Введение к работе
Актуальность проблемы.
Диоксид марганца используется в качестве окислителя, катализатора, адсорбента и как электродный материал источников энергии. В технологиях био- и химических сенсоров применяют модификацию поверхности электродов МпОг для формирования медиаторного слоя, который способен к многократному циклическому окислению-востановлению на электроде, и осуществляет транспорт электрона от аналита к поверхности электрода, тем самым существенно повышая чувствительность определения аналита.
Традиционно используемой процедурой формирования медиаторного слоя на поверхности электрода является электрохимическое осаждение. В нашей лаборатории была разработана методика изготовления пероксид-чувствительных и холиноксидазных электрохимических сенсоров на основе электрохимически осажденного МпОг, которые позволяли определять пероксид водорода с чувствительностью 1,2 А/(М см ) и пределом обнаружения 30 нМ и холин с пределом обнаружения 800 нМ и чувствительностью 50 мА/(М см ). Вместе с тем, при переходе к массовому производству сенсоров, необходима разработка более удобных в технологическом отношении подходов. Таковыми являются методы струйно-капельного нанесения. Современные технологии позволяют дозировать с высокой точностью микро- и нанолитровые объемы растворов, содержащих необходимые компоненты. При этом существуют автоматизированные системы дозирования, позволяющие сделать процесс изготовления аналитических элементов высокопроизводительным и воспроизводимым. Для такого нанесения необходимо заранее подготовить препарат, содержащий медиатор: раствор или стабильный золь наночастиц.
Описано использование МпОг в качестве медиатора для анализа пероксида водорода, а также аскорбиновой и мочевой кислот, на его основе были разработаны высокочувствительные системы определения глюкозы и холина, в которых осуществлено сопряжение медиатора с ферментом класса оксидаз. Данное соединение привлекательно с технологической точки зрения т.к. его легко получить в виде различных кристаллических модификаций. Однако, существует проблема его стабилизации в виде золя для нанесения на поверхность сенсоров струйно-капельными методами.
Также следует заметить, что в литературе не описано возможности использования диоксида марганца в качестве медиатора для анализа тиолов, в то время как имеются данные о способности МпОг окислять тиолы.
Таким образом, исследование различных способов получения и стабилизации золей наночастиц диоксида марганца, возможности нанесения их на поверхность электрохимических сенсоров капельным методом и создания на основе полученного медиаторного слоя систем определения Н2О2 и тиолов, а
также создания на их основе более сложных ферментативных биосенсоров, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование возможности применения наночастиц диоксида марганца для изготовления электрохимических систем анализа тиолов, пероксида водорода и холина, позволяющих определять активности холинэстераз и проводить анализ их ингибиторов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
Получение и исследование стабильности различных препаратов наночастиц диоксида марганца, в том числе различных кристаллических модификаций.
Исследование возможности применения наночастиц МпОг для электрохимического анализа пероксида водорода и тиолов, в частности тиохолина.
- Разработка системы сопряжения наночастиц МпОг с ферментами класса
оксидаз, в частности холиноксидазы, для электрохимического анализа холина.
- Исследование возможности определения активности ферментов
холинэстераз и анализа их ингибиторов с использованием разработанных на
основе наночастиц МпОг систем анализа холина и тиохолина.
Научная новизна. Разработана методика получения наночастиц МпОг в обращенных мицеллах. Показана возможность использования таких наночастиц для создания пероксид-чувствительного слоя.
Исследованы медиаторные свойства наночастиц МпОг различных кристаллических модификаций в реакции электрохимического окисления тиохолина и пероксида водорода, показано, что у-модификация МпОг обладает более высокой медиаторной активностью по сравнению с аморфным и Р-МпОг.
Впервые показана возможность электрохимического определения тиолов, в частности тиохолина, с использованием диоксида марганца в качестве медиатора.
Разработана и оптимизирована методика получения стабильного гидрозоля наночастиц у-МпОг, исследовано влияние различных катионов и анионов на стабильность гидрозоля. Наночастицы МпОг в гидрозоле охарактеризованы при помощи электронной микроскопии, светорассеяния и т.д.
Разработана методика формирования медиаторных слоев на основе полученных наночастиц у-МпОг и последующей иммобилизации ферментов для создания сенсоров, определяющих Н202 и холин. Разработан холиноксидазный биосенсор на основе стабильного гидрозоля наночастиц у-Мп02.
Разработанные сенсоры использованы для анализа активности БХЭ и ингибиторов холинэстеразной активности.
Практическая значимость работы.
Разработаны пероксид-чувствительные электроды на основе наночастиц МпОг, полученных в обращенных мицеллах. Аналитические характеристики
электродов: линейный диапазон определения Н202 1-10" - 1 10" , предел обнаружения Н2О2 8 10" , чувствительность 922 мА/(М см ).
Разработаны электрохимические сенсоры для высокочувствительного анализа пероксида водорода и тиолов, а также ферментативные биосенсоры для анализа холина на основе стабильного гидрозоля наночастиц у-МпОг. Методики получения стабильного гидрозоля наночастиц у-МпОг, формирования медиаторного слоя на поверхности электрода, а также иммобилизации фермента холиноксидазы для создания холин-чувствительных биосенсоров, были защищены патентом РФ. Все описанные сенсорные элементы могут быть использованы как непосредственно для анализа соответствующих аналитов, так и в качестве базовых элементов при создании более сложных биосенсорных систем.
Основные аналитические характеристики сенсоров: линейный диапазон
о л
определяемых концентраций Н2О2 составил 2-10" М - МО" М, предел обнаружения и чувствительность -2-10" Ми 515 мА/(М-см ), соответственно. Линейный диапазон определяемых концентраций тиохолина, цистеина и глутатиона составил 5-Ю"7 М - МО"4 М, 5-Ю"7 М - МО"3 М и 5-Ю"7 М - МО"5 М соответственно. Предел обнаружения и чувствительность для тиохолина,
о 9 Я
цистеина и глутатиона составили - 6-10" Ми 345 мА/(М-см ), 9-10" М и 183
мА/(М-см ) и 2-10" Ми 178 мА/(М-см Соответственно. Предел обнаружения тиохолина снижен в 8 раз по сравнению с электрохимическими сенсорами для анализа тиохолина на основе других медиаторов и в 200 раз по сравнению со спектрофотометрическим методом Эллмана.
Медиаторный слой на основе наночастиц МпОг может быть использован для анализа концентрации пероксида водорода, которая является важным параметром при изучении различных биохимических процессов, в частности связанным с работой ферментов класса оксидоредуктаз: оксидаз, супероксиддисмутаз и пероксидаз. Данный медиаторный слой может служить базовой конструкцией для создания биосенсоров на основе этих ферментов или измерения их активности.
Разработан и оптимизирован холиноксидазный биосенсор на основе гидрозолей наночастиц у-МпОг. Линейный диапазон определяемых
концентраций холина составил 1,3-10" М - МО" М Предел обнаружения
холина и чувствительность - 1,3-10" нМ и 103 мА/(М-см ), соответственно. Такое значение передела обнаружения по холину является минимальным
значением для электрохимических холиноксидазных биосенсоров, описанных на сегодняшний день в литературе.
Возможность анализа тиолов при помощи сенсора на основе наночастиц МпОг также может быть использована для анализа биологически активных молекул, таких как глутатион и цистеин.
Показано, что разработанные тиохолин-чувствительные сенсоры и холиноксидазные биосенсоры могут быть использованы для анализа активности эстераз в биологических жидкостях, а также определения содержания ингибиторов холинэстеразной активности в экологических образцах.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 2-я Международная школа 'Наноматериалы и нанотехнолигии в живых системах. Безопасность и наномедицина', 19-24 сентября 2011, Московская область; IV-й Московский Международный Конгресс 'Биотехнология - состояние и перспективы развития', 21-25 марта 2011, Москва; ICYS-ICMR Summer School on Nanomaterials, July 22-28 2006, Tsukuba, Japan.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в международных и отечественных журналах, 1 глава в книге, тезисы на 3-х научных конференциях и 1 патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения в 4-х главах, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 186 ссылок. Работа содержит 74 рисунка, 22 таблицы.
