Содержание к диссертации
Введение
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов
1.2.Характеристика возбудителя 16
1.З.Основньїе механизмы передачи возбудителя 19
1.4. Диагностика 22
1.4.1. Эпизоотологическая и клиническая диагностика 22
1.4.2. Патоморфологическая диагностика 23
1.4.3. Лабораторная диагностика 24
1.5. Специфическая профилактика и лечение 27
1.6. Заключение по обзору литературы 32
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 36
3.1. Эпизоотологические особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов в Российской Федерации 36
3.2. Изучение вирусной геморрагической болезни кроликов в фермерском хозяйстве 41
3.2.1. Изучение вирусной геморрагической болезни в экспериментальных условиях 44
3.3. Разработка технологии изготовления вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов 47
3.3.1. Определение накопления возбудителя в организме кроликов 47
3.3.2.Получение и оценка качества вирусного сырья 48
3.3.3. Инактивация вирусного сырья 49
3.3.4. Технология конструирования вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов 50
3.3.5. Изучение иммунобиологических свойств вакцины вирусной геморрагической болезни кроликов 53
3.3.5.1. Определение сроков наступления и длительности иммунитета 56
3.3.5.2. Накопление уровня вирусоспецифических антител у привитых кроликов 57
3.3.5.3. Сохраняемость вакцинных препаратов 58
3.3.6. Изучение вакцины в производственных условиях 59
3.4. Разработка технологии изготовления иммунной сыворотки против вирусной геморрагической болезни кроликов 62
3.4.1. Разработка схем иммунизации и технологии получения иммунной сыворотки 62
3.4.2. Изучение лечебного действия иммунной сыворотки 65
3.4.3. Изучение защитного действия иммунной сыворотки 66
3.4.4. Продолжительность защитного действия иммунной сыворотки 67
3.4.5. Сохраняемость иммунной сыворотки при хранении 68
3.4.6. Изучение иммунной сыворотки в производственных условиях 69
3.4.7. Изучение иммунной сыворотки в серологических реакциях при диагностике 74
3.4.7.1. Изучение эпизоотологической и клинической диагностики 74
3.4.7.2. Изучение патоморфологической диагностики 76
3.4.7.3. Изучение методов лабораторной диагностики 78
ВЫВОДЫ 89
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 91
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 92
ПРИЛОЖЕНИЯ 104
- Особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Эпизоотологические особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов в Российской Федерации
Введение к работе
Актуальность темы. Кролиководство является важной отраслью животноводства, поставляющей ценное диетическое мясо и сырье для меховых изделий. Кроликов используют в качестве лабораторной модели при изучении различных вопросов физиологии, иммунологии в медицине, в ветеринарии, как продуцентов при изготовлении и контроле биологических препаратов. Разведением кроликов занимаются общественные и частные хозяйства, многие питомники медицинских и научно-исследовательских учреждений страны.
Кролики болеют различными незаразными и инфекционными болезнями. Для успешного разведения кроликов и получения от них высокой продуктивности важное значение имеет защита их от различных заболеваний (И.А. Бакулов и соавт., 1996; А.А. Шевченко, Л.В. Шевченко 2002, 2003). Помимо применяемых ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике заболеваний у кроликов необходимо разрабатывать специфические биопрепараты для профилактики и лечения инфекционных болезней. Кролики болеют многими инфекционными болезнями, наиболее опасными являются вирусная геморрагическая болезнь (ВГБК), миксоматоз и пасте-реллез кроликов, которые наносят огромный экономический ущерб кролиководству, связанный с массовой гибелью этих животных (И.А. Бакулов и соавт., 1988; 1992; 1996; В.В. Гуненков, 1987; А.Ф. Евтушенко, 1992; А.А. Шевченко, Л.В. Шевченко 2002,2003).
В 1984 г. в Китае была зарегистрирована вспышка болезни кроликов, вызывающая большую смертность этих животных. В связи с тем,что у павших кроликов в паренхиматозных органах наблюдали геморрагические изменения, эта болезнь была названа «вирусная геморрагическая болезнь кроликов», которая широко была распространена в Китае, затем в нашей стране и Европе (Н. АН et.al.,1984; F. М. Cancellotti, 1985; И.А. Бакулов и соавт., 1988; 1992; 1996). В нашей стране, там где не вакцинируют кроликов, регистрируются случаи заболевания и гибели кроликов от ВГБК. Самой надежной защитой кроликов от ВГБК является профилактическая вакцинация этих животных. Для специфической профилактики ВГБК в нашей стране разработана жидкая инактивированная вакцина (В.И. Жестерев, 1998). Однократная иммунизация кроликов в дозе 0,5 мл формирует иммунитет, обеспечивающий защиту от вирулентного вируса на 7-е сутки продолжительностью не менее 6 месяцев. У кроликов на месте введения вакцины возникали воспаление, раздражение, абсцессы, хромота и др. осложнения.
В Краснодарском крае в хозяйствах, где не вакцинируют кроликов, ежегодно регистрируются случаи заболевания и гибели этих животных. Вакцина, имеющаяся в стране, выпускается только во Владимирской области, которую владельцы кроликов не всегда могут своевременно приобрести и вакцинировать кроликов. Нами в 2000 г. в одном из хозяйств в пригороде Краснодара в период эпизоотии был выделен вирус ВГБК. Это позволило нам изучить биологические свойства вируса и разработать вакцину.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось разработка технологии изготовления инактивированной вакцины и иммунной сыворотки для профилактики, лечения и диагностики ВГБК. В соответствии с целью поставлены следующие задачи:
1. Изучить основные биологические свойства нового изолята вируса ВГБК «Краснодар-2000».
2. Разработать технологию изготовления инактивированной вакцины против ВГБК и технологическую линию для производства вакцины в условиях Краснодарской биофабрики.
3. Разработать технологию изготовления иммунной сыворотки для лечения и профилактики ВГБК.
4. Изучить иммунобиологические свойства инактивированной вакцины и иммунной сыворотки в экспериментальных и производственных условиях.
5. Разработать проект нормативно-технической документации на изготовление и контроль инактивированной вакцины и специфической сыворотки для профилактики и лечения ВГБК.
6. Разработать рекомендации по профилактике, ликвидации и диагностике ВГБК.
Научная новизна работы. Впервые в Краснодарском крае выделен изолят «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК, изучены вирулентность, патоген-ность, иммуногенность.
Определены основные принципы конструирования новой инактивированной тканевой вакцины против ВГБК с разными адъювантами (теотропин квасцовая, теотропин гидроокисьалюминиевая, теотропинглицеринизиро-ванная, формолквасцовая, формолглицеринизированная, формолгидро-окисьалюминиевая).
Установлена высокая специфичность, иммуногенность и безвредность опытных образцов инактивированной вакцины против ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.
Показана высокая специфичность иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК.
Установлена высокая лечебно-профилактическая эффективность специфической иммунной сыворотки против ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.
Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением на патент №2202130881 от 27.11.02. «Вакцина инактивированная тканевая против вирусной геморрагической болезни кроликов», патент № 2202130882 от 27.11.02. «Способ изготовления инактивированной тканевой вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов».
Теоретическая и практическая значимость. При разработке технологии изготовления инактивированной вакцины и специфической сыворотки для профилактики и лечения ВГБК учитывали основные принципы конструирования инактивированных высокоиммуногенной вакцины и специфической лечебно-профилактической сыворотки.
Разработана технология изготовления инактивированной теотропин квасцовой, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропин глицеринизирован-ной, формолквасцовой, формолглицеринизированной, формолгидроокись-алюминиевой вакцины против ВГБК из нового изолята «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК и производство освоено на ФГУ Краснодарская биофабрика.
Разработана технология изготовления специфической иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК.
Новые инактивированные вакцины против ВГБК и лечебно-профилактическая иммунная сыворотка для лечения и профилактики ВГБК с положительными результатами испытаны в производственных условиях.
Разработан проект нормативно-технической документации на изготовление и контроль инактивированной вакцины и специфической сыворотки против ВГБК (ТУ, инструкция по изготовлению и контролю инактивированной вакцины против ВГБК; ТУ, инструкция по изготовлению и контролю специфической сыворотки против ВГБК, утвержденные директором ФГУ Краснодарская биофабрика в 2003 г., наставление по применению инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов и наставление по применению специфической сыворотки против вирусной геморрагической болезни кроликов, утвержденные Департаментом ветеринарии РФ 13.11.2002 г.)
На основании результатов исследований разработаны «Рекомендации по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае» (2003 г.)
«Рекомендации по профилактике и ликвидации вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае» (2004 г.).
Результаты наших исследований используются в учебном процессе при изучении курса «Ветеринарная вирусология» в Кубанском государственном аграрном университете.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2002 г., 2003 г., 2004 г.).
Материалы диссертации доложены на международной научно-практической конференции «Успехи современного естествознания» (Египет, г. Хургада, 2003 г.).
На 4-ой региональной научно-практической конференции молодых ученых, к 80-летию Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2002 г.).
Научно-практической конференции Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар, 2004 г.).
По материалам исследований опубликовано 4 научных работы, в том числе 2 статьи в центральных научных журналах. Личный вклад
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов прове дены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделу 3.3. оказывал практическую и консультативную помощь главный технолог ФГУ Краснодарская биофабрика кандидат ветеринарных наук, Кружнов Н.Н. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
1. Распространение вирусной геморрагической болезни кроликов в Российской Федерации.
2. Изучение биологических свойств изолята «Краснодар-2000» возбудителя ВГБК.
3. Результаты разработки технологии изготовления новой инактивированной вакцины против ВГБК.
4. Результаты изучения иммунобиологических свойств инактивированной теотропин квасцовой, теотропин гидроокисьалюминиевой, теотропин гли-церинизированной, формолквасцовой, формолглицеринизированной, фор-молвакцины, формолгидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.
5. Результаты разработки технологии изготовления специфической иммунной сыворотки для диагностики, лечения и профилактики ВГБК в экспериментальных и производственных условиях.
Особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов
Вирусная геморрагическая болезнь. Возбудитель ВГБК - вирус с однонит-чатой РНК, без оболочки, вирионы небольших размеров от 28-33 (Gregg D.A., House С, 1989), 32-34 (Liu Н.С. et al., 1986) до 49 нм (Ohlinger V. F., Haas В., Thiel H.J., 1989; 1993), сферические с икосаэдрическим типом симметрии. Нуклеокапсиды имеют плотное ядро диаметром 20 нм, капсо-меры в количестве 32 величиной 5-6 нм, выступающие над поверхностью вирионов (Власов Н.А., 1998). Этот вирус отнесен исследователями к представителям семейства пикорнавирусов (Gao S.Z et al., 1986; Granzow H. et al., 1989; Xu W., Du N. Liu S.J., 1988). Другие авторы (Deng R. Т., Xu W., Du W., 1987; Deutrich V., 1982) описали геном как однонитчатую ДНК с молекулярным весом 2,4x106 дальтон и длиной 1,84-2,2. По мнению Kiepker (Kiepker Ch., 1990), вирион содержит 4 структурных протеина с молекулярной массой 30-60 кД, в то время как Ohlinger V. F. et al.(1989) описывает 8 протеинов, молекулярная масса которых составляет 17-75 кД. Haralambiev Н. et al. (1990) считают, что вирусная нуклеиновая кислота не-сегментирована, разрушается ДНК-азой I типа, но не РНК-азой, окрашивается акридином оранжевым в красный цвет. Содержит нуклеотидные основания в процентном соотношении: цитозин - 23,7; гуанин - 20,5; тимин -31,9; аденин - 23,9, что указывает на принадлежность этого вируса к семейству парвовирусов.
Сотрудники ВНИИВВиМ установили, что возбудитель этой болезни -РНК-содержащий вирус, по морфологии сходный с калицивирусами (Малахова М.С. с соавт., 1990; Макаров В.В. с соавт., 1992). Такого же мнения придерживаются и другие исследователи (Ohlinger V. F. et al., 1989; 1993). Китайские исследователи отнесли его к семейству пикорнавирусов. Были также изучены физико-химические свойства, структура вирионов и полипептидный состав, охарактеризован геном и проведено его клонирование в прокариотическом векторе. Истинная природа нуклеиновой кислоты учеными института, также как и другими исследователями, пока окончательно не установлена.
При определении физико-химических характеристик исследуемого очищенного вируса ВГБК установлена плавучая плотность вирионов в хлори-стом цезии 1,32 — 1,36 г/см и 1,36 — 1,38 г/см . Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы составляет 1,25 — 1,27 г/см3. Коэффициент седиментации вируса составляет 180 S (Малахова М.С. с соавт., 1990; Макаров В.В. с соавт., 1992), а по данным китайских ученых -162 S (Liu Н.С. et al., 1986).
Для культивирования вируса ВГБК были испытаны отечественными исследователями многие клеточные культуры: первично- трипсинизирован-ные, перевиваемые различного происхождения, органные культуры взрослых кроликов (Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Семенихин А.Л., 1992). Пер-вично-трипсинизированные (фибробласты куриного эмбриона, почка, печень, легкие, тестикулы и сердце кролика), перевиваемые линии клеток (почки свиньи, собаки, сайги, козы, козерога, лося, обезьяны, РК-15, IRRS-2, HeLa, Vero), а также штаммы диплоидных клеток почки кролика (Liu Н.С. et al., 1986). Результаты оказались отрицательными. Однако в Китае получена перевиваемая линия клеток почки крольчонка, чувствительная к вирусу ВГБК. Другие исследователи (MarcatoP.S. et al., 1989) в клеточной линии НЕР-2 (эпидермные карцинемные клетки гортани человека) и Du N.X. (1990). В линии клеток FRK-855 (диплоидная линия клеток почки кролика) удалось наблюдать цитопатическое действие вируса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
До 1986 года в популяции домашних кроликов в стране отмечали относительное благополучие по инфекционным болезням. И вот неожиданно возникла новая ранее неизвестная болезнь, сопровождающаяся опустошительными эпизоотиями с массовой гибелью кроликов (100%-ная летальность). Эта инфекционная болезнь была впервые описана в 1984 году в Китае и получила название «вирусная геморрагическая болезнь кроликов». Возможно, мы никогда бы не узнали о существовании этой болезни в Китае, если бы она не вышла за его пределы в 1986 году, появившись среди кроликов приграничного с Китаем совхоза «Дальневосточный» Еврейской АР Хабаровского края. Диагноз не был поставлен, кроликов убили на Биробиджанском мясокомбинате, а шкурки отправили на Воскресенскую фетровую фабрику Московской области. Вскоре болезнь широко распространилась по районам Московской области и другим регионам страны. В 1987 г. были поражены кролики 31 административной территорий, где зарегистрировано 75 вспышек ВГБК. К 1994 году неблагополуч-ными по ВГБК являлась 51 административная территория Российской Федерации, количество вспышек снизилось по сравнению с предыдущими годами в 1,5 - 2 раза. Наибольшее распространение ВГБК отмечали в Московской, Тверской, Владимирской, Смоленской и Тульской областях, Краснодарском крае и других регионах (таблица 1).
Из данных табл. 1 видно, что с 1987 по 1993 годы вспышки ВГБК регистрировались часто от 21 до 75 в год, а в последующие годы от 1 до 3 вспышек. Это связано с тем, что на местах перестали вносить ВГБК в отчетные документы.
Появление и стремительное распространение ВГБК сказалось существенными последствиями для нашей страны: большие потери в меховом сырье для предприятий легкой промышленности, уменьшение поста Ф вок диетического мяса для населения, остановка отдельных предприятий биологической промышленности и прекращение выпуска некоторых медицинских и ветеринарных препаратов.
Первыми от новой болезни особенно пострадали кролиководы Московской области, когда в начале 1987 года стали неожиданно погибать тысячи кроликов, охватывая постепенно все районы области. Широкому распространению ВГБК способствовала относительно высокая плотность кроликопоголовья в области, совмещение функций заготовительных опе раций по скупке кроличьих шкурок и продаже комбикормов для этих животных, большой обмен и использование кроликов для медицинских, ветеринарных диагностических и научных исследований и в производстве биологических препаратов, а также полное отсутствие научных и практических ветеринарных знаний об этой болезни.
До установления первичного диагноза на ВГБК для борьбы с ней применяли мероприятия, разработанные для искоренения других инфекционных высококонтагиозных болезней этого вида животных (пастереллез, миксоматоз). Однако они оказались не эффективными. Только благодаря изучению зарубежной литературы, проведенной за 20 лет, изучение эпизоотологии, клинических и патоморфологических признаков удалось во ВНИИВВ и М (Шевченко А.А. и др. 1987) изучить это новое заболевание кроликов, разработать и предложить для специфической профилактики новые инактивированные тканевые жидкую и лиофилизированные вакцины против ВГБК, а также ассоциированную вакцину против миксоматоза и ВГБК. Применение новых вакцинных препаратов позволило значительно снизить напряженную эпизоотическую ситуацию в стране по ВГБК и с 1995 по 1996 годы не было ни одного случая заболевания кроликов этой болезнью. Практика последних лет показала, что только своевременная вакцинация кроликов в хозяйствах и частном секторе позволяет предотвратить появление и распространение ВГБК. Однако там, где не вакцинируют кроликов против ВГБК, это заболевание встречается. К сожалению в последние годы не поступает объективная информация в Департамент ветеринарии РФ, а в отдельных регионах учет не прводится. Проведенный анализ официальных отчетов Департамента ветеринарии МСХ РФ с 1997 по 2001 годы показал, что ВГБК в 1997 г. была зарегистрирована в Курской области, в 1998 г. в Рязанской области, в 1999 г. в Приморском крае и республике Дагестан, в 2000 г. в Брянской и Смоленской областях. В Краснодарском крае практически ежегодно отмечают случаи заболевания ВГБК у не вакцинированных кроликов в частном секторе, плановый учет проводится не во всех районах, лабораторная диагностика не проводится, хотя необходимость в этом имеется. В Краснодарском крае, по данным отчетов Государственного управления ветеринарии края, ежегодно более 150 тыс. кроликов вакцинируют против ВГБК, однако не известно сколько остается не вакцинированных, которые могут быть потенциальными источниками инфекции.
Эпизоотологические особенности распространения вирусной геморрагической болезни кроликов в Российской Федерации
Исследования по изучению биологических свойств вируса ВГБК разных штаммов проводили в виварии Краснодарской государственной биофабрики. Для этого взяли две группы кроликов не привитых против ВГБК в возрасте 3,5 — 4 месяцев и заразили первую группу вирусом ВГБК штамм «Воронеж - 87» в виде 10%-ной суспензии печени павшего кролика от ВГБК, а вторую группу животных заразили свежеприготовленной 10% -ной суспензией печени павшего кролика в эпизоотическом очаге на кролиководческой ферме г. Краснодара в марте 2000 г. изолят «Краснодар — 2000». Вируссодержащую суспензию вводили по 0,5 мл внутримышечно. Наблюдение за клиническим состоянием кроликов вели в течение 5 дней. Результаты проведенных исследований представлены на рис. 3.
Дни наблюдений, суши
Рисунок 3.Динамика эпизоотического процесса ВГБК при заражении кроликов разными штаммами вируса ВГБК в экспериментальных условиях
Из данных рис. 3 видно, что 16 кроликов пало через 48 часов после заражения вирусом ВГБК штамм «Воронеж - 87» («В - 87») из 20 зараженных, легальность составила 80%. Во второй группе животных из 20 зараженных кроликов вирусом ВГБК изолят «Краснодар - 2000» («К -2000») через 48 часов пало 5 голов, через 72 часа - 3 головы и через 96 часов—5 голов, летальность составила 65%.
У кроликов, зараженных штаммом «В-87» вируса ВГБК болезнь развивалась молниеносно, без видимых клинических признаков, внешне здоровые животные вскрикивали перед смертью и погибали, у отдельных особей наблюдали кровянистые или пенистые истечения из носовой полости. При внешнем осмотре трудно было отличить кролика, больного ВГБК, даже за несколько минут до гибели от других клинически здоровых кроликов. Через 48 часов пало 80% зараженных кроликов, что характерно для молниеносного течения болезни. В опыте два кролика не пали, так как у них выработались специфические антитела к вирусу ВГБК. При исследовании сыворотки крови от этих животных, титр специфических антител составил 1:32 - 1:64.
Динамика развития эпизоотического процесса ВГБК у кроликов, зараженных изолятом «К -2000» несколько отличалась, болезнь развивалась быстро и динамично, гибель первых 5-ти кроликов наблюдали через 48 часов, у больных животных наблюдали угнетение, отказ от корма, вялость, взъерошенность шерстного покрова, опускание ушей, температура тела повышалась до 41 С, перед гибелью животные резко вскрикивали, подпрыгивали, за 1 — 2 часа до гибели наблюдали пенистые и кровянистые истечения из носовой полости. Падеж кроликов наблюдали в течение 3 — 4 дней после заражения по 3 — 5 голов в день, через 96 часов пало 13 голов из 20 зараженных, что составляет 65% . В опыте 7 кроликов из 20 зараженных остались живыми, так как у них выработались вирусспецифические антитела против ВГБК. При исследовании сыворотки крови от этих кроликов в РЗГА титр специфических антител к вирусу ВГБК составлял от 1:32 до 1:128. По степени развития эпизоотического процесса у зараженных кроликов изолят «К — 2000» вируса ВГБК относится к слабовирулентным.
Таким образом, при экспериментальном изучении эпизоотического процесса ВГБК у кроликов, зараженных изолятом «К — 2000» вируса ВГБК наблюдали быстро и динамически развивающиеся периоды эпизоотического процесса, характерные для сверх острого и острого течения, в отличие от молниеносного течения эпизоотического процесса после заражения штаммом «В - 87» вируса ВГБК . Изолят «К - 2000» вируса ВГБК относится к слабовирулентному штамму.
