Качественное и количественное определение ломефлоксацина в наночастицах и в супернатанте 71
3.3.1 Спектрофотометрический способ определения ломефлоксацина. 71
3.3.1.1 Определение общего содержания ломефлоксацина в наносомальной ЛФ 71
3.3.1.2 Определение содержания свободного и связанного ломефлоксацина в наносомальной ЛФ 71
3.3.2 Определение ломефлоксацина методом ВЭЖХ 73
4. Исследование параметров высвобождения ломефлоксацина из лекарственной формы in vitro. Релиз. Проведение диализа наносомального препарата и чистого вещества 74
5. Изучение полученных наносомальных композиций in vitro и in vivo 75
5.1 Определение специфической активности 75
5.2 Определение острой токсичности 76
5.3 Релиз in vivo 77 5.4. Изучение распределения чистого и наносомального ломефлоксацина по органам и тканям in vivo 78
III Результаты и их обсуждение 79
1.1 .Влияние технологических параметров синтеза на свойства получаемых наночастиц 80
1.1.1 .Метод получения НЧ и его
влияние на свойства получаемой наносомальной ЛФ 81
1.1.2 Зависимость свойств получаемых НЧ от типа используемого полимера (бутилцианоакрилат, PLA, PLGA 50:50) 84
1.1.3 Зависимость свойств получаемых НЧ от природы полилактида
1.1.4 Зависимость свойств получаемых НЧ от соотношения ЛВ:полимер 88
1.1.5 Зависимость свойств получаемых НЧ от типа используемого стабилизатора эмульсии 94
1.1.6 Изучение зависимости степени сорбции ЛВ в НЧ от способа предварительного растворения ломефлоксацина 96
1.1.7 Изучение зависимости степени сорбции ЛВ в НЧ от способа предварительного растворения полимера 98
1.1.8 Зависимость свойств НЧ от введения в синтез в качестве противоиона гликохолата калия гидрохлорида 100
1.1.9. Изучение зависимости степени сорбции ЛВ в НЧ от режима первичной и вторичной гомогенизации 102
1.1.10 Изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени первичной гомогенизации ^
1.1.11. Изучение зависимости свойств получаемых НЧ от времени вторичной гомогенизации 108
1.1.12 Изучение зависимости свойств получаемых НЧ
от времени совместного перемешивания перед первичным гомогенизированием 111
1.1.13 Изучение зависимости свойств получаемых НЧ
от времени перемешивания перед вторичным гомогенизированием 114
1.2Изучение стабильности экспериментальной лекарственной формы, разработка методов анализа 116
1.2.1 Изучение стабильности ломефлоксацина 116
1.2.2 Изучение стабильности суспензии наночастиц 118
2.1. Результаты исследования параметров высвобождения ЛВ
из полимерной матрицы in vivo и in vitro; изучение специфической активности наносомального препарата 118
2.2. Определение специфической активности 118
2.3. Определение острой токсичности 120
2.4. Высвобождение ЛВ из полимерной матрицы in vitro в условиях равновесного диализа 121
2.5. Высвобождение ЛВ из полимерной матрицы in vivo 123
2.6 Изучение фармакокинетики наносомального ломефлоксацина в сравнении с чистой субстанцией ЛВ 126
Заключение 139
Выводы 142
Список литературы 143
- Наночастицы, получаемые на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот
- Метод двойных эмульсий, осуществляемый с применением противоиона, вводимого совместно с ломефлоксацином
- Зависимость свойств получаемых НЧ от типа используемого стабилизатора эмульсии
- Изучение фармакокинетики наносомального ломефлоксацина в сравнении с чистой субстанцией ЛВ
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время лечение внутриклеточных инфекций и опухолевых заболеваний является одной из наиболее важных проблем современной медицины. На пути решения этой проблемы возникает немалое количество трудностей, так как используемые лекарственные вещества (ЛВ) обладают невысокой эффективностью наряду со значительной токсичностью, и к ним быстро развивается бактериальная резистентность. Поиск новых более эффективных лекарственных средств (ЛС) - это длительный и весьма дорогостоящий процесс. В связи с этим актуальной проблемой является разработка новых лекарственных форм (ЛФ) для повышения эффективности уже имеющихся и активно использующихся в клинической практике субстанций. Одним из перспективных направлений повышения эффективности, снижения побочных эффектов ЛВ и преодоления лекарственной резистентности представляется использование полимерных наночастиц (НЧ). Также с помощью НЧ становится возможным контролировать высвобождение ЛВ, что позволит, во-первых, создать на их основе пролонгированные ЛФ, во-вторых, поддерживать внутриклеточную концентрацию ЛВ на оптимальном уровне.
Данная концепция была неоднократно подтверждена экспериментально, и в настоящее время имеется значительное количество работ по этой тематике, в частности, публикации о высокой эффективности наносомальных препаратов в лечении туберкулеза, опухолевых заболеваний и т. д.
Среди используемых для получения НЧ полимеров особый интерес представляют сополимеры молочной и гликолевой кислот (PLGA). НЧ из данного вида полимеров эффективно сорбируют различные ЛВ, быстро био деградируют, высвобождая ЛВ, обладают низкой токсичностью и хорошо выводятся из организма. Они также способны образовывать устойчивые коллоидные системы, пригодные для парентерального введения. Таким образом, НЧ из сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA) являются перспективным носителем для создания коллоидных систем доставки ЛВ.
При анализе литературных данных было выяснено, что наиболее часто встречающимися в научной литературе фтор хино лонами, используемыми для создания микро- и наносомальных ЛФ направленного действия, являются ципрофлоксацин и моксифлоксацин. Однако, еще не было сделано ни одной попытки создания наносомальной ЛФ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот такого фторхинолона, как ломефлоксацин. Ломефлоксацин является одним из наиболее активных современных антиактериальных препаратов группы фторхинолонов. Введение ломефлоксацина в состав НЧ позволит значительно изменить его свойства, существенно расширить антибактериальную активность и улучшить фармакокинетические свойства данного ЛВ. Наличие в молекуле ломефлоксацина двух атомов фтора и метильной группы в пиперазиновом ядре требует индивидуального подхода к созданию его наносомальной ЛФ, а также
разработки оригинальных методик его качественного и количественного определения как в составе наносомальной ЛФ, так и в биологических образцах. В виду изменения свойств данного ЛВ потребуется также тщательное изучение его специфической и антибактериальной активности и изменений в распределении по органам и тканям во времени.
Цель работы:
Целью данной работы является разработка биотехнологического получения ломефлоксацина, иммобилизованного на НЧ из биодеградируемых полимеров для повышения его эффективности, снижения выраженности побочных эффектов, а также обеспечения пролонгированного действия ЛВ.
Задачи:
-осуществить иммобилизацию ЛВ на НЧ и оптимизировать технологию синтеза наносомальной ЛФ.
-разработать методику качественного и количественного определения ломефлоксацина в наносомальной ЛФ, в биологических образцах. Изучить стабильность ломефлоксацина в условиях его иммобилизации на НЧ.
-изучить специфическую активность химиотерапевтического ЛП на выбранных моделях с использованием микроорганизмов в нативном состоянии, и после сорбции наНЧ.
- изучить скорость высвобождения ЛВ из матрицы полимера-носителя in vitro и in vivo (изучение пролонгированного эффекта).
-изучить распределение ЛВ по органам и тканям с целью выявления изменения фармакокинетических параметров ломефлоксацина, ассоциированного с полимерными НЧ, полученными на основе сополимеров молочной и гликолевой кислоты.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые разработан подход к созданию наносомальной ЛФ ломефлоксацина на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA), включающий в себя разработку оптимальных параметров синтеза для получения стабильной и воспроизводимой ЛФ, а также методики качественного и количественного определения ломефлоксацина в наносомальной ЛФ и в биологических образцах.
Впервые изучен механизм высвобождения лекарственного вещества из НЧ in vitro и in vivo и специфическая активность наносомальной ЛФ ломефлоксацина на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA).
Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения наносомальной ЛФ ломефлоксацина, могут быть использованы при создании других наносомальных препаратов.
Результаты изучения механизма высвобождения ЛВ из НЧ in vitro и in vivo, а также результаты изучения распределения наносомального ломефлоксацина по органам и
тканям могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы ломефлоксацина.
Связь Цели и задач исследования с федеральными целевыми программами РФ.
Работа выполнена в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова на кафедре биологической химии лечебного факультета в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по приоритетному направлению «Индустрия наносистем и материалов»
Основные положения, выносимые на защиту.
Принципиальная возможность создания наносомальной ЛФ ломефлоксацина, получаемой на основе биодеградируемых полимеров и обладающей повышенной эффективностью, менее выраженными побочными эффектами, а также обеспечивающей пролонгированное действие ЛВ.
Иммобилизованный на НЧ ломефлоксацин сохраняет, а в случае с некоторыми микроорганизмами даже увеличивает анибактериальную активность.
Иммобилизация ломефлоксацина на НЧ приводит к его перераспределению по органам и тканям живого организма.
Личный вклад автора
Соискатель самостоятельно провела все эксперименты по получению НЧ с иммобилизованным на них ломефлоксацином, в динамике оценила перераспределение ЛВ по органам и тканям в сравнении с контролем. Интерпретация полученных результатов и их статистическая обработка также осуществлены автором.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на следующих конференциях, конгрессах и научных школах:
Всероссийская научная школа для молодежи «Наномедицина и нанотоксикология» 2009
VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2009
Итоговая научная конференция молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» 2010
XVII Российский национальный конгресс «Человек и Лекарство» 2010
VII международная конференция РАН «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2010
Работа была награждена в 2010 году дипломом как лучшая научно-исследовательская работа в области диагностики и терапии социально-значимых заболеваний на основе достижений молекулярной медицины в рамках VII международной конференции РАН «Молекулярная медицина и биобезопасность».
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ (3 из них - в рецензируемых журналах из списка ВАК, 6 - тезисы докладов)
Структура и объем диссертации.
Наночастицы, получаемые на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот
Полилактиды - биодеградирующие полимеры, активно используемые для создания систем доставки лекарств. Термин полилактиды включает в себя не только поли(Ь-лактид) (PLLA) и поли(ОЬ-лактид), но также поли(гликолид) (PGA) и значимые сополимеры, такие как поли(лактид-ко-гликолид) (PLGA) Все полилактиды могут быть получены двумя способами:
- синтетическим путем
- путем фермантативного брожения дестрозы сахара или мальтозы, сусла зерна или картофеля, которые являются возобнавляемым сырьем биологического происхождения. Начало биомедицинского применения полилактидов датируется 60-ми годами прошлого века [11, 24, 28, 29, 32, 37, 39, 47, 51, 56, 60, 65, 66, 71, 85, 87, 90, 94] Эти полимеры начали использоваться и широко используются до сих пор в качестве хирургического материала, такого, например, как шовный материал, импланты костей и т. д. С недавних пор этот полимер стали изучать относительно его пригодности к транспорту тех или иных ЛВ. Следует отметить также, что и в качестве хирургического материала, и в качестве вещества, призванного обеспечить направленный транспорт ЛВ, сополимер молочной и гликолевой кислот был неоднократно проверен на токсичность. По результатам многих исследований каких либо значимых токсических эффектов, связанных с этими полимерами не отмечено (Oil). В ответ на введение подобных материалов в организм отмечаются минимальные локальные воспалительные реакции, снижающиеся с течением времени. В табл.1 описаны свойства и применение наиболее известных и широкоиспользуемых полилактидов. [43, 81, 26]
Использование лактидов в качестве полимера-носителя стало возможным благодаря следующим определенным свойствам данных соединений:
а) способность образовывать стабильные микро- и наночастицы,
б) образование пленок на границе раздела фаз,
в) эффективная сорбция в полимерную матрицу ЛВ различной физико химической природы и фармакологических свойств.
г) отсутствие выраженных токсических эффектов и полная метаболизация в организме. Наночастицы могут быть получены в результате смешивания водных и органических растворителей, содержащих лактиды и ЛВ, и последующего удаления сначала органической, а затем водной фаз.
Высвобождение ЛВ из наночастиц происходит в результате гидролиза. ЛВ выходит из полимерной матрицы неизмененным и способно оказать ожидаемый терапевтический и фармакологический эффекты. Введение в организм лекарственной субстанции в наносомальной лекарственной форме позволяет осуществлять механизм направленного транспорта и добиться необходимых концентраций ЛВ непосредственно в органе-мишени. Высвобождение ЛВ из НЧ происходит по мере гидролиза полимерной матрицы. Абсорбируемая полимером в среде или клеточном буфере вода взаимодействует с эфирными связями и разрушает полимер вдоль оси. Одна гидроксильная и одна карбоксильная группа образуют сложноэфирные связи, а затем хаотично гидролизуется вдоль полимерной оси. Первоначально образуются относительно малые водорастворимые фрагменты и длинноцепочечные полимеры расщепляются до коротких фрагментов. В результате уменьшение в молекулярной массе ведет к увеличению гидрофильноти с небольшим изменением физических свойств или массы полимера, изначально. В процессе последующей деградации уменьшение молекулярной массы приводит к дальнейшему изменению физических свойств и образованию водорастворимых фрагментов. Эти фрагменты отрываются от полимера и неминуемо подвергаются гидролизу до молочной кислоты, которая включается в цикл трикарбоновых кислот и утилизируется в виде оксида углерода и воды. [92]
Метод двойных эмульсий, осуществляемый с применением противоиона, вводимого совместно с ломефлоксацином
В 3 мл хлороформа растворяли при перемешивании на магнитной мешалке (IKA RH-KT/C, ФРГ) 250 мг полилактидгликолида. Ломефлоксацин в количестве 25 мг был предварительно переведен в форму основания и растворен в 2 мл НгО при перемешивании на магнитной мешалке. В водный раствор ломефлоксацина были внесены также 25 мг противоиона гликохолата натрия гидрат. Растворы PLGA в хлороформе и ломефлоксацина с противоионом в воде перемешивали по отдельности 15 мин, после чего с помощью микропипетки к раствору полилактидгликолида добавляли раствор ломефлоксацина при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Полученную смесь интенсивно перемешивали ещё 10 мин. После этого подвергали гомогенизации при 24 тыс. об./мин погружным диспергатором (гомогенизатором) Ultraurrax Т-25 (IKA , ФРГ) с помощью диспергирующего элемента (S 10N-S 10 F) 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин. Полученную гомогенизированную смесь вносили микропипеткой в 15 мл водного р-ра ПВС 1%. Смесь интенсивно перемешивали ещё 20 мин. После этого подвергали гомогенизации при 24 тыс. об./мин погружным диспергатором (гомогенизатором) Ultraurrax Т-25 (IKA, ФРГ) с помощью диспергирующего элемента (S 25 N 25 F) 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин. Органический растворитель из полученной смеси удаляли в течение 15-20 минут на роторном испарителе LABAROTA 4000-efficient при небольшом вакууме (80-500 мм.рт.ст.) и температуре воды в бане 35С под постоянным контролем, так как существует возможность сильного вспенивания массы. Полученную суспензию фильтровали через стеклянный фильтр (пор. 40- -110 мкм) в круглодонную колбу на 250 мл. Колбу с фильтратом дополнительно вакуумировали с помощью водоструйного насоса для удаления остатков хлороформа. К полученному коллоидному раствору добавляли 150 мг D-маннита и замораживали в бане с жидким азотом. Затем сушили на лиофильной сушке HETOSICC (Heto Ltd., Denmark) при 0.3-K.5 мБар в течение 20 ч.
В 3 мл хлороформа растворяли при перемешивании на магнитной мешалке (IKA RH-KTVC, ФРГ) 250 мг полилактидгликолида. Также в этом растворе суспендировали 25 мг гликохолата натрия гидрата в качестве противоиона. Ломефлоксацин в количестве 25 мг был предварительно растворен в 2 мл НгО при перемешивании на магнитной мешалке (IKA RH-КТ/С, ФРГ). Ломефлоксацин и противоион для данной методики были взяты в виде оснований. Обе смеси (раствор ЛВ и раствор полимера с противоионом) перемешивали по отдельности 15 мин, после чего с помощью микропипетки к раствору PLGA с противоионом добавляли раствор ломефлоксацина при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Полученную смесь интенсивно перемешивали ещё 10 мин. После этого подвергали гомогенизации при 24 тыс. об./мин погружным диспергатором (гомогенизатором) Ultra- Turrax Т-25 (IKA, ФРГ) с помощью диспергирующего элемента (S 10N-S 10 F) 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин. Полученную гомогенизированную смесь вносили микропипеткой в 15 мл водного растворара ПВС 1%. Смесь интенсивно перемешивали ещё 20 мин. После этого подвергали гомогенизации при 24 тыс. об./мин погружным диспергатором (гомогенизатором) Ultraurrax Т-25 (IKA, ФРГ) с помощью диспергирующего элемента (S 25 N 25 F) 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин. Гомогенизат нагревали в открытом химическом стакане на водяной бане (45 С) при интенсивном перемешивании с помощью механической лопастной мешалки с приводом RW 20 (IKA, ФРГ) для удаления хлороформа (1 ч). Полученную суспензию фильтровали через стеклянный фильтр (пор. 40-И 10 мкм) в круглодонную колбу на 250 мл. Колбу с фильтратом дополнительно вакуумировали с помощью водоструйного насоса для удаления остатков хлороформа. К полученному коллоидному раствору добавляли 150 мг / маннита и замораживали в бане с жидким азотом. Затем сушили на лиофильной сушке HETOSICC (Heto Ltd., Denmark) при 0.3-4.5 мБар в течение 20 ч.
В 3-5 мл хлороформа растворяли при перемешивании на магнитной мешалке (IKA RH-KT/C, ФРГ) 250 мг PLGA. В 2-5 мл Н20 или 0,01 м водном растворе НС1 растворяли при перемешивании на магнитной мешалке 25-36 мг ломефлоксацина. Растворы перемешивали по отдельности 15 мин, после чего с помощью микропипетки к раствору полилактидгликолида добавляли раствор ломефлоксацина при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Полученную смесь интенсивно перемешивали ещё 10 мин. После этого подвергали гомогенизации при 24 тыс. об./мин погружным диспергатором (гомогенизатором) Ultraurrax Т-25 (IKA, ФРГ) с помощью диспергирующего элемента (S 10N-S 10F)3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин. Полученную гомогенизированную смесь вносили микропипеткой в 10-20 мл водного свежеприготовленного 1% раствора ПАВ. Смесь интенсивно перемешивали ещё 20 мин. После этого подвергали гомогенизации при 24 тыс. об./мин погружным диспергатором (гомогенизатором) Ultraurrax Т-25 (IKA, ФРГ) с помощью диспергирующего элемента (S 25 N 25 F) 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин. Органический растворитель из полученной смеси удаляли в течение 15-20 минут на роторном испарителе LABAROTA 4000-efficient при небольшом вакууме (80-500 мм.рт.ст.) и температуре воды в бане 35С под постоянным контролем, так как существует возможность сильного вспенивания массы. Полученную суспензию фильтровали через стеклянный фильтр (пор. 40-410 мкм) в круглодонную колбу на 250 мл. Колбу с фильтратом дополнительно вакуумировали с помощью водоструйного насоса для удаления остатков хлороформа. К полученному коллоидному раствору добавляли 150 мг D-маннита и замораживали в бане с жидким азотом. Затем сушили на лиофильной сушке HETOSICC (Heto Ltd., Denmark) при 0.3 -1.5 мБар в течение 20 ч.
Метод хроматографической очистки с помощью гельфильтрации был использован с целью отделения НЧ от несорбированного на них ЛВ. Для этого была использована колонка, упакованная Sephadex-G-15 (Pharmacia, Sweden) в режиме быстрого обессоливания. Для подготовки колонки к работе был проделан ряд следующих операций: 5,0 мг 8ерї ех-С-25медленно вносили в 50 мл Н2О и перемешивали вертикальной мешалкой при комнатной температуре в течение 1 ч. После оседания взвеси проводили процедуру «отмучивания» 2 раза (слой воды с неосевшими мельчайшими частицами удаляли, затем вновь добавляли дистиллированную воду до прежнего объема; процедуру проводт до пролного исчезновения мелких инертных частиц.) Колонку размером 25 см X 1,5 см (в диаметре) упаковывали при объемной скорости 20 мл/г/см (1 мл/мин). Далее готовую колонку при той же объемной скорости переводили в 10 мМ буфер бикарбонат-аммония рН 8.
100 мг образца НЧ в течение 10 мин перемешивали на магнитной мешалке в 2 мл 10 мМ бикарбонат-аммониевого буфера рН 8 и наносили на подготовленную колонку. Элюцию проводили тем же буфером при объемной скорости 20 мл/г/см (1 мл/мин). Фракцию препарата собирали в свободном объеме. Регистрацию осуществляли при 282 нм спектрофотометрически. Объем собранной фракции составлял 10 мл. Отделение НЧ от несорбированного ломефлоксацина в этих условиях было полностью достигнуто. В дальнейшем очищенный препарат (очищенные НЧ) лиофильно высушивались. 2. Анализ полученных наночастиц.
Полученные НЧ оценивались по размеру, степени включения ЛВ в НЧ и скорости его высвобождения в водных средах. Также была оценена их эффективность in vivo и in vitro. Анализ полученных наночастиц проводился с помощью различных физико-химических методов. Качественное и количественное определение ломефлоксацина в качестве действующего вещества проводилось с помощью спектрофотометрии в уф-области и ВЭЖХ. Размер получаемых наночастиц изучали с помощью фотонной электронной спектроскопии.
Брали навеску лиофилизированных наночастиц массой 10 мг, добавляли 50 мкл дистиллированной воды, закрывали пробкой и тщательно встряхивали в течение нескольких минут. Ресуспендируемость контролировали визуально: нормальный образец при добавлении воды образует коллоидный опалесцирующий раствор без осадка и видимых агломератов. Взвесь наночастиц не осаждается в течение продолжительного количества времени (около 24 часов).
Зависимость свойств получаемых НЧ от типа используемого стабилизатора эмульсии
При прочих равных условиях использовались различные ПАВы для стабилизации эмульсии: 1% водный растворы TWIN-80, декстрана, альбумина, ПВС.
Из таблицы № 8 и графиков № 11, 12 видно, что наилучший результат был получен при использовании в качестве стабилизатора поливинилового спирта; при этом степень сорбции ЛВ в полимерную матрицу составила 42%±0,57, а размер полученных НЧ 246нм±7,21. В случае применения TWIN-80 и декстрана частицы не были получены вовсе из-за возникновения агрегации и образования относительно крупных конгломератов. В качестве примера приведена схема получения наночастиц с использованием водного раствора альбумина.
Следует отметить, что при попытке использовать в качестве стабилизирующего эмульсию вещества TWEEN-80, частицы не были получены вовсе. В процессе упаривания органического растворителя вместо частиц образовывались бесформенные крупные конгломераты полимера. Все сравниваемые в данном случае образцы получались с помощью 1% растворов указанных ПАВов.
В ходе исследовательской работы ломефлоксацин растворялся либо в дистиллированной воде, либо в водном растворе 0,01 м НС1 (метод двойных эмульсий), либо непосредственно в водном растворе 1% PVA (ПВС) (метод преципитации).
Наилучшие результаты были достигнуты при получении НЧ методом двойных эмульсий с использованием в качестве первичного растворителя для ломефлоксацина раствора 0,01 М НС1. Степень сорбции ЛВ в полимерную матрицу при этом составила 42%±0,57, а размер полученных НЧ 246нм±7,21. Следует отметить также, что при получении НЧ методом двойных эмульсий, но с использованием в качестве первичного растворителя для ломефлоксацина НгОдист. и при получении НЧ методом преципитации, где в качестве первичного растворителя был взят 1% раствор PVA, были получены практически идентичные результаты, т.е. были получены НЧ практически одинаковые по размеру с незначительно различающейся степенью сорбции ЛВ). Для НЧ, полученных методом двойных эмульсий с использованием в качестве первичного растворителя для ломефлоксацина Н20дист. степень сорбции ЛВ составила 7%±0,57, а размер НЧ 245нм±3,60. Для НЧ, полученных методом преципитации, где в качестве первичного растворителя был взят 1% раствор PVA степень сорбции ЛВ составила 10%±1.
1.1.7 Изучение зависимости степени сорбции ЛВ в НЧ от способа предварительного растворения полимера.
В качестве первичных растворителей для полимера использовали хлороформ, хлористый метилен и ацетонитрил. Растворители выбирались исходя из свойств полимера и метода получения НЧ. Все первичные растворители сополимера молочной и гликолевой кислот являются органическими растворителями, так как данный полимер не растворяется, в отличие от ЛВ, в водной фазе. Подобное свойство полимера дает некоторое преимущество при его использовании, так как становится возможным осуществление следующей последовательности событий: раствор полимера при добавлении к водному раствору ЛВ провоцирует образование наночастиц, а ЛВ, растворённые в воде, оказываются вовлечёнными внутрь частиц в процессе формирования полимерной матрицы. Используемые растворители уже были применены некоторыми исследователями ранее для получения полимерных НЧ, но в несколько иных условиях и с другими ЛВ. иацетон ацетонитрил хлороформ хлористый метиленпреципитация метод двойныхэмульсийТип первичного растворителя полимера
У образцов, полученных методом преципитации и представленных на графике № 15 все прочие условия синтеза совпадали. Более подробно получение НЧ методом преципитации описано в п. 1.1.
У образцов, полученных методом двойных эмульсий и представленных на графике № 15 все прочие условия синтеза также полностью совпадали. Более подробно получение НЧ методом преципитации описано в п. 1.3.
Для получения НЧ методом одинарных эмульсий (п. 1.2) в качестве первичного растворителя всегда использовался только хлороформ.
Сравнение образцов, полученных с использованием хлороформа, но разными методами не целесообразно, так как это не даст объективного результата в виду большого числа несовпадающих параметров синтеза.
На графике № 15прежде всего предлагается сделать сравнение между образцами, полученными одним и тем же методом, но с использованием различных первичных растворителей. Из рисунка видно, что наилучший результат был достигнут при использовании хлороформа, как в случае получения НЧ методом преципитации, так и в случае получения НЧ методом двойных эмульсий, так как в данном случае степень сорбции ЛВ была максимальной. Однако, из рисунка видно также, что применение хлороформа и использование метода двойных эмульсий даст возможность получить НЧ с лучшими характеристиками.
Изучение фармакокинетики наносомального ломефлоксацина в сравнении с чистой субстанцией ЛВ
В данном разделе научно-исследовательской работы было изучено распределение ломефлоксацина в виде субстанции и наносомальной ЛФ по различным органам и тканям в зависимости времени, прошедшего с момента однократного перорального приема. Полученные результаты представлены в таблице №18Основные фармакокинетические константы субстанции ломефлоксацина и ломефлоксацина, ассоциированного с полимерными наночастицами, обработаны с помощью двухчастевой математической модели и представлены втаб.№ 19.
Для характеристики изменения концентрации ломефлоксацина в крови и органах крыс во времени рассчитывали интегральный показатель площади под фармакокинетической кривой. Процент от дозы рассчитывали, исходя из значений масс органов (как правило, масса навески составляла 1,8-2,1 г органа). Объем крови принимали равным 7% от массы животного.
Адекватность выбранной модели для описания распределения исследуемых препаратов в организме экспериментальных животных подтверждаются полученными графиками, из которых следует, что фармакокинетическая зависимость, построенная по экспериментальным данным, практически полностью совпадает с зависимостью, моделирующей типичную кинетику второго порядка (двухчастевая математическая модель фармакокинетики).
Как видно из представленных данных, фармакокинетические константы, а именно время полувыведения (Т /г) и среднее время удерживания (MRT) антибиотика, связанного с наночастицами, увеличилось по сравнению с константами антибиотика сравнения в случаях с некоторыми органами в 3,2
Основные фармакокинетические константы субстанции ломефлоксацина и ломефлоксацина, ассоциированного с полимерными наночастицами, обработаны с помощью двухчастевой математической модели и представлены втаб.№ 19.
Для характеристики изменения концентрации ломефлоксацина в крови и органах крыс во времени рассчитывали интегральный показатель площади под фармакокинетической кривой. Процент от дозы рассчитывали, исходя из значений масс органов (как правило, масса навески составляла 1,8-2,1 г органа). Объем крови принимали равным 7% от массы животного.
Адекватность выбранной модели для описания распределения исследуемых препаратов в организме экспериментальных животных подтверждаются полученными графиками, из которых следует, что фармакокинетическая зависимость, построенная по экспериментальным данным, практически полностью совпадает с зависимостью, моделирующей типичную кинетику второго порядка (двухчастевая математическая модель фармакокинетики).
Как видно из представленных данных, фармакокинетические константы, а именно время полувыведения (Т /г) и среднее время удерживания (MRT) антибиотика, связанного с наночастицами, увеличилось по сравнению с константами антибиотика сравнения в случаях с некоторыми органами в 3,2 раза, что свидетельствует о наличии пролонгированного эффекта у наносомального ломефлоксацина. Приведенные в таблице №19 фармакокинетические константы будут проанализированы далее для каждого из исследуемых органов отдельно.
Как видно из графика № 30 фармакокинетические кривые субстанции ЛВ и ее наносомальной формы резко различаются между собой. В случае однократного перорального введения субстанции ломефлоксацина, его концентрация в печени возрастает до максимума через 2 часа и быстро спадает практически до нуля. В случае применения наносомальной лекарственной формы резкого скачка концентрации не наблюдается, определенный концентрационный уровень антибиотика поддерживается на протяжении всего изучаемого временного отрезка. О пролонгации нахождения антибиотика в исследуемом органе свидетельствует изменение среднего времени удержания (MRT), для наносомальной ЛФ этот показатель выше в 2,85 раза, а также площадь под фармакокинетической кривой (AUC), для наносомальной ЛФ этот показатель выше в 1,78 раза. Время полувыведения у испытуемого образца и контроля также значительно различалось. Для наносомальной ЛФ ломефлоксацина Т]/2 составило 8,85 часа, а для субстанции ЛВ 2,13 часа. Показатели клиренса, константы характеризующей способность организма к элиминации (удалению) препарата, в данном случае также различаются более чем в 2 раза, что также указывает на более длительное присутствие ЛВ в печени по сравнению с чистым веществом.
