Содержание к диссертации
Введение
1. ВВЕДЕНИЕ 4
2. ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ - СУБСТРАТОВ И ЭФФЕКТОРОВ (Литературный обзор) 10
2.1. Общая характеристика пероксидазы 10
2.2. Создание и особенности функционирования пероксидазных сенсоров ... 15
2.2.1. Иммобилизация пероксидазы 18
2.2.2. Установление электрохимического контакта между электродом и пероксидазоЙ. Определение пероксида водорода , 29
2.3. Применение пероксидазного сенсора для определения органических и неорганических токсикантов 39
2.3.1. Определение легко окисляющихся органических соединений 39
2.3.2. Определение ингибиторов пероксидазы 45
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 49
3.1. Реактивы и расходные материалы 49
3.2. Приборы и оборудование 52
3.2.1. Изготовление пероксидазного сенсора и измерение его сигнала ...52
3.2.2. Фотометрическое измерение холинэстеразной активности 55
3.2.3. Отбор и анализ проб промышленных сточных вод 56
4. ОПЕРАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА 59
4.1. Выбор условий измерения пероксидазиой активности 59
4.2. Оценка сигнала в отношении модельных токсикантов - субстратов и ингибиторов пероксидазы 70
5. ОЦЕНКА ПЕРОКСИДАЗИОЙ АКТИВНОСТИ СТОЧНЫХ ВОД 86
5.1. Общая оценка тестирования сточных вод с помощью биосенсоров 86
5.2. Характеристика основных гидрохимических и биохимических показателей сточных вод 90
5.3. Построение прогнозных моделей 99
5.4. Связь показателей биосенсоров с характеристиками токсичности сточных вод 106
6. ПЕРОКСИДАЗНАЯ И ХОЛИНЭСТЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИДОКСИНА 109
6.L Влияние производных пиридоксина на пероксидазное окисление гидрохинона 109
6.2. Литихолинэстеразиая активность аминопроизводиых циклических ацеталей и кеталей пиридоксина 115
7. ВЫВОДЫ 120
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ
ИСТОЧНИКОВ 122
ПРИЛОЖЕНИЕ 141
- Создание и особенности функционирования пероксидазных сенсоров
- Изготовление пероксидазного сенсора и измерение его сигнала
- Оценка сигнала в отношении модельных токсикантов - субстратов и ингибиторов пероксидазы
Введение к работе
Современное развитие экологического мониторинга отличается повышенным вниманием, уделяемым развитию средств экспресс-оценки состояния окружающей среды на основании токсикологических критериев. Целью применения таких нестандартных средств диагностики является совокупная оценка неблагоприятных последствий всей совокупности токсикантов, присутствующих в объекте контроля, на биоту [1]. Такая оценка должна предшествовать полному анализу физико-химических и токсикологических свойств образца, требующему дорогостоящего лабораторного оборудования (хроматомасс-спектромстрия, высокоэффективная жидкостная хроматография и др. [2]) и высокой квалификации обслуживающего персонала. Экспресс-системы оповещения о токсичности призваны заполнить существующий разрыв между потребностью населения и контролирующих природоохранных органов в достоверной информации о качестве среды обитания и реальными сроками ее получения.
Ферменты как никакие другие биологические компоненты подходят для создания и использования экспрессных биологических тестов в экоаналитическом контроле окружающей среды. Они обеспечивают получение быстрого и чувствительного сигнала и способны в течение нескольких минут определить присутствие той или иной группы токсических веществ в объекте контроля. Немаловажно, что влияние токсикантов на ферменты поддается количественной обработке и может быть осуществлено с использованием стандартных процедур, достаточно распространенных в биотехнологии, клиническом анализе и микробиологической промышленности.
Принцип оценки присутствия опасного вещества по его биологическому эффекту характерен для биологического мониторинга [1], однако в случае ферментных тестов становится возможна количественная оценка токсического эффекта. Это расширяет сферу применения экологического мониторинга и позволяет одновременно решать задачи экотоксикологии и экологического нормирования поступающих загрязняющих веществ.
Вместе с тем, практическое использование биохимической диагностики экотоксикантов требует предварительного решения задач стандартизации отклика на основные поллютанты. Эта проблема особенно актуальна, если объект отличается разнообразием макро- и микрокомпонентов, что типично для промышленных сточных вод и отходов производства и потребления. Требуется надежная теоретическая и экспериментальная база для производства и эксплуатации ферментных тестов, в том числе с использованием серийно выпускаемого измерительного оборудования.
Пероксидаза - один из наиболее изученных ферментов, широко используемых в биоаналитических методах исследования. Это связано с уникально широким кругом субстратов, к числу которых относятся фенолы, анилины, аскорбиновая кислота, ароматические амины и другие соединения - индикаторы состояния метаболических процессов и стрессовых состояний живых организмов [3]. Кроме того, пероксидазы отличаются высокой стабильностью и многообразием способов регистрации активности. Не случайно данный фермент используется в качестве метки в иммунофермеитном анализе и в контроле активности оксидаз, в первую очередь, в составе глюкозных сенсоров.
Все это делает пероксидазу одним из перспективных объектов для включения в состав ферментных сенсорных устройств, предназначенных для оценки загрязнения окружающей среды. Пероксидазные сенсоры могут найти применение в контроле загрязнения сточных вод, содержащих малоустойчивые органические соединения и тяжелые металлы. Это хозяйственно-бытовые стоки, сточные воды фармацевтической и пищевой промышленности, ливневой сток крупных населенных пунктов и т.д.
В этой связи настоящая работа, посвященная эколого-аиалитическому применению пероксидазного сенсора, является актуальной.
Целью настоящей работы явилось создание и всесторонняя характеристика пероксидазного сенсора на основе планарного графитового электрода, предназначенного для контроля содержания основных токсикантов и обобщенной оценки загрязнения сточных вод.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- определить оптимальные условия иммобилизации пероксидазы и измерения сигнала сенсора в присутствии различных токсикантов и сточных вод;
- оценить чувствительность сигнала пероксидазного сенсора к модельным токсикантам в однокомпонентных растворах;
- установить факторы, влияющие на проявление токсических свойств субстратов и эффекторов пероксидазы, а также вклад неферментативных путей образования конечных продуктов, регистрируемых электрохимические; ""
- провести скрининг пероксидазной активности новых ранее не изучавшихся соединений с различными функциональными группами (циклические производные пиридоксина) " для установления влияния их строения на пероксидазную активность;
- провести тестирование сточных вод предприятий г.Казани и установить зависимость " между сигналом пероксидазного сенсора при различных разведениях вод, гидрохимическими и токсикологическими характеристиками стоков с привлечением современных методов статистического анализа.
Научная новизна работы заключаются в том, что:
- впервые предложено использовать пероксидазный сенсор для количественной характеристики замещенных фенолов и анилинов - потенциальных компонентов сточных вод;
- определены рабочие условия измерения сигнала, позволяющие разделить влияние отдельных групп токсикантов и неферментативные (каталитические) стадии образования продуктов на сигнал биосенсора; - впервые установлено влияние процессов каталитического окисления гидрохинона в
присутствии ионов металлов на изменение сигнала пероксидазного сенсора в широком диапазоне рН и концентраций реагентов;
- впервые охарактеризованы свойства циклических замещенных пиридоксинов как эффекторов пероксидазы;
- впервые показана возможность использования показателя пероксидазной активности для классификации сточных вод по степени их очистки и источнику поступления, установлена корреляция сигнала биосенсора с результатами биотестирования на Paramecium caudatum (острая токсичность).
Практическая значимость работы состоит в том, что:
- разработаны простые и удобные способы иммобилизации пероксидазы и регистрации пероксидазной активности по току восстановления бензохииона, образующегося- в реакции с участием гидрохинона на поверхности амперометрического сенсора;
- предложены методики определения замещенных фенолов и анилинов - субстратов пероксидазы, а также оценки загрязненности промышленных сточных вод без трудоемких способов пробоподготовки;
- на примере циклических производных пиридоксина предложены подходы к оценке влияния структуры соединений на их пероксидазпую активность, а также предложены упрощенные процедуры предварительного скрининга биохимической активности новых синтезированных органических соединений, содержащих несколько потенциальных центров связывания с ферментом.
На защиту выносятся:
- исследование влияния условий иммобилизации и измерения сигнала на чувствительность определения органических субстратов и неорганических ингибиторов пероксидаз и вывод о характере влияния упомянутых факторов на сигнал пероксидазного сенсора; - обоснование возможности применения пероксидазиого сенсора в предварительной оценке уровня и характера загрязнения муниципальных и промышленных сточных вод;
- сравнительное изучение процессов каталитического и ферментативного окисления гидрохинона пероксидом водорода в присутствии ионов металлов и вывод о вкладе неферментативных реакций в сигнал пероксидазиого сенсора в присутствии солей никеля, кадмия, свинца и ртути (II);
- классификация сточных вод по показателям пероксидазной активности и вывод о возможности определения источника и степени загрязненности сточных вод по совокупности гидрохимических, экотоксикологических и биосенсорных данных;
- скрининг пероксидазной активности циклических производных пиридоксина и подходы к определению центров связывания и механизма взаимодействия полифункциональных неспецифических ингибиторов фермента.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на- Итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2001, 2002 гг.), Всероссийском симпозиуме "Тест методы химического анализа" (2001 г.), Поволжской конференции по аналитической химии (2001 г.), Всероссийской конференции с международным участием "Актуальные проблемы аналитической химии" (2002 г.), Международной конференции по аналитической химии Euroanalysis-12 (Дортмунд, Германия, 2002 г.), III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003 г.).
Основные результаты изложены в 1 статье и 6 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, включает 31 рисунок и 26 таблиц. Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 167 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
Диссертация выполнена на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета при поддержке РФФИ (грант № 00-03-32605 "Разработка электрохимических биосенсоров на основе планарных модифицированных электродов для диагностики загрязнения окружающей среды"), совместной программы Минобразования РФ и CRDF (Научно-образовательный центр при Казанском государственном университете "Материалы и технологии XXI века" REC-007), Академии наук Татарстана (грант 09-9,4-124/2003 (Ф) "Информационно-аналитическая система оценки токсичности промышленных сточных вод на основе биосенсоров").
Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использованы в учебном процессе в Казанском государственного университете при чтении общего курса % "Экологических мониторинг".
Создание и особенности функционирования пероксидазных сенсоров
Пероксидазы широко представлены в составе различных тест-устройств, предназначенных для определения биологически активных соединений. Такие устройства - биосенсоры [7] - находят применение в решении различных задач экологического мониторинга, контроля продуктов питания, иммунохимического анализа и т.д. [8-11]. Интерес, проявляемый к пероксидазам, обусловлен рядом обстоятельств, среди которых широкая субстратная специфичность пероксидазы, легкость измерения активности фермента фотометрическими и электрохимическими методами, устойчивость в иативпом и иммобилизованном состоянии, простота выделения из растений и микроорганизмов и очистки, дешевизна и доступность. В настоящее время две пероксидазы выпускаются промышленностью - это пероксидаза из хрена и из арахиса. Имеется ряд публикаций, посвященных биоаналитическому применению пероксидаз из других источников - сои, і табака, батата, микроорганизмов и грибов [12-14], а также рекомбипаптных ферментов [4,15,16], в том числе с модифицированной первичной структурой белковой части. Сигнал биосенсора - это изменение свойств преобразователя (электрода или оптического сенсора), обусловленное биохимическим процессом и измеряемое с помощью соответствующей техники. Чаще всего это оптические или электрохимические характеристики - цвет, поляризация или интенсивность поглощения светового потока, электропроводность, окислительно-восстановительный потенциал, изменение рН, токи окисления/восстановления компонентов биохимической реакции и т.д. Специфичность биохимического распознавания определяет селективность биосенсора, а свойства преобразователя сигнала - чувствительность определения низкомолекулярного соединения. Таким образом, биосенсор реализует достаточно известные принципы твердофазной экстракции или поверхностной сорбции определяемого вещества, а уникальность его аналитических характеристик связана с присутствием на поверхности преобразователя биохимического компонента (рис.4).
В случае пероксидазы существует достаточное число реакций окисления искусственных и природных субстратов, позволяющих надежно и с высокой чувствительностью регистрировать активность фермента и ее изменение в присутствии эффекторов.
Так, для фотометрической (колориметрической) регистрации сигнала пероксидазного сенсора могут применяться реакции окисления тетраметилбензидина, о-анизидина, о-фенилендиамина, тетрахлортетразолий хлорида (ТТХ), 4-аминоантипирина, и-аминофенола и др. [17]. Цвет продуктов окисления варьирует от желто-оранжевого до коричневого и синего и зависит от природы субстрата и носителя фермента [18-20]. В некоторых случаях наблюдаются последовательные изменения цвета различной контрастности. Образование окрашенных продуктов связано с реакциями окислительной конденсации субстратов, при этом их точное строение установлено не во всех случаях. Для и-аминофенола два вероятных продукта (см. механизм образования (2.2), продукты выделены в рамках), определяющие изменение окраски раствора, идентифицированы путем их встречного синтеза и сопоставления электрохимических и оптических характеристик [21],
При использовании для регистрации сигнала биосенсора хемолюминесценции в качестве субстрата пероксидазы может использоваться люминол [22-24]. Некоторые вещества, например, иод, усиливают вынужденное излучение и повышают чувствительность регистрации уровня псроксидазнои активности. Такие системы, получившие название вынужденной, или усиленной (enhanced), хемо- или биолюминесценции, нашли распространение в системах иммунодиагностики с антителами, мечеными пероксидазои. Электрохимическая регистрация активности пероксидазы позволяет использовать практически любые природные и искусственные субстраты. Это связано с тем, что катализируемая реакция является окислительно-восстановительным процессом, так что и исходные вещества, и продукты активны на электроде [4]. При определении пероксида водорода вместо второго субстрата - донора электронов - используют также медиаторы электронного переноса, облегчающие электрический контакт активного центра фермента и электрода [25-30]. Электрохимические пероксидазные сенсоры будут подробно рассмотрены ниже.
Изготовление пероксидазного сенсора и измерение его сигнала
Использовали пероксидазу из корней хрена производства Vitact, Россия, с удельной активностью 3 1Е/мг и бутирилхолинэстеразу из сыворотки крови лошади ("Sigma", США). Субстратами ферментативной реакции служили гидрохинон и перекись водорода. Для иммобилизации фермента использовали глутаровый альдегид (25%) производства Sigma, который разводили до рабочей концентрации буферным раствором непосредственно перед использованием. В качестве стабилизатора фермента использовали нафион (5% спиртовый раствор, "Aldrich", Steinhcim, Германия) и желатин фотографический (ПО "Полимерфото", г.Казань) в случае пероксидазы, иммобилизованной на графитовом электроде, и TV-фталилхитазан для растворов холинэстеразы. JV-фталилхитазан был синтезирован из хитазана кальмара производства Хайрюзовского рыбоперерабатывающего завода по методике [147] и предоставлен для исследований с.н.с. Прокоповым А.А. (Санкт-Петербургский технологический институт).
Измерение скорости ферментативной активности нативных ферментов и отклика биосенсоров проводили в 0.002 М фосфатном (рН 6.5-7.9) или ацетатном (рН 4.5-6.5) буферных растворах, содержащих для постоянства ионной силы 0.1 М NaCl (фотометрическое детектирование) или Na2SC«4 (амперометрическое детектирование). Все буферные растворы готовили на основе дистиллированной воды из солей марки ч.д.а.
В качестве модельных токсикантов - субстратов и эффекторов пероксидазы -исследовали соли меди (II), ртути (И), свинца, никеля и кадмия, замещенные ароматические амины и фенолы, а также гидроксиламин гидрохлорид, гидразин сульфат, триэтаноламин, алифатические спирты. Кроме того, были изучены производные пиридоксина (табл.3.1), синтезированные под рук. с.н.с. Штырлина Ю.Г. в Научно-исследовательском химическом институте им.А.М.Бутлерова по методикам [148-149]. Таблица 3.1 Растворы соединений 1-11 готовили путем растворения навески стандартного образца в ацетатном буферном растворе. Непосредственно перед проведением экспериментов исходный раствор разбавляли до требуемой концентрации дистиллированной водой или соответствующим буферным раствором. Растворы солей меди (II), свинца, никеля и кадмия готовили путем растворения соответствующих солей в 0.01 М азотной кислоте. Для приготовления растворов Hg(II) точную навеску металлической ртути растворяли в дымящей азотной кислоте. Перед проведением измерений растворы разбавляли ацетатным буфером или дистиллированной водой до требуемых концентраций и корректировали величину рН полученного раствора с помощью 0.1% едкого натра.
Для изготовления пероксидазных сенсоров использовали планарные электроды на поливинилхлоридной основе со слоем графитовой композиции, наносимым методом трафаретной печати (НПВП "ИВА", Екатеринбург) или напыления (университет г. Перпиньян, Франция). Для изоляции проводящего слоя и ограничения рабочей области использовали прозрачный лак на нитрацеллюлозной основе. Общий вид электрода на рис.7.
Измерение величины рН рабочих буферных растворов проводили с помощью цифрового прецизионного ион ом ера И-130 (ПО "Измеритель", Гомель, Беларусь). Дозирование реагентов при приготовлении растворов и проведении измерений производили с помощью микродозаторов "Plastomed" (Польша), Сигнал пероксидазных сенсоров регистрировали с помощью полярографического анализатора РА-2 ("Laboratornie Prjistroe" Брно, Чехия) и вольтамперометрического анализатора ИВА-5 (НПВП "ИВА", Екатеринбург). Все потенциалы измеряли относительно хлорсеребряного электрода сравнения (Ag/AgCl). При работе с печатными электродами использовали электрод сравнения, изготовленный по технологии трафаретной печати с нанесением слоя мелкодисперсного серебра и хлорида серебра на графитовый токосъемник.
Измерения оптической плотности растворов проводили с помощью колориметрического иммуноферментного анализатора АКИ-Ц-01 (АО"Биомашприбор", Йошкар-Ола) с дискретным светофильтром 530 им. Все измерения проводили при комнатной температуре без термостатироваиия.
Печатные электроды на основе графитовой суспензии в гидроксиэтилцеллюлозе перед иммобилизацией фермента модифицировали нафионом для стабилизации сигнала и предотвращения смыва суспензии в раствор. Для этого готовили 0.5% суспензию нафиона путем аликвотного разбавления 5% суспензии в этаноле, наносили 2 мкл суспензии на поверхность планарного электрода и оставляли на 24 часа. Электроды на основе эпоксидно-графитовой композиции, изготовленные методом трафаретной печати, использовали без предварительной обработки.
Для иммобилизации фермента на поверхность электрода последовательно наносили 3 мкл раствора пероксидазы хрена в фосфатном буферном растворе из расчета 1 Е на электрод и после подсушивания при комнатной температуре - равный объем 0.01% раствора желатина. Далее после образования на поверхности электрода влажной белковой пленки наносили 3 мкл 1% раствора глутарового альдегида и высушивали досуха при комнатной температуре. В завершение электрод отмывали в дистиллированной воде в течение 10 минут. Сигнал пероксидазного сенсора измеряли в хроноамперометрическом (статическом) режиме и в режиме линейной развертки потенциала (постояннотоковая вольтамперометрия). Измерение в статическом режиме. Биосенсор на основе с тоикопленочного печатного электрода, модифицированного нафионом, погружали в ячейку, заполненную 5 мл фосфатного или ацетатного буферного раствора. В качестве противоэлектрода использовали никелевую фольгу площадью I см2, в качестве электрода сравнения хлорсеребряный электрод. После кондиционирования в течение 5-15 мин до стабилизации тока в ячейку добавляли последовательно раствор гидрохинона и пероксида водорода до их объемных концентраций 1 мМ. Через 10 мин регистрировали ток окисления хшюна, образующегося в ферментативной реакции (3.1), при -150 В. После измерения электроды промывали рабочим буферным раствором в течение 10 мин. Для измерения влияния на сигнал биосенсора потенциальных субстратов и ингибиторов пероксидазы после измерения отклика на гидрохинон и биосенсор вновь помещали в ячейку, содержащую 5 мл буферного раствора, куда добавляли необходимый объем раствора ингибитора. По прошествии 10 мин. в ячейку вводили гидрохинон и пероксид водорода и регистрировали сигнал как описано выше. После измерения электрод отмывали в растворе фосфатного буфера в течение 10 минут.
Аналогичным образом проводили тестирование сточных вод. Предварительно образцы сточных вод разбавляли и корректировали рН до величины 6.5- При необходимости воды фильтровали для удаления взвешенных частиц. Перед проведением инкубирования контролировали электрохимическую активность сточных вод, определяя наличие в них активных примесей в области потенциалов измерения сигнала биосенсора. Так же поступали и для органических соединений - эффекторов фермента.
Для измерения ингибирующего действия ионов металлов биосенсор помещали на 20 мин. в раствор ингибитора, после чего переносили в ячейку, содержащую 5 мл ацетатного буферного раствора. Далее в ячейку добавляли гидрохинон до его конечной концентрации 0.1 мМ и пероксид водорода до его концентрации 1 мМ. Через 10 мин регистрировали сигнал пероксидазного сенсора как описано выше. После измерения биосенсор отмывали в рабочем ацетатном буферном растворе в течение 10 мин.
Оценка сигнала в отношении модельных токсикантов - субстратов и ингибиторов пероксидазы
В результате падает скорость переноса субстратов из раствора в поверхностный слой. Это приводит к снижению относительного насыщения активных центров иммобилизованной пероксидазы субстратом. Помимо увеличения продолжительности эксперимента, имеются и другие нежелательные последствия. Так, увеличение количества фермента снижает чувствительность биосенсора к ингибиторам независимо от механизма их действия [154]. Также уменьшается доля продукта превращения (бензохинона), которая вовлекается в каталитический цикл ферментного окисления - катодного восстановления. Добавки желатина использовали для стабилизации фермента при хранении и использовании биосенсора. Эффект стабилизатора проявлялся при поверхностной концентрации не менее 0.1 мг/см2. Дальнейшее увеличение его количества было признано нецелесообразным, поскольку приводило к снижению наклона градуировочной зависимости определения гидрохинона (снижению чувствительности в отношении субстрата пероксидазы), а также к увеличению времени отклика до 7-10 мин. Кроме того, при использовании более 0.5 мг/см2 желатина в серии экспериментов с одним и тем же биосенсором проявлялся эффект "памяти". Он выражался в завышении результата повторного измерения, если в раствор добавляли меньшую концентрацию субстрата, и в занижении результата, если во втором и последующем измерении концентрацию субстрата повышали. Причина этого состоит в неполной отмывке мембраны сенсора от гидрохинона вследствие набухания желатина в буферном растворе. Кроме того, в присутствии желатина понижалась чувствительность регистрации ингибирующего действия ионов металлов. По этой причине желатиновые поверхностные пленки использовали только для электродов, предназначенных для контроля органического загрязнения сточных вод и для количественной оценки ингибирующего действия органических токсикантов - вторых субстратов.
Помимо гидрохинона, были изучены другие органически соединения, по литературным данным способные к пероксидазному окислению и образующие электрохимически активные продукты. Это замещенные анилины и фенолы. Процедура измерения состояла, как и для гидрохинона, в регистрации катодных токов восстановления продуктов пероксидазной реакции в области потенциалов, исключающих протекание конкурентных электрохимических процессов. В большинстве своем рабочий потенциал измерения сигнала таких субстратов составлял -250.,, -400 мВ отн. Ag/AgCl. В табл. 4.3 приведены характеристики определения указанных соединений с помощью разработанного пероксидазного сенсора. Из всех изученных соединений только гидрохинон показал квазиобратимое поведение на графитовых электродах. Для остальных соединений электродные процессы носили необратимый характер. По-видимому, с этим связаны столь значительные различия в чувствительности сигналов. Уменьшение наклона зависимостей других изученных субстратов по сравнению с данными для гидрохинона может быть связано либо с частичным блокированием поверхности электрода нерастворимыми продуктами окисления, либо с выведением части субстрата за рамки каталитического цикла. Это может быть следствием химических превращений промежуточных продуктов, в результате чего образуются устойчивые конечные продукты, не способные к катодному восстановлению или при таком восстановлении дающие продукты, не идентичные исходному субстрату. Исключением является 2-амино-4-нитрофснол, для которого максимальные токи составили 7.5-10 мкА, а наклон линейной части градуировочной зависимости превышал таковой гидрохинона в 1,5 раза. Более детальное исследование самого исходного субстрата на чистом стеклоуглеродном электроде показало, что при многократном сканировании потенциала происходит закономерное увеличение токов окисления и восстановления, особенно заметное в первых 2-3 циклах. Можно предположить, что в результате реакций окисления-восстановления образуется продукт, склонный к более полному окислению по сравнению с исходным фенолом. Это может быть результатом окислительной полимеризации субстрата, как это имеет место при анодном окислении анилина [155,156], или восстановления нитрогруппы на катодной ветви цикла. Поскольку такие процессы контролировать достаточно сложно, от использования данного субстрата также пришлось отказаться. Тем не менее, многообразие субстратов, окисляющихся на пероксидазном сенсоре, показывает перспективность его использования для контроля загрязнения легко окисляющимися органическими соединениями.
