Введение к работе
Актуальность работы.
Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка диагностических наборов реагентов для выявления генетически модифицированных источников (ГМИ) в семенном материале, кормах животных, пищевых продуктах, лекарственном сырье и т.д. Принцип работы современных приборов для анализа ДНК базируются на количественном определении ДНК, используя метод ПЦР в реальном масштабе времени. Зарубежные приборы и реактивы для них, разработанные для осуществления данной методологии достаточно дороги. В настоящее время существуют отечественные аналоги приборной и реагентной базы; доступные по ценовым и качественным характеристикам, для лабораторий, проводящих массовые исследования.
В цели настоящей работы входило создание отечественной методической и компонентной базы для создания зондов для ПЦР в реальном масштабе времени, необходимых для решения различных биотехнологических задач с применением данного метода. В качестве модельной системы нами был выбран широко использующийся компонент для создания векторных систем экспрессионной кассеты трансгенных растений - NOS-терминатор.
В настоящий момент невозможно полностью исключить ошибки в сертификации ГМР. Продукты, полученные с использованием ГМИ, по международным нормам и согласно санитарным нормам РФ должны нести на себе информацию в виде маркировки, из которой явно следовало бы, что продукт был получен из генетически модифицированных организмов. Пищевой продукт маркируется соответствующим образом, если соотношение трансгенного продукта к генетически не модифицированному - более 0,9%.
Для анализа необходимы микроколичества исследуемого образца, содержащего целевой фрагмент ДНК.
В настоящее время ПЦР в реальном масштабе времени широко используются в биологии, медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Являясь количественным методом, он обладает высокой точностью, специфичностью и надежностью.
Одним из ключевых моментов для повышения эффективности ПЦР в реальном масштабе времени является планирование и синтез флуоресцентных зондов, являющихся источником информационного сигнала в данном методе анализа.
Существуют несколько важных критериев при создании зонда для ПЦР в реальном масштабе времени. Эффективность работы зонда определяется:
*В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, к.б.н. ВТ. Лунин.
Список принятых сокращений: ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени; ГМИ - генетически модифицированный источник.
Длиной олигонуклеотида, связывающего донор и акцептор;
Комбинацией доноров и акцепторов флуоресценции;
Дислокацией гибридизованного зонда на матрице;
Влиянием близкорасположенных к донору или акцептору флуоресценции нуклеотидов в зонде; пуриновые и пиримидиновые основания, являясь ароматическими гетероциклами, наводят помехи на флуоресцентный сигнал.
Цель работы: Создание методологической и компонентной базы, а также оригинальных схем синтеза флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции для синтеза зондов ПЦР-РВ. Разработка подхода для эффективного планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.
Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
Создание отечественной компонентной и методологической базы для синтеза зондов ПЦР-РВ;
Обоснование выбора математического аппарата на основе Форстеровской теории переноса энергии, необходимого для планирования зондов ПЦР в реальном масштабе времени;
Проведение математического расчета Фостеровского радиуса, оптимального с точки зрения используемой системы.
Синтез зондов ПЦР-РВ с различной длиной нуклеотидной части, включая зонды с расчетной длиной олигонуклеотидного спейсера согласно Форстеровской теории. Проверка синтезированных зондов на объекте растительного происхождения, с целью определения в нем NOS-терминатора - широко распространенного маркера генетически модифицированных растений;
Научная новизна. На сегодняшний день информация о планировании зондов для ПЦР в реальном масштабе времени скудна и противоречива, которая говорит о создании флуоресцентных зондов исходя только из эмпирических данных INasarabadi S., BioTechniques, 1999, Vol.27(6), р 1116-1117, Holland P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, Vol.88, p.7276-7280, Bernard P.S., Analytycal Biochemistry, 1999, № 273, p. 221-228]. В данной работе была предпринята попытка подготовить практическую и теоретическую базы для планирования зондов, обладающих хорошими характеристиками, как по возрастанию флуоресцентного сигнала, так и низкому уровню флуоресцентного шума. Результаты работы показали, что с помощью универсальной методологической базы можно создать диагностические наборы для выявления ГМИ в различных сельскохозяйственных культурах, генетически модифицированных груше, сое и кукурузе. Спектральные характеристики красителей, встроенных в зонды, имеют высокий уровень разгорания флуоресценции, а также высокий квантовый выход, и имеют те же спектральные характеристики, что и зарубежные аналоги.
Осуществлена проверка теоретического подхода для планирования флуоресцентных зондов, основанного на эффекте Форстера с правками, учитывающих вероятностную пространственную ориентацию красителя и гасителя
молекул флуоресценции. Задача подобного плана была поставлена и осуществлена впервые.
Практическая значимость работы.
Показана перспективность использования математического аппарата, основанного на теории Форстера, что позволит эффективно планировать зонды ПЦР-РВ. Данный шаг несомненно уменьшит число экспериментальных итераций, зачастую необходимых для создания корректно работающей системы в ПЦР-РВ. Результаты работы позволят работать с компонентами собственного производства, что позволит уменьшить материальные и временные затраты на создание флуоресцентных зондов для ПЦР-РВ.
Публикации по теме диссертационной работы.
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября, 2004), II Международном конгрессе «Биотехнология; состояние и перспективы развития» (Москва 10-14 ноября, 2003) а также на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 29 мая - 1 июня, 2007).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на //с~ страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 121 источник.
