Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. АНАЛИЗ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС- ДИАГНОСТКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И МАТРИЦ ДЛЯ ИММО БИЛИЗОВАННЫХ СИСТЕМ (обзор литературы)
1.1. Анализ современного состояния экспресс-диагностики инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей. 16
1.2. Матрицы для иммобилизованных систем твердофазного иммуноанализа. 48
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 59
2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу 59
2.2. Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов 59
2.3. Получение антигенных комплексов микроорганизмов 70
2.4. Лабораторные животные, использованные в экспериментах 70
2.5. Методы иммунизации животных 71
2.6. Методы контроля антигенов и сывороток 71
2.7. Выделение иммуноглобулинов 71
2.8. Получение и контроль иммунофлуоресцирующихконъюгатов 71
2.9. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов 72
2.10. Физико-химические методы 72
2.11. Иммунохимические методы анализа 72
2.12. Лиофилизация биологического материала 73
2.13. Характеристика реагентов, используемых для получения магно-иммуносорбентов 73
2.14. Методы математической и статистической обработки материалов 74
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИММУННЫХ СЫВОРОТОК И ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 75
3.1. Получение антигенных комплексов микроорганизмов 75
3.2. Получение гипериммунных кроличьих сывороток 80
3.3. Подбор методов выделения иммуноглобулинов 87
ГЛАВА 4. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ КОНЪЮГАТОВ 93
4.1 Получение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих 107 120
4.2 Получение иммуноглобулинов диагностических иммуноферментных
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА СУСПЕНЗИОННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ
5.1. Биотехнология производства эритроцитарньгх диагностикумов 120
5.2. Биотехнология производства латексных диагностикумов 128
5.3. Разработка суспензионных алюмосиликатных диагностикумов 134
ГЛАВА 6.РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ МАГНОИММУНОСОРБЕНТОВ (МИС) 142
6.1. Разработка полиакриламидных магноиммуносорбентов 142
6.2. Конструирование композиционных магноиммуносорбентов на основе аэросила 149'
6.3. Разработка композиционных магноиммуносорбентов на основе алюмосиликата 157
6.4. Получение аффинных сорбентов для сорбции неспецифических компонентов из сывороток крови 170
ГЛАВА 7. СОЧЕТАННЫЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГА НИЗМОВ С МАГНОИММУНОСОРБЕНТАМИ 176
7.1. Разработка метода селективного концентрирования на магно-иммуносорбенте с последующей постановкой иммуноферментного анализа (ИФА) 176
7.2. Разработка метода селективного концентрирования на магно иммуносорбенте с последующей постановкой количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА) 183
7.3. Разработка метода селективного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой хемилюминесцентного иммунного анализа (ХЛИА) 188
7.4. Разработка метода селективного концентрирования на магно-иммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции (ПЦР) 196
7.5. Изучение диагностической ценности тест-систем магноиммуно-сорбентных 202
ГЛАВА 8. СТАБИЛИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ МЕТОДОМ ЛИОФИЛЬНОГО ВЫСУШИВАНИЯ 209
8.1. Отработка оптимальных защитных сред и параметров лиофильного высушивания 209
8.2. Характеристика лиофилизированных препаратов 222
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 230
ВЫВОДЫ 248
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 250
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 252
ПРИЛОЖЕНИЯ
- Анализ современного состояния экспресс-диагностики инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей.
- Штаммы микроорганизмов, взятые в работу
- Получение антигенных комплексов микроорганизмов
Введение к работе
ГЛАВА 1. АНАЛИЗ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС- ДИАГНОСТКИ
ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И МАТРИЦ ДЛЯ ИММО
БИЛИЗОВАННЫХ СИСТЕМ (обзор литературы) 16
1.1. Анализ современного состояния экспресс-диагностики инфек
ционных заболеваний и индикации их возбудителей. 16
1.2. Матрицы для иммобилизованных систем твердофазного иммуно-
анализа. 48
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ современного состояния экспресс-диагностики инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей
На приоритетном месте биотехнологии стоят вопросы разработки и совершенствования технологий изготовления биопрепаратов с целью повышения их активности, чувствительности, специфичности, экспрессности при диагностике инфекций у больных людей, животных и выявлении возбудителей в объектах внешней среды в связи с тем, что особенностью современной эпидемиологической: обстановки как во всем мире, так ив России является повсеместная активизация практически всех известных инфекционных заболеваний, в том числе и тех, которые считались хорошо изученными и традиционно находились и находятся под пристальным контролем санитарно-эпидемиологических служб. Наибольшую опасность в эпидемиологическом плане представляют прежде всего особо опасные и опасные инфекции, относящиеся преимущественно к карантинным и природно-очаговым болезням, такие как чума, сибирская язва, бруцеллез, туляремия и др. (Воробьев А.А. с соавт., 1997; Онищенко Т.Г., 1997; Дармов И.В. с соавт., 1998; Онищенко Г.Г.,2001).
При мониторинге территорий, а также выявлении заболеваний и \ вспышек завозных инфекций определяющую роль играет наличие эффективных и достоверных методов лабораторной диагностики. Для многих инфекций разработаны методы быстрой диагностики? (экспресс-методы), которые позволяют обнаружить возбудитель непосредственно в пробах от больного с использованием иммуносерологических методов, направленных как на обнаружение антигена, так и на выявление антител, и дать ответ через несколько часов.- Основные требования, предъявляемые к современным методам экспресс-анализа - выявление низких концентраций патогена в максимально короткие сроки, их высокая специфичность. Для конструирования диагностаческих препаратов необходимо получить качественный антигенный и антительный материал. При изолировании антигенного материала необходимо более полное извлечение интересующих специфических компонентов, сохранение биологических и антигенных свойств выделяемых белков. Процедура получения антигенного материала зависит от степени растворимости и лабильности изучаемых белков. Для перевода антигенов в»растворимое состояние применяют экстракцию трихлоруксусной кислотой, солевыми растворами, петролейным эфиром, фенолом, эфиром, хлороформом, ацетоном,, с помощью кислотного, щелочного гидролиза и т.д. Получаемые при этом экстракты имеют различные физико-химические, иммунохимические свойства и спектр антигенов (Афанасьев Е.Н., .2000). При анализе литературных данных по методам;выделения антигенных комплексов, из микробных клеток привлекли внимание сообщения Н.А.Бельской с соавт. (1970, 1972), В.И.Вейнблата с соавт. (1971, 1972), в - которых показано, что наиболее сложным макромолекулярным составом обладали водно-солевые экстракты чумных микробов. Многими исследователями І для извлечения антигенных компонентов из микробной клетки использовались различные методы её разрушения: физический, химический, механический и і др. Эффективными-методами І разрушения микробной клетки является ультразвуковая и механическая дезинтеграция (Фихте Б.А., 1972). В основе широко используемых физических методов дезинтеграции лежит механизм высокоградиентных течений жидкости. Под воздействием ультразвуковых волн, прежде всего, наступает разрушение структуры клеток микробов; а изменения химических веществ, находящихся в них, происходят гораздо медленнее, что обеспечивает возможность получения различных активных комплексов, близких к нативным (Благовещенский В.А.с соавт., 1961). Применяя ультразвуковые колебания различной, частоты, интенсивности и; варьируя длительностью воздействия на микробные клетки, можно получать эффект от слабо выраженных изменений І в биологических свойствах до селективного и полного разрушения микробных клеток (Жданова Л.Г., Перс И.Ф., 1961; Шин Н.Г., Ищанова Р.Ж., 1978). Известны работы по получению белково-полисахаридного (БПА) и липополисахаридных (ЛПС) компонентов бруцелл (Вершилова П.А, Драновская Е.А., 1975,1976; Moreno Е. etal, 1979). Анализ литературных данных показывает, что БПА чаще используют в качестве про-тективного антигена (Драновская Е. А. Вершилова П.А, 1981; Голубинский Е.П. с соавт.1984). ЛПС широко применяется при конструировании диагностических препаратов; (Тюменцев C.Hi с соавт., 1994; Nielsen К., Kelly L., MalloryM., 1998 и др.).
Штаммы микроорганизмов, взятые в работу
Выращивание чумного микроба проводили с использованием бульона Хоттингера рН 7,2-7,4; агара Хоттингера рН 7,2-7,4 (ФС 42-0397-253902 и ФС 42-0397-261002).
Штаммы чумного микроба засевали на агар Хоттингера и выращивали при температуре 28 С в течение 48 часов, затем дважды пассировали на бульоне Хоттингера при температуре 2 8 С с интервалом 24 часа, высевали на скошенный агар во флаконы и выращивали в течение 48 часов при 37 С. Для посева в матрацы использовали культуру, смытую 0,9 % раствором хлорида натрия, которую инкубировали в течение 48 часов при температуре 37 С, смывали 0,15 М раствором NaGl и: стерилизовали холодным (минус 40 С) ацетоном в течение 48 часов.
Выращивание туляремийного микроба проводили. с использованием скошенной желточной среды Мак-Коя (Биргер М.О., 1982). Штамм туляремийного микроба засевали на пробирки со средой Мак-Коя, выращивали в течение 24 часов при 37 С, смывали и засевали на желточную среду Мак-Коя в матрацах, инкубировали в течение 48 часов при 37 С. Для инактиви-рования туляремийного микроба использовали хлороформ по методике, предложенной Н.Ф.Василенко с соавт. (1988).
Штаммы холерного вибриона засевали в 1 % пептонную воду, рН 7,8, инкубировали при температуре 37 С в течение 3 часов, делали высев на і чашку с агаром Хоттингера, рН 7,8, инкубировали при температуре 37 С в течение 18-24 часов, смывали дистиллированной водой.
Биомассу бруцелл выращивали в пробирках со скошенным агаром Альбими, рН 7,2 при температуре 37 С в течение 48 часов, дважды пассировали аналогично выше описанному, смывали 0,15 М раствором NaCl и засевали матрацы с печёночным агаром, выращивали в термостате при температуре 37 С в течение 72 часов. Для инактивирования бруцеллёзного микроба использовали холодный (минус 40 С) ацетон.
Штаммы листериозного микроба засевали на глюкозо-глицериновый агар, инкубировали при температуре 37 С в течение 48 часов.
Бакмассы микробов обеззараживали согласно СП 1.2.011-94 (Санитарные правила, 1994).
Для получения полноценных антигенных комплексов лептоспир выбраны- штаммы 6 серогрупп (таблица 1), входящие в типовой диагностический набор штаммов для РМА и имеющие наибольшее эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Бакмассы патогенных лептоспир выращивали на среде Ферворта-Вольфа при (28-30) С в течение 7-10 суток, обеззараживали мертиолатом натрия в разведении 1:10000 и фенолом в концентрации 0,25 %.
Штаммы сибиреязвенного микроба засевали на бульон Хоттингера рН 7,2 при температуре 37 С, инкубировали 16-18. После визуального контроля и микроскопии мазков, проводили посев культуры на агар Хоттингера и выращивали при; температуре 37 С в течение 16-18 часов. Отбирали типичные шероховатые R-колонии, вновь засевали в бульон Хоттингера рН 7,2 и выращивали при тех же условиях. После визуального контроля;и микроскопии мазков культуру засевали в матрацы со средой Гладстона-Филдса, которую инкубировали в течение 6-8 суток при температуре 37 С, смывали дистиллированной водой и помещали на одни сутки в холодильник при температуре 4-5 С для лизиса оставшихся вегетативных форм микроба. Сибиреязвенные споры автоклавировали в течение 2 часов при давлении 2х 10 Па.
Контроль общей и специфической стерильности проводили биологическим и бактериологическим методами, изложенными в методических указаниях МУК.4:1/4.2. 588-96.
При отсутствии роста культур микробов при бактериологическом и биологическом контроле препарат считали специфически стерильным.
Получение антигенных комплексов микроорганизмов
Нами проведены исследования по подбору эффективных способов изоляции специфических антигенов из бактериальных масс, различных видов-микроорганизмов. Для этого использовали штаммы: F.tularensis Schu, F.tularensis Miura, F.tularensis 890 Аз, F.tularensis 144/713; В- melitensis 16 M; В: abortus 19-BA и В. suis 1330; B.anthracis 71/12, B.anthracis Sterne; Y.pestis EV; Listeria monocytogenes 1 —7 и 6 эпидемически значимых серог-рупп лептоспир (таблица 1). При получении водорастворимых антигенов сапных и мелиоидозных использовали обеззараженные бакмассы сапа {P.mallei. 10230, P.mallei 11) и мелиоидоза {P.pseudomallei 57576, P.pseudomallei ПО), предоставленные сотрудниками Волгоградского НИПЧИ:
Водорастворимые туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные, лис-териозные, лептоспирозные, сапные, мелиоидозные антигены изолировали комплексным; методом: последовательно водно-солевой экстракцией и дезинтеграцией. О степени разрушения микробных клеток судили по; изменению оптической І плотности, которую регистрировали фотоэлектроколори-метрически и по количеству белка в надосадочных жидкостях, полученных центрифугированием при 20000 g втечение 30 мин, а также микроскопически с помощью биологического микроскопа; Технология получения водорастворимых антигенов:
I стадия. Фракционирование сернокислым аммонием
Обеззараженную и проверенную на специфическую стерильность бактериальную; массу туляремийных, бруцеллёзных, сибиреязвенных, листериоз-ных, лептоспирозных, сапных и мелиоидозных микробов центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин на центрифуге "Beckman L-75". Бакмассы, обеззараженные ацетоном и высушенные, предварительно экстрагировали в 2,5 % растворе хлорида натрия. После центрифугирования отделяли супернатант от осадка. Для фракционирования белков в супернатант добавляли сульфат аммония до 80 % насыщения и перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин. Полученный раствор оставляли на 16-18 часов при 4 С для формирования осадка и стабилизации белка. Центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин, супернатант удаляли, а осадок растворяли в 0,9 % растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1 и проводили диализ против водопроводной, а затем дистиллированной воды до отсутствия ионов NH2+, определяемых реактивом Несслера. Таким способом выделяли поверхностные белки микроба.
II стадия. Механическая дезинтеграция
Осадок, полученный после центрифугирования бактериальной массы и растворенный» в 0,9 % растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, в объеме 30 мл помещали в камеру Х-пресс дезинтегратора, предварительно охлажденного в течение 2 часов при температуре минус 40 С. Микробные клетки в дезинтеграторе замораживали при той же температуре в течение 8 часов. После этого проводили разрушение клеток на гидравлическом прессе, четырехкратно продавливая бакмассу через калиброванное отверстие патрона дезинтегратора. Далее биомассу размораживали и центрифугировали при 20 000 g в течение 30 минут. В супернатанте получали белково-полисахаридный комплекс, липиды.
III стадия. Ультразвуковая дезинтеграция Осадок,, полученный после предыдущей стадии, суспендировали в 0,9 % растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, добавляли детергент твин-80 до конечной концентрации 0,1 % для улучшения солюбилиза-ции белковых компонентов структур рибосом и мембран клеточных элементов. Полученную суспензию микробных клеток в объеме 30 мл помещали в дезинтегратор УЗДН-2Т и воздействовали ультразвуком в течение мин при частоте 22 и 44 кГц. С помощью ультразвуковой дезинтеграции выделяли мембранные, рибосомальные и оболочечные белки (Роуз Э., 1971).
