Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 12
1.1 Медиаторные биосенсоры. Медиаторы электронного транспорта 12
1.1.1 Свойства Берлинской лазури. Биосенсоры на основе Берлинской лазури
1.1.2 Химические, физические и электрохимические свойства ферроцена и его производных 15
1.1.3 Использование медиаторов фенотиазинового ряда в биосенсорах 17
1.1.4 Нейтральный красный как медиатор электронного транспорта в биосенсорике 19
1.1.5 Иммобилизация биологического компонента биосенсора в массу носителя 20
1.2 Использование печатных электродов в биосенсорах 22
1.2.1 Конфигурация печатных электродов, используемых в биосенсорике. 24
1.2.2 Определение глюкозы с помощью печатных биосенсоров 28
1.2.3 Анализ этанола с помощью ферментных биосенсоров на основе печатных электродов 31
1.2.4 Использование биосенсоров на основе печатных электродов для определения содержания лактата 33
1.2.5 Биосенсоры на основе печатных электродов для определения содержания крахмала 35
1.3 Использование микроорганизмов в конструкции биосенсоров 37
1,3,1 Бактерии Gluconobacter oxydans 43
1.4 Заключение 45
2 Экспериментальная часть 47
2.1 Проведение биосенсорных измерений с использованием печатных электродов 47
2.2 Биосенсорные измерения с использованием кислородных электродов 48
2.3 Ферментные препараты 49
2.4 Иммобилизация фермента с использованием полимерной мембраны Nafi оп-117 49
2.5 Иммобилизация фермента с использованием поливинилового спирта (ПВС), модифицированного N-винилпирролидоном 49
2.6 Иммобилизация фермента включением в агаровый гель 50
2.7 Иммобилизация фермента в гибридную композицию кремнийорганический золь-гель/ПВС 50
2.8 Иммобилизация фермента в золь-гель матрицу ТЭОС и метилтриэтоксисилана (МТЭОС) 50
2.9 Иммобилизация ферментов в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина 51
2.10 Культивирование клеток Gluconobacter oxydans 51
2.11 Модификация печатных электродов бактериями G. oxydans 52
2.12 Формирование рецепторного элемента биосенсора на основе кислородного электрода 52
2.13 Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 53
2.14 Определение содержания глюкозы и крахмала методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 53
2.15 Определение содержания этанола методом газовой хроматографии 53
2.16 Определение содержания лактата методом капиллярного электрофореза 53
2.17 Определение БПК5 стандартным методом разбавления 54
2.18 Модельный процесс брожения и получение сброженной массы 54
2.19 Модификация белка ферроценальдегидом 54
3 Обсуждение результатов 55
3.1 Выбор способа обработки аналитического сигнала 57
3.2 Выбор методов иммобилизации биологического материала 59
3.3 Биосенсоры на основе печатных электродов, содержащих БЛ и модифицированных ферментами
3.3.1 Выбор значения рН буферного раствора для проведения измерений с использованием биосенсоров на основе ферментных печатных электродов 62
3.3.2 Градуировочные зависимости биосенсоров на основе печатных электродов, содержащих БЛ и модифицированных ферментами 63
3.3.3 Чувствительность и нижняя граница определяемых концентраций 65
3.3.4 Стабильность разработанных ферментных электродов 69
3.3.5 Основные характеристики биосенсоров на основе печатных электродов, содержащих БЛ и модифицированных ферментами 72
3.3.6 Апробация ферментных печатных электродов
3.4 Выбор микроорганизмов для использования в качестве рецепторных элементов биосенсоров, способных к определению уровня БПК 76
3.5 Биосенсоры на основе печатных электродов, модифицированных целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans
3.5.1 Выбор медиатора электронного транспорта 78
3.5.2 Операционная стабильность печатных электродов, модифицированных бактериями G oxydans 83
3.5.3 Селективность биосенсора на основе печатных электродов, модифицированных клетками G oxydans 84
3.5.4 Градуировочная зависимость и основные характеристики печатных электродов на основе бактерий G. oxydans 87
3.5.5 Определение уровня БПК с помощью печатного электрода, модифицированного бактериями G oxydans и ферроценом 90
3.5.6 Оценка воспроизводимости метода 92 3.5.7 Биосенсоры на основе печатных электродов, в которых бактерии G. oxydans иммобилизованы в проводящий белковый гидрогель 93
3.5.8 Апробация биосенсора на основе печатного электрода, модифицированного целыми клетками 96
3,6 Заключение 99
Выводы 101
Список литературы 103
- Использование медиаторов фенотиазинового ряда в биосенсорах
- Биосенсорные измерения с использованием кислородных электродов
- Определение содержания глюкозы и крахмала методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
- Биосенсоры на основе печатных электродов, содержащих БЛ и модифицированных ферментами
Использование медиаторов фенотиазинового ряда в биосенсорах
Нейтральный красный (3-амино-6-диметиламино-2-метилфеназин) относится к классу феназиновых красителей, которые используются в качестве сенсибилизаторов фотогальванических ячеек, служащих для преобразования энергии света в электрическую энергию [45].
НК обладает липофильными свойствами при нейтральном рН, поэтому он способен легко проникать внутрь клеток. На входе в клетку НК находится в протонированной форме, что позволяет ему быстро проникать через мембрану, накапливаться в клетке и, как следствие, связываться с самой мембраной [47, 48]. Находясь внутри клетки, нейтральный красный обладает небольшой токсичностью [47]. Этот краситель применяется и в других областях, где востребованы его отличительные свойства. Так, НК используется для прижизненного окрашивания клеток [49], в медицинских целях для исследования вирусов [50], как индикатор рН в биохимических системах [51], для оценки природных и синтетических биоматериалов [52, 53]. Как медиатор электронного транспорта в составе биосенсоров НК стал применяться относительно недавно [54]. В работе [55] описан микробный биосенсор на основе НК, адсорбированного в гидрогеле восстановленного графита. Диапазон определяемых значений БПК составил 2-64 мг Ог/л. В работе [56] использовали углеродные нанотрубки, на них происходила адсорбция НК и глюкозооксидазы. Эти функционализированные нанотрубки закрепляли на графитовом электроде, пропитанном парафином, включением в мембрану Nafion.
Диапазон определяемых концентраций глюкозы для такого электрода составил 110"8 1 10"3 М, предел обнаружения глюкозы - 3 10"9 М. Как и другие производные феназина, в частности, толуидиновый синий, феносафранин, метиленовый синий, НК способен к электрохимической полимеризации с образованием электропроводящих пленок [54, 57, 58]. Данное свойство широко используется при разработке биосенсоров, например, в работе [59] описаны биосенсоры для определения глюкозы и пирувата на основе оксидаз и пленки поли-НК. Диапазон определяемых концентраций глюкозы составил 0,09-1,8 мМ, пирувата - 90-600 мкМ. С помощью разработанных биосенсоров провели определение содержания глюкозы в вине и пирувата в луке и чесноке. Полученные результаты хорошо коррелировали с результатами спектрофотометрического анализа. Пленки поли-НК использовали для создания проточно-инжекционного биосенсора для определения глюкозы в работе [60]. Биологическим компонентом являлась глюкозооксидаза, иммобилизованная в золь-гель матрицы различного состава. По своим медиаторным свойствам поли-НК превзошел гексацианоферраты кобальта и меди, использовавшиеся в данной работе. Работа [54] посвящена изучению пленок поли-НК в составе глюкозного биосенсора на основе глюкозооксидазы. В ней продемонстрировано, что механизм передачи заряда на электрод включает в себя две стадии: восстановление пероксида водорода и регенерация кофактора ФАД путем его окисления на поли-НК.
Публикаций, посвященных использованию НК в биосенсорах совместно с микроорганизмами, крайне мало, и НК в них используется в полимеризованной форме, как, например, в работе [61], в которой описан биосенсор на основе клеток бактерий Е. coli, иммобилизованных в сополимер поливинилового спирта и поливинилпирролидона, и пленки электрополимеризованного НК. Разработанный биосенсор применяли для определения уровня БПК сточных вод.
Иммобилизация биологического компонента биосенсора в массу носителя Для того, чтобы биосенсор надежно работал, биологический материал должен быть надлежащим образом закреплен, или иммобилизован, на физико-химическом преобразователе.
Иммобилизацию можно рассматривать как физическое разделение биологического материала (клеток, клеточных фракций или ферментов) и растворителя, при котором молекулы субстрата и продукта могут легко перемещаться между фазами. Метод иммобилизации можно считать пригодным, если после присоединения к носителю биологический материал сохраняет активность и стабильность. Методы иммобилизации можно разделить на: физические - адсорбция на поверхности датчика или на инертной мембране, закрепление на поверхности датчика под полимерную сетку.
В последнее десятилетие в биосенсорике активно используется метод иммобилизации биологического материала, основанный на включении его в гидрогели различной природы [62]. Гидрогели представляют собой трехмерные структуры, получаемые путем сшивки молекул гидрофильных полимеров, и способные набухать в водных средах без растворения, значительно при этом увеличиваясь в объеме. Наиболее важными свойствами гидрогелей в приложении к иммобилизации биологического материала являются высокое содержание воды, что делает их матрицы биосовместимыми, и обеспечивает беспрепятственный транспорт субстратов и метаболитов сквозь них, а также их химическое разнообразие и возможность изменять физические и химические свойства матрицы. В зависимости от типа сшивки различают две основные группы гидрогелей.
Пространственная сетка полимерных гидрогелей 1-го рода образована ковалентными связями (химические сетки). Хорошо известными примерами таких материалов являются полиакриламидные гидрогели [63], поперечно-сшитые нити ДНК [64], белки [65] и полипептиды [66], гидрогели на основе поливинилового спирта [67].
В гидрогелях 2-го рода пространственная сетка поддерживается за счет сил нековалентной природы (водородные связи, гидрофобные, электростатические взаимодействия). Примерами таких систем могут быть самособирающиеся полимерные структуры на основе графена [68], пептидов [69]. Данным гелевым матрицам присуще обратимое плавление - застудневание при изменении условий внешней среды.
К сожалению, со временем биологический материал может диффундировать из матрицы гидрогеля в раствор, что приводит к снижению активности распознающего элемента. Однако скорость потери биологического материала можно существенно снизить за счет сшивки его с полимерной сеткой гидрогеля [3]. В этом случае биоматериал обычно связывают химически, для чего используют так называемые бифункциональные реагенты, например, глутаровый альдегид (7).
При этом свойства получаемых матриц можно варьировать путем изменения количества бифункционального реагента, затрачиваемого на сшивку: чем больше реагента, тем выше механическая прочность матрицы гидрогеля и тем ниже скорость диффузии метаболитов сквозь нее. Полученные матрицы удерживаются у поверхности преобразователя физически за счет ее развитого рельефа. Существуют и другие способы получения гидрогелей в водных растворах, например, воздействие ультрафиолетовым излучением или повышение температуры для инициации радикальной полимеризации, гелеобразование из вязких растворов, что позволяет получать полимерные сетки нужной геометрии для применения в микрофлюидике, кроме того, гидрогели можно получать биосовместимыми методами при нахождении биологического материала внутри них, что на выходе позволяет получить инкапсулированный биоматериал, готовый к применению в биосенсорном анализе. Дальнейшие достижения в области разработки гидрогелей тесно связаны с развитием макромолекулярной химии, которое позволит повысить точность контроля размеров, формы, расположения функциональных групп в полимерных молекулах и взаимном их расположении в матрице. Кроме того, применение современных биотехнологических подходов к формированию структуры гидрогелей позволит создавать биогибридные гидрогели, позволяющие значительно повысить чувствительность и селективность анализа.
Биосенсорные измерения с использованием кислородных электродов
В работе использовали бактерии Gluconobacter oxydans subsp. industrius (ВКМ B-1280). Культивирование бактерий проводили на питательной среде следующего состава: 200 г/л D-сорбит (ООО Диаэм); 20 г/л дрожжевой экстракт (ООО Диаэм); дистиллированная вода - 100 мл, рН среды - 5,2-5,5, при температуре 28 С в течение 26 часов. Клетки собирали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. и отмывали двукратно 33 мМ фосфатным буфером (ООО Диаэм) с рН 6,8. Осевшие клетки ресуспендировали в новой порции буфера и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Полученные осадки в микропробирках подсушивали на воздухе, для изготовления каждого модифицированного печатного электрода использовали новую порцию клеток, разбавленных 30 мМ фосфатным буфером с рН 6,8 в соотношении 1:1 (мг сырого веса/мкл).
Модификация печатных электродов бактериями G. oxydans
Для получения модифицированного микробного печатного электрода на поверхность рабочего электрода наносили 1 мкл раствора ферроцена (Sigma-Aldrich) в ацетоне с концентрацией 2 мг/мл и оставляли до полного высыхания. Далее в микропробирку помещали 7 мг БСА (Sigma-Aldrich), 100 мкл фосфатного буфера (рН=6,8, 33 мМ) и перемешивали до полного растворения. К полученному раствору добавляли 10 мкл суспензии клеток, разбавленной буферным раствором в соотношении 1:1, перемешивали и добавляли 15 мкл 25%-ного глутарового альдегида (Panreac Qumica S.L.U.). Полученную смесь перемешивали ещё раз, отбирали 3 мкл и быстро переносили на электрод (рисунок 8). Время полимеризации составляло 30 минут. ферроцен 4 Ь БСА с клетками Рисунок 8 - Схема строения печатного электрода, модифицированного клетками бактерий G. oxydans Модифицированный печатный электрод перед использованием промывали в буферном растворе в течение 5 мин.
Формирование рецепторного элемента биосенсора на основе кислородного электрода Биомассу микроорганизмов разбавляли определённым количеством буферного раствора (33 мМ, рН 6,8) до содержания 150 мг/мл. Полученную смесь наносили на стекловолоконный фильтр (Whatman GF/A, Sigma) в количестве 3 мкл. Сегмент стекловолоконного фильтра (3x3 мм), пропитанный суспензией микроорганизмов, подсушивали на воздухе в течение 15 минут при 20 C. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки. 2.13 Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
На образцы печатных электродов напыляли тонкий слой платиново-углеродной смеси в вакуумно-напылительной установке JEE-4X (JEOL, Япония). Электронно-микроскопический анализ образцов проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-6510 LV (JEOL, Япония) в режиме высокого вакуума при регистрации вторичных электронов.
Определение содержания глюкозы и крахмала методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Определение содержания глюкозы в образцах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе марки «HP 1100» (Hewlett Packard, США) с использованием детектора рефрактометрического типа и колонки (300x6,5 мм), заполненной сульфированным сополимером полистирола и дивинилбензола в кальциевой ионной форме с размером частиц 30 мкм. Условия анализа: температура колонки - 80С, скорость потока элюента (деионизированная вода) - 0,5 см3/мин.
При определении содержания крахмала проводили предварительный гидролиз анализируемого образца. Для этого его нагревали на водяной бане в разбавленном растворе соляной кислоты (1,124 %) в течение 15 мин, осаждали белковые вещества, отфильтровывали и проводили хроматографический анализ, как описано выше.
Определение содержания этилового спирта в образцах проводили методом газожидкостной хроматографии (ГХ), на хроматографе «Кристал-5000.2» (ЗАО СКБ «Хроматэк», Россия) с использованием пламенно-ионизационного детектора и капиллярной колонки DB-FFAP (50м0,32мм0,50мкм) (Agilent, США). Условия анализа: температура термостата колонки - 70 С, температура испарителя - 200 С, температура детектора - 250 С, скорость потока газа-носителя (гелия) - 0,10 дм3/час.
Определение содержания молочной кислоты в образцах проводили с помощью системы капиллярного электрофореза (КЭ) «Капель-104Т» (Люмэкс, Россия) с отрицательной полярностью высокого напряжения (напряжение - 20 кВ, внутренний диаметр капилляра 75 мкм, эффективная длина 50 см, температура - 20С). Детектирование проводили спектрофотометрически при длине волны 254 нм. 2.17 Определение БПКв стандартным методом разбавления
Определение БПК проводили по методике, описанной в ПНДФ 14.1:2:3:4.123-97. Образцы с БПК5 выше 6 мг/дм3 предварительно разбавляли. Определение в разбавленной пробе проводили по разности содержания кислорода до и после инкубации в стандартных условиях. Содержание растворенного кислорода измеряли с помощью кислородного электрода.
Образец пшеничной муки суспендировали в тёплой дистиллированной воде и нагревали до 90 С. В полученную массу добавляли ферментный препарат Termamyl (Novozymes A/S, Дания) и термостатировали 2 часа при перемешивании. После чего реакционную массу охлаждали до 60С и добавляли ферментный препарат SAN Super 360L (Novozymes A/S, Дания), помещали в термостат и перемешивали 2 часа. После этого охлаждали колбу до 30С, добавляли дрожжевой препарат SuperStart (Россия) и термостатировали 70 часов для брожения. Пробы отбирали через 2, 12, 48 и 72 часа после добавления дрожжевого препарата.
Для синтеза ферроценмодифицированного белка навеску БСА массой 0,5 г растворяли в 5 мл диметилформамида (ДМФА). Раствор ферроценальдегида (FcCHO) готовили, растворяя 50 мг FcCHO в 5 мл ДМФА. Полученный раствор через делительную воронку по каплям прибавляли к раствору БСА при температуре 50C и постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 часа. Затем добавляли 15 мг NaCNBH? и оставляли раствор на сутки при комнатной температуре, после чего проводили его диализ относительно фосфатного буферного раствора с pH 6,8 в течение 3 дней для очистки от свободного FcCHO. Далее раствор центрифугировали через фильтры при 3000 об/мин в течение 15 минут, фильтрат собирали в микропробирки и высушивали на воздухе.
Определение содержания глюкозы и крахмала методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Полученные результаты расширяют возможность применения технологии печатных электродов при решении задачи селективного определения содержания компонентов систем, содержащих глюкозу, этанол, лактат и крахмал.
Таким образом, разработанные ферментные печатные электроды в составе единой биосенсорной системы для контроля бродильных процессов могут рассматриваться как альтернатива классическим методам анализа. Практическое внедрение новых анализаторов позволит увеличить экономическую отдачу биотехнологических производств и повысить их экологическую безопасность, так как позволит проводить непрерывный мониторинг процесса брожения силами одного устройства.
Выбор микроорганизмов для использования в качестве рецепторных элементов биосенсоров, способных к определению уровня БПК
Поскольку большинство ферментов, применяемых в биосенсорах, выделяют из микроорганизмов, вполне логично рассматривать и сами микроорганизмы, как потенциальные биокатализаторы. Целые клетки микроорганизмов предпочтительно использовать в качестве биокатализатора при определении уровня биохимического потребления кислорода (БПК), так как они обладают широкой сy6стpaтнoй специфичностью (низкой селективностью). Широкая субстратная специфичность при этом является преимуществом, так как приводит к повышению правильности результатов анализа, поэтому далее была проведена оценка субстратной специфичности дрожжевых и бактериальных микроорганизмов с целью определения штамма, на основе которого возможно создание модифицированных печатных электродов, способных к определению уровня БПК в составе амперометрического биосенсора. Использование печатных электродов в биосенсорах для определения уровня БПК ведет к уменьшению линейных размеров чувствительных элементов и снижению их энергопотребления. Применение миниатюрных чувствительных элементов в совокупности с портативными потенциостатами, которые уже сейчас могут работать по беспроводной связи с вычислительными устройствами нового поколения - планшетными компьютерами и смартфонами, имеющими круглосуточный доступ в сеть Интернет, расширяют возможности экологического мониторинга и контроля загрязнения окружающей среды.
Среди дрожжевых микроорганизмов были выбраны Debaryomyces hansenii, известные своей широкой субстратной специфичностью [133], которая свойственна большинству дрожжевых штаммов, и устойчивостью к повышенной ионной силе раствора, т. к. местом их обитания является морская вода. Из бактериальных микроорганизмов для сравнения были выбраны Gluconobacter oxydans, которые часто используются в биосенсорике. Ранее была показано, что они могут быть эффективными биокатализаторами в составе биосенсора [194]. Однако ранее в биосенсорах на основе этих бактерий в качестве преобразователя выступали кислородные, стеклоуглеродные и графитопастовые электроды, биосенсоров на основе G. oxydans и графитовых печатных электродов создано не было. Оба штамма, Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМ-B1280 и Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482, иммобилизовали адсорбцией на стекловолоконном фильтре с целью создания рецепторного элемента для биосенсора на основе кислородного электрода. Такие условия проведения анализа были выбраны, чтобы максимально сохранить нативную субстратную специфичность микроорганизмов. На рисунке 20 представлены портреты субстратной специфичности дрожжевого и бактериального штамма.
Дрожжевой штамм D. hansenii способен окислять большее количество соединений, относящихся к различным классам, чем уксуснокислые бактерии G. oxydans, что делает его более перспективным для использования в составе биосенсора для определения БПК. Однако, при создании медиаторного биосенсора на основе D. hansenii мы не наблюдали ответов биосенсора на введение в кювету растворов соединений, которые данный штамм активно окисляет. В связи с этим разработку медиаторного биосенсора для определения уровня БПК было решено проводить на основе клеток бактерий G oxydans.
Ферментные печатные биосенсоры имели в своей основе электроды, модифицированные Берлинской лазурью, но уксуснокислые бактерии не продуцируют во внешнюю среду пероксид водорода при окислении субстратов, поэтому эти электроды не могут быть использованы в системе с целыми клетками, и необходимо использовать другой принцип формирования аналитического сигнала. При использовании бактериальных клеток аналитический сигнал формировался за счёт переноса электронов от ферментных систем бактерий к электроду с использованием специальных низкомолекулярных переносчиков электронов - медиаторов электронного транспорта. Известно, что G oxydans способны функционировать в электрохимических системах в сочетании с медиаторами ферроценового ряда [150, 195]и некоторыми медиаторами феназинового ряда [125]. Для выявления общих закономерностей эффективности переноса заряда на рабочую поверхность печатных электродов, характеризующуюся небольшой площадью, необходимо выявить, какие медиаторы можно использовать в таких системах. Поэтому на первом этапе работы с целыми клетками было проведено выявление работоспособности медиаторов феназинового ряда: нейтрального красного (НК), метиленового синего (МС), тионина (ТН), и ферроценового ряда: 1,1 -ферроцендиметанол (Fc-(CH20H)2), 1,Г-диметилферроцен (Fc-(СНз)г), этилферроцен (Fc-C2H5), ферроцен (Fc). Для оценки эффективности медиаторов электронного транспорта, процесс формирования ответа биосенсора в результате окисления клетками бактерий определяемых веществ в пробе рассматривали в рамках ранее предложенной модели [196], в которой данный процесс представляется как двухсубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Применимость данной модели к медиаторным биосенсорам на основе иммобилизованных клеток бактерий Gluconobacter oxydans была подтверждена ранее [148]. Согласно данной модели процессы, протекающие на электроде, можно описать уравнениями (17-19).
Биосенсоры на основе печатных электродов, содержащих БЛ и модифицированных ферментами
Несмотря на высокие аналитические характеристики разработанных печатных электродов на основе G. oxydons и ферроцена, у них наблюдается существенный недостаток - постепенное снижение ответов сенсора из-за повышенной растворимости заряженной формы ферроцена, которая образуется в процессе измерения. Избежать потери медиатора предлагается путем получения проводящего электроны гидрогеля на основе поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с ферроценальдегидом. В результате нуклеофильного присоединения ферроценальдегида по карбонильным группам с последующим восстановлением боргидридом натрия образуется модифицированный ферроценальдегидом БСА (уравнения 24, 25).
Градуировочные зависимости ответа биосенсора от концентрации этанола при использовании различных медиаторов: адсорбированного ферроцена и проводящего белкового гидрогеля (а –полный вид; б – линейный участок) При использовании гидрогеля, в состав белковой матрицы которого вшиты молекулы производного ферроцена, для иммобилизации уксуснокислых бактерий на поверхности рабочего электрода, наблюдается перенос электронов от ферментных систем бактерий на электрод, при этом скорость изменения силы тока прямо пропорциональна содержанию определяемого вещества в кювете. Уровень максимального ответа биосенсора при использовании проводящего гидрогеля все же ниже по сравнению с адсорбированным ферроценом, что закономерно, так как для ферментных систем бактерий доступность медиатора, ковалентно связанного с полимерной матрицей, ниже, чем доступность ферроцена, находящегося в растворе. Зависимость относительного стандартного отклонения от концентрации этанола, из которой рассчитывалась нижняя граница определяемых концентраций, представлена на рисунке 40.
Концентрация этанола, мМ Рисунок 40 - Зависимость относительного стандартного отклонения от концентрации этанола для биосенсора на основе печатного электрода, на основе бактерий G. oxydans и проводящего белкового гидрогеля
Нижняя граница определяемых концентраций составила 162 мМ, что ожидаемо, так как данная величина связана с коэффициентом чувствительности, который выше при использовании адсорбированного ферроцена. При сравнении операционной стабильности микробных электродов с медиатором, иммобилизованным разными методами (рисунок 39), наблюдается несколько иная картина. 3,0 2,5 2,0 1,5
Порядковый номер измерения Рисунок 41 - Сравнение операционной стабильности печатных электродов, модифицированных клетками G. oxydans, при использовании в качестве медиатора адсорбированного ферроцена и ферроценмодифицированного БСА
При использовании адсорбированного ферроцена ответ биосенсора значительно выше, однако со временем наблюдается его падение - так, за 20 параллельных измерений снижение ответа биосенсора составило 13%, в то время как при иммобилизации бактерий в проводящий белковый гидрогель биосенсор сохраняет уровень ответа практически неизменным на протяжении серии из 20 измерений. Иными словами, использование проводящего гидрогеля позволяет избежать постепенной десорбции медиатора с поверхности электрода и связанного с ней постепенного снижения величины ответа биосенсора. В таблице 13 представлены основные характеристики печатных электродов, модифицированных клетками уксуснокислых бактерий и медиаторами: ферроценом, адсорбированным на электроде и проводящим белковым гидрогелем.
G. oxydans, иммобилизованных в гидрогель хитозана, модифицированного ферроценальдегидом, перед аналогичными биосенсорами на основе адсорбированного на электроде ферроцена и бактерий, иммобилизованных в матрицу хитозана. При сравнении же характеристик биосенсора на основе G. oxydcms, иммобилизованных в проводящий белковый гидрогель, с биосенсором на основе адсорбированного ферроцена и бактерий, иммобилизованных в гидрогель БСА, наблюдается снижение основных характеристик биосенсора, что может быть вызвано недостаточной плотностью ферроценальдегидных групп, ковалентно связанных с матрицей гидрогеля, так как количество аминогрупп, по которым может присоединяться ферроценальдегид, на единицу массы у БСА значительно меньше, чем у хитозана.
Таким образом, иммобилизация медиатора ковалентной сшивкой приводит к снижению большинства аналитических характеристик биосенсора, в то же время повышается стабильность микробных печатных электродов, что позволит их использовать при разработке биосенсоров проточно-инжекционного типа.
Для апробации печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans и ферроценом были выбраны соки «Добрый» (апельсиновый, томатный и яблочный), образцы водок: «Журавли», «Славянская» и «Зеленая марка» и образцы сточных вод ОАО «ГПК Ефремовский» (Тульская обл., г. Ефремов). Результаты измерений с использованием биосенсора и референтными методами представлены в таблицах 14 и 15 соответственно.
Далее была проведена статистическая обработка данных: проверка на нуль гипотезу дала положительный результат, что позволило использовать модифицированный тест Стьюдента для выявления статистической погрешности между результатами измерений с использованием биосенсора и полученными референтными методами (таблица 16). Таблица 16 Статистическая обработка результатов анализа
В результате проведения статистического анализа результатов измерений с использованием модифицированного теста Стьюдента выявлено, что значения концентраций определяемых веществ, полученные с помощью биосенсора на основе печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans и ферроценом, и полученные референтными методами, незначимо различаются между собой.
Таким образом можно заключить, что печатные электроды после модификации их биологическим компонентом и медиаторной составляющей могут служить основой для эффективных биосенсоров для определения содержания крахмала, глюкозы, лактата, этанола и уровня БПК которые могут стать основой универсального аналитического метода для определения содержания веществ различных классов в смеси с минимальной пробоподготовкой. Модификация печатных электродов, покрытых Берлинской лазурью, ферментами класса оксидоредуктаз, иммобилизованными в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина, позволяет сделать их селективными по отношению к заданным соединениям. Аналогично ферментам клетки уксуснокислых бактерий G. oxydans могут служить биокатализатором для биосенсора на основе печатных электродов, однако ввиду низкой селективности их целесообразно применять для оценки интегрального показателя загрязненности пробы - уровня БПК. Уксуснокислые бактерии G. oxydans способны работать в составе биосенсора совместно с медиаторами электронного транспорта ферроценового и феназинового ряда. Установлено, что заместители, обладающие отрицательным индуктивным эффектом, повышают эффективность производных ферроцена, как медиаторов электронного транспорта в биоэлектрохимической системе, включающей в себя графитовый печатный электрод и клетки бактерий G. oxydans. Заместители с положительным индуктивным эффектом снижают медиаторную активность производных ферроцена. Показано, что метод имобилизации биоматериала не влияет на относительную эффективность медиаторов ферроценового ряда в рамках механизма «пинг-понг», которому подчиняется кинетика процесса переноса электронов от клеток уксуснокислых бактерий к электроду медиаторами данного класса. В то же время механизм «пинг-понг» не позволяет количественно оценить процесс переноса электронов с участием медиаторов феназинового ряда. Повысить стабильность аналитического сигнала биосенсора можно путем иммобилизации биоматериала в поперечно-сшитый гель бычьего сывороточного альбумина, содержащего ферроценальдегид, ковалентно связанный с аминогруппами белка. Он обеспечивает генерацию полезного сигнала биосенсора, что свидетельствует о его медиаторных свойствах. Полученные результаты заложили основу исследований, направленных на изучение возможности модификации других биополимеров молекулами медиатора с целью получения электропроводящей матрицы для иммобилизации биологического компонента на поверхности преобразователя без снижения аналитических характеристик биосенсора.
