Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Коллоидные системы доставші лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц 11
1.1. Технология 13
1.2. Распределение наночастиц в организме 17
1.3. Распределение наночастиц в условиях патологии: эффект EPR 24
1.4. Химиотерапия экспериментальных опухолей 27
1.5. Активный транспорт с помощью наночастиц 30
1.6. Лечение экспериментальных внутриклеточных инфекций 36
1.7. Заключение 38
2. Разработка и исследование наносомальной формы доксорубицина для лечения глиобластомы 39
2.1. Состояние проблемы и актуальность 39
2.2. Разработка наносомальной формы доксорубицина на основе полибутилцианоакрилата
2.2.1. Устойчивость доксорубицина в условиях получения наночастиц 47
2.2.2. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы доксорубицина 49
2.3. Исследование биораспределения наносомальной формы доксорубицина 56
2.3.1. Биораспределение наносомального доксорубицина 55
2.3.2. Биораспределение [14С]-полибутилцианоакрилатных наночастиц 64
2.4. Изучение противоопухолевой активности наносомальных форм
доксорубицина в отношении интракраниальной глиобластомы 101 /8 у крыс 73
2.5. Влияние технологических параметров на противоопухолевую активность наносомальных форм доксорубицина 79
2.6. Углубленные исследования противоопухолевой активности наносомального доксорубицина в отношении глиобластомы 101/8 87
2.7. Токсикологическое исследование наносомальной формы доксорубицина 93
2.7.1. Исследование острой токсичности 93
2.7.1.1. Ненагруженные ПБЦА наночастицы (плацебо) 94
2.7.1.2. Наносомальные формы доксорубицина 97
2.7.2. Исследование субхронической токсичности 100
2.7.3. Заключение
2.8. Исследование механизма доставки лекарственных веществ в мозг 122 с помощью наночастиц
2.9. Радиационная стерилизация наносомальной формы доксорубицина 144
2.10. Заключение 155
3. Разработка и исследование наносомальных форм рифампицина 159
3.1. Состояние проблемы и актуальность 159
3.2. Влияние технологических параметров на физико-химические свойства полимерных наночастиц, содержащих рифампицин 161
3.2.1. Полибутилцианоакрилатные наночастицы 161
3.2.2. Полилактидные наночастицы 165
3.2.3. Исследование кинетики высвобождения рифампицина из наночастиц 173
3.3. Влияние состава наносомальной формы рифампицина на его биораспределение 177
3.3.1. Внутривенное введение 177
3.3.1.1. Наносомальная форма на основе 177 полибутилцианоакрилатных наночастиц
3.3.1.2. Наносомальные формы на основе полилактидов 181
3.3.1.3. Оптимизация биораспределения наносомальных форм рифампицина при внутривенном введении
3.3.2. Пероральное введение 199
3.3.3. Подкожное введение 205
3.4. Активность наносомальной формы рифампицина в отношении внутриклеточных бактерий in vitro 208
3.5. Оценка эффективности наносомальных форм рифампицина на модели экспериментального туберкулеза у мышей 209
3.5.1. Внутривенное введение 210
3.5.1.1. Полибутилцианоакрилатные наночастицы 211
3.5.1.2. Наночастицы на основе полилактидов 215
3.5.2. Пероральное и подкожное введение 217
3.6. Оценка эффективности наносомальной формы рифампицина при лечении острых бактериальных инфекций 218
3.7. Заключение 220
4. Разработка и исследование наносомальных форм стрептомицина 223
4.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы стрептомицина 223
4.2. Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели острой септической инфекции 231
Разработка и исследование наносомальной формы моксифлоксацина 231
5.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы моксифлоксацина 233
5.2. Исследование наносомальной формы моксифлоксацина на культуре макрофагов ТНР-1 238
5.2.1. Оценка цитотоксического действия наночастиц 239
5.2.2. Кинетика накопления моксифлоксацина в макрофагах 240
5.2.3. Оценка активности наносомального моксифлоксацина в отношении М. tuberculosis, локализованных в макрофагах ТНР-1 243
5.3. Эффективность наносомального моксифлоксацина при лечении экспериментального туберкулеза у мышей 247
Материалы и методы 250
6.1. Получение наносомальной формы доксорубицина 250
6.2. Исследование биораспределения наносомальной формы доксорубицина 253
6.3. Исследование биораспределення [14С]-полибутилцианоакрилатных наночастиц 254
6.4. Экспериментальная модель опухоли мозга 255
6.5. Оценка проницаемости гематоэнцефалического барьера у крыс с интракраниально имплантированной глиобластомой 101/8 256
6.6. Оценка противоопухолевой активности на модели интракраниальной глиобластомы 101/8 у крыс 256
6.7. Оценка острой токсичности наносомальной формы доксорубицина 257
6.8. Оценка субхронической токсичности наносомальной формы доксорубицина 257
6.9. Определение белков плазмы, адсорбированных на поверхности ПБЦА наночастиц методом двухмерного электрофореза
в полиакриламидном геле (2-D PAGE) 262
6.10. Радиационная стерилизация наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА наночастиц 263
6.11. Получение наносомальной формы рифампицина на основе полибутилцианоакрилата 267
6.12. Получение наносомальной формы рифампицина на основе полилактидов 268
6.13. Биораспределение наносомального рифампицина 271
6.14. Определение активности наносомальной формы рифампицина в отношении внутриклеточных бактерий in vitro 273
6.15. Определение накопления наносомальной формы рифампицина в легочных макрофагах кролика 274
6.16. Исследование антибактериального эффекта наносомального рифампицина на модели экспериментального туберкулеза у мышей 275
6.17. Оценка эффективности наносомальной формы рифампицина при лечении острых бактериальных инфекций 276
6.18. Получение наносомальной формы стрептомицина 277
6.19. Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели септической инфекции у мышей 278
6.20. Получение наносомальной формы моксифлоксацина 278
6.21. Исследование антибактериального эффекта наносомального моксифлоксацина на модели экспериментального туберкулеза у мышей 280
Выводы 281
Список литературы
- Лечение экспериментальных внутриклеточных инфекций
- Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы доксорубицина
- Влияние технологических параметров на физико-химические свойства полимерных наночастиц, содержащих рифампицин
- Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели острой септической инфекции
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная фармакотерапия располагает арсеналом мощных лекарственных средств, однако результаты лечения часто остаются неудовлетворительными. Среди факторов, снижающих эффективность лекарственных веществ (ЛВ), следует отметить неблагоприятное биораспределение, которое может быть обусловлено трудностями при проникновении в очаг патологии. Причинами этого могут быть затрудненный доступ в орган-мишень из-за структурных особенностей тканей (например, из-за наличия гистогематических барьеров) или недостаточный внутриклеточный транспорт ввиду физико-химических свойств ЛВ. Тривиальным способом преодолеть эти препятствия и повысить эффективность лечения является увеличение дозы ЛВ. При этом терапевтический эффект часто достигается ценой повышения неспецифической токсичности. Проблема приобретает особую остроту в случае сильнодействующих ЛВ, таких как, например, противоопухолевые агенты и антибиотики, применение которых сопряжено с побочными эффектами, выраженными настолько, что они значительно снижают терапевтическую ценность этих препаратов. Актуальность этой проблемы послужила стимулом для разработки подходов к созданию разнообразных систем направленной доставки ЛВ. Особый интерес среди таких систем представляют полимерные наночастицы (НЧ), то есть частицы размером от 10 до 1000 нм, сочетающие такие важные для носителей качества, как стабильность и высокая емкость в отношении широкого спектра ЛВ.
К настоящему времени можно считать доказанным, что включение в НЧ может существенно изменять профиль распределения ЛВ в организме, и накоплен значительный опыт по разработке и исследованию наносомальных форм различных ЛВ. Однако некоторые аспекты этой технологии изучены недостаточно. Так, несмотря на очевидную целесообразность использования НЧ для доставки антибиотиков, систематические исследования в этой области не проводились. Транспорт НЧ через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) к началу данного исследования также оставался практически неизученным.
Цель работы состояла в выявлении закономерностей, определяющих способность полимерных НЧ влиять на фармакологическое действие различных антибиотиков. В частности, представлялось необходимым изучить влияние состава наносомальных форм на параметры биораспределения антибиотиков. Преодоление ГЭБ является важнейшей проблемой химиотерапии; в связи с этим одна из наиболее существенных задач состояла в изучении возможности использования полибутилцианоакрилатных (ПБЦА) НЧ для доставки
противоопухолевого антибиотика доксорубицина через ГЭБ в мозг и оценке эффективности наносомальной формы доксорубицина на модели интракраниальной глиобластомы. Наконец, для достижения цели исследования необходимо было изучить влияние наносомальной формы на активность антибактериальных антибиотиков в отношении экспериментальных инфекций, в том числе туберкулеза.
Научная новизна
1. Впервые выявлены закономерности, позволяющие осуществить
направленный транспорт антибиотиков, связанных с полимерными
наночастицами, через гематоэнцефалический барьер.
2. Разработана технология получения наносомальной формы
доксорубицина на основе ПБЦА НЧ. Изучено влияние условий полимеризации
на свойства наночастиц. Изучено влияние состава наночастиц на
биораспределение и противоопухолевый эффект доксорубицина.
3. Показано, что модификация ПБЦА НЧ полисорбатом 80, позволяет
доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации доксорубицина
при внутривенном введении. При этом связанный с наночастицами
доксорубицин после внутривенного введения проникает в мозг так, как если бы
он не был защищен ГЭБ.
4. Показано, что наносомальная форма доксорубицина оказывает
выраженное противоопухолевое действие на интракраниальную глиобластому
у крыс, тогда как его стандартная лекарственная форма малоэффективна.
Выявлено влияние состава наночастиц на фармакологический эффект.
-
На примере доксорубицина и лоперамида показано, что модификация ПБЦА НЧ полоксамером 188 (Pluronic F68) позволяет при внутривенном введении доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации ЛВ, не способных преодолеть ГЭБ в свободном виде.
-
Впервые изучена сорбция белков плазмы на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных доксорубицином и модифицированных полоксамером 188 или полисорбатом 80, и найдена корреляция между профилями сорбции белков и фармакологическим эффектом наносомальных форм. Предложен новый механизм транспорта НЧ через ГЭБ, основанный на взаимодействии аполипо-протеина A-I, найденного на поверхности НЧ, со скавенджер-рецептором SR-BI, экспрессируемым эндотелиальными клетками капилляров мозга.
-
Показано, что наносомальная форма доксорубицина на основе ПБЦА НЧ обладает радиационной устойчивостью, то есть может быть стерилизована радиационными методами.
8. Разработана технология получения наносомальных формы
антибактериальных антибиотиков - рифампицина, моксифлоксацина и
стрептомицина. На примере наносомальных форм рифампицина изучено
влияние структуры полимера на кинетику выделения ЛВ из наночастиц.
-
Впервые изучено влияние модификации наночастиц поверхностно-активными веществами (ПАВ) на фармакокинетику рифампицина и его распределение по органам. Показано, что влияние ПАВ на распределение наночастиц зависит от типа полимера.
-
Показана возможность снижения терапевтических доз рифампицина и моксифлоксацина при лечении экспериментального туберкулеза путем создания наносомальных форм этих антибиотиков.
-
Показана высокая эффективность наносомальных форм антибиотиков различных классов - рифампицина и стрептомицина - при лечении острых бактериальных инфекций.
-
Предложен и реализован на примере наносомальной формы лоперамида и паклитаксела в ПБЦА НЧ подход, позволяющий значительно повысить содержание в водной фазе нерастворимых в воде субстанций.
Практическая значимость
1. Показано, что, в отличие от стандартной лекарственной формы
доксорубицина, его наносомальная форма на основе ПБЦА НЧ,
модифицированных полисорбатом 80, проявляет высокий противоопухолевый
эффект в отношении высоко злокачественной интракраниальной
глиобластомы. Этот результат позволяет расширить спектр действия
доксорубицина и наряду с установленной более низкой кардиотоксичностью
наносомальной формы свидетельствует о перспективности этой формы для
лечения опухолей мозга.
-
Для наносомальных форм рифампицина и моксифлоксацина показана возможность снижения терапевтических доз по сравнению со стандартными лекарственными формами при лечении экспериментального туберкулеза.
-
Для наносомальных форм стрептомицина и рифампицина показана возможность снижения терапевтических доз по сравнению со стандартными лекарственными формами при лечении острых бактериальных инфекций.
-
Применение ПБЦА наночастиц позволит создавать парентеральные формы для нерастворимых субстанций.
5. Создана технология, практическая ценность которой определяется
возможностью создавать наносомальные формы на основе носителей,
сочетающих селективность, безопасность и емкость, а также использованием
фармацевтических ингредиентов и мягкими условиями получения, позволяющими сохранять структуру биологически активных веществ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Создана технология, позволяющая с помощью полимерных наночастиц
достичь в головном мозге терапевтически значимых концентраций
доксорубицина и реализовать его противоопухолевый эффект в отношении
интракраниальной опухоли.
2. Разработаны и применены подходы, позволяющие с помощью
полимерных наночастиц усиливать фармакологическое действие
антибактериальных антибиотиков различных классов за счет повышения их
концентрации в органах-мишенях. При этом параметры биораспределения
можно в определенной степени регулировать путем изменения состава
наночастиц.
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения ключевых экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (1996, 1997, 1998, 2000, 2004; Москва), Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (2005, 2006, 2009; Москва), VIII Съезде фтизиатров России (2007, Москва), III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (2008, Москва), XX симпозиуме «Современная химическая физика» (2008, Туапсе), Роснанофоруме (2008, Москва), Gordon Research Conference (2002, Tilton, U.S.), Nano Science and Technology Institute (NSTI) BioNanoConference (2006, Boston, U.S.), 5th Conference on Formulation Technology (2007, Potsdam, Germany), World Meetings of Pharmaceutics & Biopharmaceutics (1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008), Annual Meetings of Controlled Release Society (2000, 2001, 2002, 2004, 2006-2008), International Symposium on Microencapsulation (2005), 6th Congress of the Global College of Neuroprotection & Neuroregeneration I 5th Congress of the Society for the Study of Neuroprotection and Neuroplasticity (2009, Vienna, Austria).
Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 318 страницах машинописного текста, содержит 133 рисунка, 43 таблицы и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (258 наименований).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 главы в монографиях, 2 патента, 29 оригинальных статей, в том числе 16 в зарубежной печати, более 40 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Работа выполнена при участии НИИ морфологии человека РАМН (Москва), НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН (Москва), ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск), Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения, Еврейского медицинского и исследовательского центра (Денвер, США) и Института фармацевтической технологии Университета им. Гёте (Франкфурт/Майн).
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова по госконтракту с Роснаукой № 02.512.11.2328 «Разработка субмикронных носителей и новых лекарственных форм биологически активных субстанций таргетного действия для терапии распространенных болезней человека (онкология, внутриклеточные инфекции)» в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Работа выполнена при поддержке гранта №2440 по программе БиоПромышленная Инициатива (ВІІ) Государственного Департамента США, грантов INTAS №№ 94-310 и 00-838 и грантов DFG.
Лечение экспериментальных внутриклеточных инфекций
Подробное изучение биораспределения доксорубицина показало, что, НЧ не накапливались избирательно в опухолевой ткани, а были в основном сосредоточены в клетках Купфера. Эти клетки послужили резервуаром, обеспечившим пролонгированное выделение доксорубицина в непосредственной близости от очагов опухолевого роста и поддержание его эффективных концентраций в этих очагах [46].
Длительно циркулирующие наночастицы. Как отмечалось выше, применение стеле-технологии позволяет повысить противоопухолевый эффект наносомальных препаратов. Например, модифицированные ПЭГ наночастицы ПАПА (ПЭГ-ПАЦА), обладающие способностью длительно циркулировать в кровяном русле, успешно доставили в опухоль рекомбинантный а-фактор некроза опухоли (rHuTNF-a). Сравнительное изучение фармакокинетики и противоопухолевого эффекта свободного и связанного с НЧ из ПАЦА или ПЭГ-ПАЦА rHuTNF-a проводили на мышах с внутрикожно имплантированной саркомой S-180. Как и предполагалось, у животных, получавших rHuTNF-a, связанный с модифицированными НЧ, величина интегрального фармакокинетического показателя AUC выросла в три раза по сравнению со свободным rHuTNF-a. Высокое значение AUC, достигаемое с помощью стелс-НЧ, коррелировало с наиболее высоким накоплением rHuTNF-a в опухоли. Более того, связанный с НЧ из ПЭГ-ПАЦА rHuTNF-a подавлял рост опухоли на 78%, в то время как свободный rHuTNF-a - лишь на 15%. ПАЦА НЧ показали промежуточные результаты [47].
Преодоление множественной лекарственной устойчивости опухолей с помощью наночастиц. Наиболее трудную проблему для химиотерапии злокачественных опухолей представляет множественная лекарственная устойчивость, являющаяся причиной ограниченного доступа ЛВ в і опухолевые клетки. Для устойчивых к действию лекарств (резистентных) клеток характерен повышенный уровень экспрессии специфических трансмембранных белков, известных под названием «АВС-транспортеры» (от англ. ATP-binding cassette - АТФ-связывающая кассета). Основной функцией ABC-транспортеров является связывание нежелательных для клетки молекул и выведение их за пределы клеточной мембраны. Полагают, что основным фактором, ответственным за множественной лекарственной устойчивости при онкологических заболеваниях, является один из ABC-транспортеров, а именно Р-гликопротеин (P-gp, от англ. permeability — проницаемость) [48]. Многочисленные исследования свидетельствуют о возможности повышения эффективности химиотерапии резистентных опухолей при помощи конкурентных ингибиторов P-gp; однако этот подход не нашел применения ввиду высокой сопутствующей токсичности.
Механизм, с помощью которого доксорубицин в составе полиалкилцианоакрилатных наночастиц преодолевает резистентность опухолевых клеток, экспрессирующих P-gp [49]. Наночастицы ПАЦА обладают уникальной способностью преодолевать P-gp-зависимую устойчивость опухолевых клеток к доксорубицину. Следует пояснить, что доксорубицин на резистентные клетки не действует: являясь субстратом P-gp, он в эти клетки просто не проникает. Данные ряда исследований в этой области обобщены в обзоре К. Вотье и соавт. [49]. Так включенный в полиизобутилцианоакрилатные НЧ доксорубицин оказывает сильное цитотоксическое действие на резистентные к нему клетки. В опытах in vitro показано, что для преодоления множественной лекарственной устойчивости необходим контакт НЧ с клетками, однако, вопреки ожиданиям, поступление НЧ в клетки вовсе не является необходимым условием для реализации цитотоксического действия. Кроме того, уровень внутриклеточной концентрации доксорубицина и его цитотоксичность зависят от скорости выделения доксорубицина из частиц (Рис. 1.5).
Для объяснения способности включенного в ПАЦА НЧ доксорубицина преодолевать клеточные барьеры был предложен следующий интересный механизм. Вначале НЧ вступают в контакт с мембраной клетки. Последующее проникновение доксорубицина в клетку обеспечивается одновременным протеканием двух процессов: выделением доксорубицина из НЧ и биодеградацией ПАЦА с образованием водорастворимой полицианоакриловой кислоты. Именно ионная пара, образованная доксорубицином и полицианоакриловой кислотой, проникает в резистентную клетку, минуя P-gp.
Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы доксорубицина
Вследствие этого многие потенциально эффективные ЛВ, предназначенные для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), проявляют высокую активность in vitro, однако оказываются неэффективными при введении в организм, поскольку ГЭБ препятствует поступлению этих веществ в мозг в терапевтических концентрациях.
Для доставки в мозг ЛВ, неспособных проникать через ГЭБ, применяют различные стратегии. Например, доставку в мозг можно осуществить путем системного введения ЛВ при одновременном повышении проницаемости ГЭБ с помощью гиперосмотических растворов (например, раствор маннита) или вазоактивных веществ (таких как брадикинин или его аналоги). Возможность применения этого метода часто ограничена, поскольку подавление защитных механизмов приводит к усилению токсичности ЛВ [80]. Возможно также локальное (интрацеребральное) введение ЛВ. Такой способ доставки позволяет значительно увеличить содержание ЛВ в тканях мозга, но является инвазивным и сопряжен с большим риском для пациента. Кроме того, интрацеребральное введение часто не дает желаемых результатов, ввиду ограниченной диффузии веществ из места введения [81].
Создание систем доставки ЛВ в мозг путем конъюгации со специфическими молекулами-векторами (в основном, антитела) имеет определенные преимущества, т.к. в этом случае используются эндогенные механизмы транспорта. К недостаткам данного метода можно отнести недостаточную. емкость носителя-вектора: стехиометрическое отношение носитель - ЛВ, как правило, составляет (1:1) [81]. Более емкими носителями являются липосомы. Показано, что иммунолипосомы могут доставить в мозг антрациклиновый антибиотик дауномицин [82] путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, однако эффективность этой системы для химиотерапии опухолей мозга пока не изучена. Эффективность невекторизованного липосомального доксорубицина при лечении глиобластомы невысока [83].
Таким образом, несмотря на определенные достижения в этой области, разработка безопасных и неинвазивных методов направленной доставки лекарственных веществ в мозг по-прежнему представляет собой серьезную проблему, для решения которой нужны новые стратегии.
Перспективным направлением исследований в этой области является разработка наносомальных систем доставки. Так было показано, что доставку в мозг ЛВ, не способных преодолевать ГЭБ, можно осуществить с помощью коллоидных систем доставки на основе полибутилцианоакрилатных (ПБЦА) наночастиц, поверхность которых модифицирована полисорбатом 80 (Твин 80). С помощью этих носителей удалось доставить в мозг вещества, которые, являясь субстратами Р-гликопротеина, не проникают через ГЭБ, в том числе гексапептид даларгин, киоторфин, лоперамид и прозерин [84 - 88]. Факт поступления этих вещества в мозг с помощью наночастиц был доказан путем фармакологических тестов (в том числе тестов на болевую чувствительность и судорожную активность), демонстрирующих центральное действие наносомальных форм, в то время как свободные вещества такого действия не оказывали. Эти результаты послужили основанием для создания совершенно новой концепции о том, что наночастицы могут служить средством доставки в мозг веществ, которые в свободном виде не способны преодолеть ГЭБ. Однако практическая значимость этой концепции для терапии заболеваний ЦНС, а также ее важнейшие аспекты, такие как количественные параметры доставки ЛВ в мозг, токсикологические особенности, механизм и пр. оставались неопределенными.
Одним из наиболее тяжелых заболеваний ЦНС является мультиформная глиобластома. Эта наиболее распространенная первичная опухоль мозга обладает крайне неблагоприятным прогнозом: большинство пациентов умирает в течение двух лет после постановки диагноза [89]. Традиционно основными методами лечения первичных опухолей головного мозга являются хирургическое вмешательство и лучевая терапия. Однако радикальное удаление опухоли хирургическим путем выполнимо далеко не у всех пациентов, а лучевая терапия вызывает серьезные осложнения. Химиотерапии отводится лишь вспомогательная роль. Действительно, локальная химиотерапия малоэффективна. Так, например, препарат Gliadel (имплантируемая депо-форма кармустина) увеличивает среднюю продолжительность жизни менее, чем на 2 месяца (13,6 месяцев против 11,9 месяцев для пациентов, получавших плацебо) [90].
Системная химиотерапия не более успешна. Основными лекарственными средствами для лечения глиобластомы до настоящего времени являются производные нитрозомочевины (кармустин, ломустин); однако эти препараты обладают невысокой эффективностью (менее 20%) и выраженной токсичностью, ухудшающей качество жизни. Хотя недавние клинические испытания и продемонстрировали эффективность нового алкилирующего препарата темозоломида (Темодал) в сочетании с радиотерапией, средняя продолжительность жизни больных составила всего 14,6 месяцев [91]. Не оправдывают надежд даже новейшие разработки в этой области: антисенс-терапия глиобластом с использованием арминокарсена, ингибитора тирозинкиназы С, оказалась неэффективной [92].
Влияние технологических параметров на физико-химические свойства полимерных наночастиц, содержащих рифампицин
Следует отметить, что результаты этого эксперимента также коррелируют с данными Ji et al., полученными для крыс с глиомой RT-2, имплантированной путем введения суспензии клеток (5 мкл) [120]. Эти авторы также наблюдали некоторое повышение проницаемости ГЭБ на 3-й день после имплантации и значительную проницаемость на 5-ый день. Корреляция наших результатов с результатами Джи и соавт. [120]. позволяет сделать вывод о том, что применяемый в данной работе метод имплантации опухоли путем пересадки свежей опухолевой ткани (см. ниже) не более травматичен для ГЭБ, чем стандартный метод имплантации путем введения клеточной суспензии.
Итак, исследование биораспределения наносомального доксорубицина показало, что ПБЦА наночастицы, модифицированные полисорбатом 80, проникают через ГЭБ и доставляют связанный с ними доксорубицин в мозг. При этом количество доксорубицина ( 1% введенной дозы), доставленное в мозг, пропорционально относительной массе мозга (1% массы тела), то есть наносомальный доксорубицин после внутривенного введения распределяется так, как если бы мозг не был защищен гистогематическим барьером. В случае интракраниальной опухоли проникновению НЧ в мозг способствует нарушение ГЭБ в зоне опухолевого роста, однако НЧ доставляют лекарственное вещество и в здоровый мозг.
Высокие концентрации наносомального доксорубицина, найденные в мозге, позволили предположить, что наносомальная форма доксорубицина будет эффективным средством для системной химиотерапии глиобластомы 101/8. Действительно, как показали эксперименты in vitro, уровень концентраций доксорубицина в ткани мозга (6 мкг/г) в 15-25 раз превышает уровень его 50% ингибирующей концентрации ІС5о в отношении клеток экспериментальных глиом крысы RG2 (IC50 = 0,24 мкг/мл) и F98 (1С5о = 0,38 мкг/мл) [105]. Противоопухолевую активность оценивали по следующим критериям: 1) продолжительность жизни; 2) число животных с длительной ремиссией. Прим. На ранней стадии исследований длительной ремиссией считали выживаемость до 180 дня после имплантации опухоли. Впоследствии было показано, что среди животных, выживших более 90 дней, гибели на более поздних сроках не наблюдается, и все эти животные доживают до 180 дня. В связи с этим в последующих экспериментах сроки наблюдения составляли в основном 100 дней.
Животные получали следующие препараты: 1) модифицированную полисорбатом 80 наносомальную форму (Докс-ПБЦА+Пс), 2) немодифицированную наносомальную форму (Докс-ПБЦА); 3) пустые наночастицы модифицированные полисорбатом 80 (плацебо), 4) субстанцию доксорубицина в водном растворе (Доке), 4) субстанцию доксорубицина в 1% растворе полисорбата 80 (Докс+Пс). В качестве контроля использовали нелеченных животных. Препараты вводили трехкратно в хвостовую вену крыс на 2, 5 и 8 день после перевивки опухоли в дозах 3 х 1,5 мг/кг и 3 х 2,5 мг/кг.
Наиболее высокий противоопухолевый эффект был достигнут в группе животных, леченных Докс-ПБЦА+Пс [123]. Эффект был подтвержден в трех независимых экспериментах (общее число животных 150, п = 18 -г- 23); обобщенные результаты представлены на Рис. 2.20. Введение Докс-ПБЦА+Пс привело к статистически значимому увеличению продолжительности жизни как по сравнению с нелеченным контролем (УПЖ = 85%), так и по сравнению с группой, получавшей эквивалентные дозы субстанции Доке (УПЖ = 24%). Количество животных, выживших к 180-ому дню, в этой группе превысило 20% (5/23). Противоопухолевый эффект наблюдали также в других группах. ДОКС-НЧ вызывал увеличение продолжительности жизни опытных животных на 38% по сравнению с контролем (на рисунке не показано). В группе животных, леченных ДОКС+Пс, УПЖ составило 65%, а количество животных - 9% (2/23). ДОКС при том же режиме введения оказывал умеренный противоопухолевый эффект: продолжительность жизни увеличилась на 54%; однако сроки жизни в этой группе не превышали 65 суток. Введение эквивалентных доз пустых НЧ не оказывало противоопухолевого действия.
Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели острой септической инфекции
Было бы естественно предположить, что увеличение гидрофильности затруднит взаимодействие частиц с эндотелиальными клетками и помешает им преодолеть ГЭБ. Однако в действительности этого не происходит, что подтверждает предположение о том, что модификация ПЭГ играет важную роль в специфическом взаимодействии НЧ с эндотелиальными клетками ГЭБ.
Анализ описанных выше данных позволяет заключить, что в осуществлении переноса НЧ через ГЭБ могут участвовать различные механизмы. С одной стороны, как отмечалось выше, транспорт через ГЭБ с помощью длительно циркулирующих НЧ может быть результатом повышения концентрации частиц и связанных с ними ЛВ в плазме и обусловлен ростом градиента концентраций в системе плазма - мозг. С другой стороны, ряд экспериментальных данных указывает на то, что эффективность носителей определяется не только (и не столько) длительностью циркуляции и достижением высоких концентраций в плазме, но и возможностью контакта частицы с клеточными мембранами, которая, в свою очередь, зависит от структуры поверхности (в том числе и от модифицирующего агента).
Так совершенно ясно, что феноменальный эффект полисорбата в случае ПБЦА НЧ - 60-кратное увеличение концентрации доксорубицина в мозге, трудно объяснить незначительным повышением градиента концентраций в системе кровь - мозг. Вероятно, эти носители используют другой механизм для проникновения в мозг.
Механизм 3: доставка в мозг в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза. Описанные выше явления хорошо объясняет гипотеза, согласно которой ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом 80, интернализуются эндотелиальными клетками капилляров мозга в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза. Это предположение было экспериментально подтверждено в опытах in vitro, проведенных Г.
Борхардтом и соавт. [149], которые изучали влияние ПАВ на эндоцитоз [14С]-полиметилметакрилатных НЧ эндотелиальными клетками капилляров мозга. НЧ, модифицированные полисорбатом 80, более эффективно доставлялись в клетки, чем немодифициро ванные. Влияние полоксамина 908 на эндоцитоз частиц было незначительным.
В 1997 году М. Люк и соавт. показали, что полисорбат 80 способствует сорбции на поверхности ПБЦА НЧ белков плазмы -аполипопротеинов Е и В [150]. Эти данные позволили предположить, что НЧ проникают в мозг в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза, который является результатом взаимодействия этих белков с LDL-рецепторами, экспрессироваными в мембранах эндотелиальных клеток капилляров мозга. LDL-рецепторы воспринимают НЧ как агрегаты липопротеинов низкой плотности, поступающие в мозг из крови. Внутри эндотелиальной клетки частица подвергается биодеградации под действием ферментов и выделяет ЛВ, которое затем диффундирует через апикальную мембрану в межклеточное пространство.
Эта гипотеза была вначале подтверждена результатами экспериментов по изучению взаимодействия НЧ с эндотелиальными клетками ГЭБ in vitro [151, 152]. Впоследствии было показано, что если модифицированные полисорбатом 80 ПБЦА НЧ с даларгином дополнительно покрыть аполипопротеинами В или Е, то это приводит к усилению анальгезирующего эффекта [153].
В принципе гипотеза о доставке НЧ в мозг путем эндоцитоза с участием АроЕ хорошо объясняла как распределение наносомального доксорубицина в мозг, так и его противоопухолевый эффект в отношении глиобластомы. Однако, как упоминалось выше, влияние ПАВ на поведение НЧ с доксорубицином и даларгином несколько различалось. Так в наших опытах ПБЦА НЧ с доксорубицином, модифицированные полоксамером 188, проявили значительную противоопухолевую активность в отношении глиобластомы 101/8, равную активности НЧ, модифицированных полисорбатом. В то же время согласно данным, приведенным в работе [126], в случае даларгина анальгезирующее действие проявили только НЧ, покрытые полисорбатом 80, тогда как НЧ, покрытые полоксамером 188, были не эффективны.
Для выяснения влияния полисорбата 80 и полоксамера 188 на свойства поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных доксорубицином, мы провели исследование состава белков плазмы, адсорбирующихся на поверхности этих частиц. НЧ вначале инкубировали в плазме крыс, затем белки отделяли и анализировали методом двухмерного электрофореза в акриламидном геле (2-D PAGE) [103]. Результаты этого исследования описаны ниже.
ПБЦА паночастицы, нагруженные доксорубицином и покрытые полисорбатом 80 или полоксамером 188. Состав белков плазмы, найденных на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных доксорубицином и покрытых полисорбатом 80 или полоксамером 188 представлен в Табл. 2.18 и на Рис. 2.57 - 2.59. Как хорошо видно на Рис. 2.59, профили белков на поверхности этих частиц обнаружили как количественное, так и качественное сходство. Так оба типа частиц адсорбировали значительные количества аполипопротеинов АроА-1 и ApoJ. Сравнимы были также количества альбумина, IgG у, АроС-Ш и тиостатина. Различия были незначительны: на поверхности Докс-ПБЦА+Пс был обнаружен тиостатин, а на поверхности Докс-ПБЦА+Р68 - небольшие количества антитрипсина и аполипопротеина ApoA-IV.
