Введение к работе
Актуальность проблемы
В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 40 млн. случаев инфекционных заболеваний. Экономический ущерб, наносимый инфекционными болезнями, составляет свыше 18 млрд. рублей в год. В связи с этим одной из приоритетных государственных задач является создание в Российской Федерации собственной государственной системы разработки и производства лечебно-профилактических препаратов против возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний .
Росту заболеваемости туберкулезом в Российской Федерации способствуют неблагоприятные изменения социально-экономических условий, резкое увеличение миграционных потоков, снижение качества противотуберкулезной службы и объема профилактических обследований. Эксперты ВОЗ подразделяют страны мира на три группы по частоте заболеваний туберкулезом: с заболеваемостью менее 25,0 на 100 тыс. населения, от 25,0 до 100,0 и свыше 100,0. Российская Федерация с показателем заболеваемости 70,99 на 100 тыс. населения (2006 г.) относится к странам с относительно высоким уровнем заболеваемости (Волкова К.И. и др., 2001; Петрухина М.И. и др., 2003; Кондратенко Т.А. и др., 2007).
Распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза в настоящее время приняло характер мировой пандемии, способной дестабилизировать общество. Несмотря на все предпринимаемые меры, положение с этой формой туберкулеза продолжает ухудшаться. Это вызвало необходимость введения нового термина - туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью к препаратам первого и второго (резервного) ряда, а также ко всем фторхинолонам (Surikova O.V. et al.,2005; Сивков А.Ю. и др., 2006; Воронкова О.В. и др., 2007).
Для борьбы с лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза в настоящее время ведутся интенсивные научные работы с целью повышения антимикобактериальной активности противотуберкулезных препаратов, изучение их механизма действия и адресной доставки антибиотиков и химиопрепаратов в зараженные мико бактериями макрофаги, что имеет важное клиническое значение.
Концепция «Национальной системы химической и биологической безопасности РФ (2009 - 2013)», утв. постановлением Правительства Российской Федерации от 27 октября 2008 года.
В Российской Федерации для борьбы с туберкулезом была разработана
система не только федеральных, но и региональных программ борьбы с этим
заболеванием (Шевченко Ю.Л., 2000). На период 2007-2011 гг. в России
действует федеральная целевая программа "Предупреждение и борьба с
социально значимыми заболеваниями", где 34% всего финансирования
программы направлены на противотуберкулезные мероприятия. Важной
целью программы является поддержка исследований, направленных на
создание современных средств диагностики, профилактики и лечения
туберкулеза. Данное положение актуализировало проблему
импортозамещения лекарственных препаратов зарубежного производства на отечественные и показало государственную значимость задач по разработке новых средств лечения и иммунопрофилактики опасных инфекционных заболеваний для обеспечения биологической безопасности Российской Федерации (Пальцев М.А., 2003).
Как известно, вакцинный штамм BCG из М. bovis был получен французскими учёными Кальметтом A. (Calmette А.) и Гереном К. (Guerin С.) в результате 13-летнего культивирования М. bovis (230 пассажей) на картофельно-глицериновой среде с желчью (Petroff S.A., Branch А., 1928). Однако этот вакцинный штамм и его подтипы не обеспечивают полной защиты от туберкулеза (Cole S.T., 1998) и способны вызывать генерализованные BCG-инфекции (Малярова Е.Ю. и др., 2005; Rezai M.S. et al, 2008).
В существующем в настоящее время комплексе мер по борьбе с туберкулезом, наряду со специфической химиотерапией, по-прежнему имеет большое значение вакцинопрофилактика. Поэтому исследования, направленные на совершенствование эффективности и безопасности вакцины против туберкулеза, являются актуальной задачей (Ryan A.A. et al., 2007; Майе А.С. et al, 2007).
Повышение иммуногенности вакцины BCG, создание на ее основе новых вакцинных композиций, конструирование вакцин против туберкулеза на основе достижений современной молекулярной биологии и иммунологии имеют важное значение для общественного здравоохранения. Учитывая широкий иммунобиологический эффект цитокинов, лекарственные композиции, изготовленные на их основе, могут быть использованы для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний (Кетлинский С.А., 1992; Воробьев А.А., 1999; Авдеева Ж.И., 2000). Показано, что совместное введение вакцины BCG с гамма-интерфероном (ИФН-у) приводит к ускорению дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, а совместное введение с
фактором некроза опухоли (ФНО-а) стимулирует их пролиферацию (Ярилин А.А., 1997).
Одним из многообещающих подходов к решению проблемы туберкулеза является создание субъединичных вакцин (Elhay M.J., 1997; Orme I.M., 1997). К настоящему времени обнаружено несколько антигенов (Ag85B, Ag85A, ESAT-6, Ag38, Agl9, PstS-3 и др.) M. tuberculosis, которые индуцировали иммунопротективный ответ на грызунах (Lowrie D.B., 1997; Strugnell R.A., 1997; Ulmer J.B., 1997; Zhu X., 1997; Denis О., 1998; Tanghe A., 1999; Dhiman N., 1999; Brandt L., 2000). Однако для существенного повышения иммунопротективного действия при вакцинации новыми более перспективными иммуногенами необходимо разрабатывать более эффективные системы доставки антигенов. Особый интерес вызывают липосомы (Fries L.F., 1992) и биодеградируемые микрочастицы (Vordermeier Н.М., 1995) в качестве систем доставки антигенов для избирательного воздействия на иммунокомпетентные клетки макроорганизма, имеющие в своей основе высокоочищенные протективные антигены, например белки теплового шока (Murray P.J., 1992). Перспективность этого направления была продемонстрирована конструированием вирусоподобных частиц на основе реополиглюкина и специально отобранных В- и Т-клеточных эпитопов, которые содержат только необходимые для формирования специфического иммунитета фрагменты вирусных белков (Лебедев Л.Р. и др., 2000; Karpenko L.I. et al., 2003). Публикации по аналогичным исследованиям, направленным на создание иммунопрофилактических средств против бактериальных патогенов в доступной литературе отсутствуют.
Известно, что иммуногенный потенциал антигенов в составе микрочастицы намного выше, чем в виде растворимых белков (Gregoriadis G., 1999; Venkataprasad N., 1999; Beyer Т., 2001). Кроме того, искусственные частицы должны имитировать везикулы, образующиеся при апоптозе инфицированных М. tuberculosis макрофагов, что является особенно важным с учетом незавершенного характера фагоцитоза при туберкулезной инфекции. Такие везикулы и, предположительно, микрочастицы способны эффективно процессироваться дендритными клетками и активировать цитотоксические лимфоциты, что является необходимым фактором повышения иммунного ответа на введение противотуберкулезных вакцин (Sibille Y., 1990; Kaufmann S.H., 2001).
Таким образом, широкое распространение лекарственно-устойчивых форм туберкулеза в мире и в Российской Федерации и высокая значимость для общественного здравоохранения разработки и создания новых
эффективных средств профилактики и лечения туберкулеза явились основанием для проведения данной исследовательской работы.
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования - конструирование средств иммунопрофилактики туберкулеза, оценка их эффективности и безопасности и изучение антимикобактериальных свойств препарата на основе конъюгата карбоксиметил-(1^3)-|3-0-глюкана с моксифлоксацином.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать методы получения мико бактериальных частиц (МБЧ) на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis и иммуномодулирующих препаратов;
исследовать физико-химические свойства полученного препарата;
оценить противотуберкулезную и иммунологическую эффективность и безвредность (острая токсичность, хроническая токсичность, анафилактогенность, пирогенность) применения микобактериальных частиц по сравнению с вакциной М. bovis BCG на лабораторных животных;
- изучить антимикобактериальную активность конъюгата
моксифлоксацин-карбоксиметил-(1^3)-|3-0-глюкана in vitro и in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые разработан и предложен метод получения искусственных микобактериальных частиц на основе белков вакцинного штамма М. bovis для создания экспериментальных серий иммунопрофилактических препаратов против туберкулеза.
В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования искусственных микобактериальных частиц на основе белков вакцинного штамма М. bovis для формирования противотуберкулезного иммунитета при экспериментальной туберкулезной инфекции у морских свинок, вызванной М. bovis (штамм 14ХВНИИБТЖ).
Впервые предложены вакцинные композиции на основе искусственных микобактериальных частиц (МБЧ-ИФН-у и МБЧ-ИФН-у-ФНО-а), которые обладают выраженными протективными свойствами и не уступают по эффективности вакцине М. bovis BCG.
Показано, что микобактериальные частицы на основе дсРНК (двуспиральная рибонуклеиновая кислота) и белков М. bovis BCG безвредны для лабораторных животных (атоксичны, апирогенны, не анафилактогенны).
Впервые показана элиминация микобактерий туберкулеза в линии макрофагальных клеток J774, а также в органах и тканях инфицированных экспериментальных лабораторных животных под действием конъюгата моксифлоксацин-карбоксиметил-(1^3)-|3-0-глюкана с дозозависимым эффектом.
Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием дальнейших работ по конструированию лечебно-профилактических препаратов нового поколения на основе искусственных иммуногенов в виде микрочастиц и получения конъюгированных форм химиопрепаратов. Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 2 патентами Российской Федерации на изобретения: №2190417 от 10.10.2002 «Средство для снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных лекарственных препаратов» и №2242245 от 20.12.2004 «Искусственные микобактериальные частицы и противотуберкулезная вакцинная композиция на их основе».
Апробация работы
Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях и симпозиумах:
Международном симпозиуме «Интегративная Медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004);
Международном Кейстоуновском симпозиуме «Интеграция хозяина и патология патогена» (Вистлер, Канада, 2005);
VI-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, Россия, 2005);
Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Бангкок-Паттая, Таиланд, 2006);
П-ой интернациональной конференции «ТБ вакцины в мире» (Вена, Австрия, 2006);
Ш-ей Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006);
Работа выполнена в 2001-2009 годах в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках научных тем организации и по грантам МНТЦ. Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании научного семинара ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (2009).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Искусственные микобактериальные частицы на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis BCG и дсРНК являются атоксичными и апирогенными для лабораторных животных и обладают высокой стабильностью и хорошей растворимостью.
-
Искусственные микобактериальные частицы обладают выраженным иммуностимулирующим воздействием на факторы Т-клеточного иммунного звена.
-
Созданные противотуберкулезные искусственные микобактериальные частицы (МБЧ) на основе антигенов вакцинного штамма М. bovis BCG и дсРНК обладают высокой иммуногенностью при экспериментальной туберкулезной инфекции.
-
Совместное введение МБЧ и цитокинов (ИФН-у и ФНО-а) формируют более высокую степень защиты лабораторных животных к экспериментальной туберкулезной инфекции. При этом степень резистентности и интенсивность факторов клеточного иммунного ответа возрастает в ряду: BCG - МБЧ - МБЧ-ИФН-у-ФНО-а - МБЧ-ИФН-у.
5. Препарат карбоксиметил-(1^3)-|3-0-глюкана с ковалентно связанным
моксифлоксацином обладает выраженным антимикобактериальным
эффектом.
Публикации результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 11 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации. Получено 2 патента Российской Федерации.
Структура и объем работы
