Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин Мазуркова, Наталья Алексеевна

Введение к работе

Актуальность исследования. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев гриппа и других ОРВИ (Stohr К., 2002). Субтип вируса гриппа A/H5N1 (грипп птиц, «птичий грипп») обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом из 15 известных (Chang S. et al., 2007). Полагают, что его генетическая реассортация с сезонным вирусом гриппа человека может привести к появлению высоко патогенного пандемического варианта (Octaviani СР. etal.,2011).

Важной частью противоэпидемических мероприятий по ограничению распространения гриппа и снижению смертности является вакцинопрофилактика, осуществляемая с помощью живых и инактивированных вакцин. В настоящее время оба типа гриппозных вакцин в России производятся на развивающихся куриных эмбрионах. Этот субстрат далеко не идеален: помимо возможной контаминации инфекционными агентами, получение куриных эмбрионов и, соответственно, вакцин на их основе, может быть блокировано при вспышке гриппа птиц. В этих условиях альтернативой может стать использование в качестве субстрата перевиваемых линий клеток (ГОЖ*), позволяющее развернуть быстрое и масштабное изготовление культуральных вакцин (Merten O.W., 2002; Genzel Y. et al., 2009). ВОЗ с 1995 г. рекомендует разрабатывать и производить гриппозные вакцины с использованием в качестве субстрата ПЛК, аттестованных в соответствии с международными требованиями (WHO, 1995, 2005). В России имеется аттестованный в соответствии с требованиями ВОЗ банк клеточной линии MDCK (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») (Радаева И.Ф. и др., 2005).

Важнейшей характеристикой вакцинных препаратов является безопасность, повысить которую можно, исключив, или ограничив использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин (Ulmer J.B. et al, 2006).

* Список сокращений - на обороте автореферата.

Государственные агентства, контролирующие производство

фармацевтической продукции в Европе (European Medicine Evaluation Agency, EMEA) и США (Food and Drag Administration, FDA) призвали ведущие фармацевтические компании исключить или ограничить использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин (Castle P. et al., 1999). Это подчеркивает актуальность разработки технологий, позволяющих заместить компоненты животного и человеческого происхождения продуктами растительной природы. Ряд исследователей разрабатывает среды для культур клеток млекопитающих, свободные от животных компонентов. Так, при производстве культуральных гриппозных вакцин перевиваемые линии клеток выращивают в бессывороточных питательных средах: MDCK - в средах MDSS2 и MDSS2N (Франция) (Merten O.W., 2002), EpiSerf (Gibco) (Голландия) (Brands R. et al, 1996; Palache AM. et al, 1999), UltraMDCK (BioWHITTAKER); Vero - в среде EM (Axell Biotechnologies) (Австрия) (Kistner 0., 1998, 1999, 2001).

В России в настоящее время не существует отечественных бессывороточных и малосывороточных культуральных питательных сред для клеток MDCK и Vero - субстрата гриппозных вакцин, а импортные дороги, и их использование нерентабельно. Следовательно, разработка отечественных культуральных сред, не содержащих сыворотку, или содержащих ее сниженные концентрации, является крайне актуальной. Наибольший интерес для культуральных технологий гриппозных вакцин, которые должны быть не только рентабельны, но и отвечать все более жестким критериям биологической безопасности, могут представлять среды на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья. Стоимость вакцинного препарата также важна для обеспечения вакциной против гриппа всего населения (Позиция ВОЗ, 2005), и она может быть значительно снижена при применении отечественных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов доступного растительного сырья.

Замена препаратов животного происхождения (сыворотки и трипсина в

составе питательных сред, желатина (желатозы) в составе стабилизатора для ЖГВ) на растительные продукты является еще одной возможностью повышения безопасности гриппозных культуральных вакцин.

Безопасность гриппозных вакцин может быть также повышена за счет использования синтетических пептидов, соответствующих консервативным аминокислотным (АК) последовательностям сайтов гемагглютинина, которые вызывают иммунный ответ. Такие вакцины могут обеспечить защиту от всех типов вируса гриппа, включая пандемические штаммы, и их разработка рекомендована ВОЗ (WHO, Geneva, 1997).

Цель исследования. Цель настоящей работы - разработать и апробировать препараты на основе материалов растительного происхождения для получения эффективных и безопасных культуральных и пептидных гриппозных вакцин. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать бессывороточные и малосывороточные питательные
среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с
использованием растительного протеолитического фермента бромелаина.

1. Апробировать бессывороточные и малосывороточные питательные среды на основе ферментативных гидролизатов соевой и рисовой муки, полученных с помощью бромелаина и трипсина, для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и оценить их влияние на морфологические, пролиферативные и кариологические характеристики клеток, а также на чувствительность клеток к штаммам вируса гриппа, используемым для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины.

2. Оценить возможность замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья и определить оптимальные условия их применения для максимального накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero штаммов вируса гриппа для производства инактивированной (субтипов A/H1N1, A/H3N2 и типа В) и живой вакцины (субтипа A/H5N2).

4. Провести сравнительное исследование ультраструктурных параметров репродукции вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в культурах клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных средах на основе растительных компонентов и контрольных средах и при замене трипсина на папаин и бромелаин.

5. Разработать и апробировать стабилизатор на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина, в качестве средства сохранения в процессе лиофильного высушивания максимальной инфекционной активности выращенного в перевиваемой линии клеток MDCK вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2.

6. Определить оптимальные условия использования растительных
препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора) на основных
стадиях разработки живой культуральной вакцины против вируса гриппа
субтипа A/H5N2 в роллерах.

7. Оценить генетическую и фенотипическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2, выращенного на перевиваемой линии клеток MDCK с использованием растительных препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора), а также его иммуногенность на экспериментальных моделях животных.

8. Оценить влияние растительного имуномодулятора Иммуномакс на иммунный ответ экспериментальных животных при иммунизации их синтетическими пептидами НА1 гемагглютинина вируса гриппа субтипа A/H3N2.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые: - сконструирована культуральная малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, и изучены ее физико-химические свойства;

- доказана пригодность и перспективность применения разработанной
питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки для
наработки перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и вируса гриппа;

- экспериментально обосновано применение растительных протеаз (папаина
и бромелаина) в составе гидролизатных питательных сред и определены
оптимальные биотехнологические условия их использования для накопления в
перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero вируса гриппа в производстве
инактивированной и живой вакцины, позволяющие обеспечить выход вирусной
массы, сравнимый с таковым при применении трипсина;

- экспериментально установлено, что использование экспериментальных
сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и растительных
протеаз не влияет на морфогенез и репродуктивную активность вируса гриппа
субтипа A/H5N2 при культивировании его в клетках MDCK и Vero;

экспериментально показано, что применение стабилизатора, сконструированного на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает в процессе лиофильного высушивания максимальное сохранение инфекционной активности наработанного в клетках MDCK вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2;

- экспериментально показано, что использование растительных препаратов
не влияет на генетическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа
субтипа A/H5N2 и на параметры иммунного ответа при введении этого штамма
лабораторным животным;

экспериментально показано, что применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс в качестве адъюванта усиливает иммунный ответ на синтетические пептиды из вариабельного и консервативного сайтов НА1 гемагглютинина вируса гриппа A/H3N2.

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены 2 патентами РФ (№ 2330885, № 2377295).

Практическая значимость работы. Экспериментально обосновано использование растительных препаратов (питательных сред, ферментов, стабилизатора) на основных стадиях роллерной технологии разработки безопасной и эффективной культуральной живой вакцины против гриппа субтипа A/H5N2.

Показаны экономические преимущества применения питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина, для создания и производства культуральных гриппозных вакцин.

Установленные параметры применения растительных препаратов при разработке и производстве культуральных гриппозных вакцин обеспечат повышение их безопасности.

Внедрение растительных препаратов в производство культуральных гриппозных вакцин позволит отказаться от дорогостоящих импортных компонентов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментальная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, содержащая сниженное количество (с 5-10 % до 2 и 3 %) сыворотки, пригодна для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, являющихся субстратом для культуральных гриппозных вакцин.

2. Использование растительных ферментов бромелаина и папаина в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса позволяет получать высокие инфекционные титры вирусов гриппа (9,0-9,5 lg ТЦД₅о/мл) для производства инактивированной и живой вакцин в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero. Максимальное накопление вакцинных штаммов вируса гриппа для живой и инактивированной гриппозной вакцины в клеточных линиях MDCK и Vero при использовании растительных препаратов (сред и ферментов) зависит от

множественности инфекции, вида и концентрации протеазы, адаптации штаммов вируса к клеткам. Для живой гриппозной вакцины критическим является время сбора «урожая» вируса.

3. Стабилизатор, содержащий 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает сохранение инфекционной активности вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), выращенного в перевиваемой клеточной линии MDCK при использовании питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои и в присутствии бромелаина, на стадии сублимационного высушивания и при хранении в течение 1 года.

4. Усовершенствование технологии приготовления живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 с использованием растительных препаратов включает (1) наработку клеток MDCK в роллерах в малосывороточной (2 %) среде на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с использованием бромелаина; (2) накопление в присутствии 20 мкг/мл бромелаина холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в выращенных клетках; (3) введение в культуральную вируссодержащую жидкость стабилизатора, содержащего 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина; (4) сублимационное высушивание.

5. Сухие культуральные (MDCK) вакцинные образцы, содержащие штамм вируса гриппа субтипа A/H5N2, полученные с использованием растительных препаратов, генетически стабильны и иммуногенны для мышей. При двукратной интраназальной иммунизации животных они индуцируют выработку системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц A/H5N1.

6. Применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс обеспечивает усиление иммунного ответа у мышей при иммунизации синтетическими пептидами из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи

гемагглютинина вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), без дополнительного введения адъюванта Фрейнда.

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» СОП на основные стадии создания живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 с использованием растительных препаратов: СОП № 3-007/01-12 «Получение ферментативного гидролизата соевой муки с использованием бромелаина», СОП № 3-006/01-12 «Выращивание клеток перевиваемых линий MDCK и Vero в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина», СОП № 3-005/01-12 «Репродукция холодоадаптированного вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в присутствии бромелаина или папаина в перевиваемой клеточной линии MDCK, выращенной в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина». Разработаны технические условия «Ферментативный гидролизат соевой муки, полученный с помощью бромелаина, для научных исследований, сухой». Результаты работы внедрены в практику преподавательской работы кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 7-й, 8-й и 9-й Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 1999, 2000, 2001), Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Казахстан, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирская область, Кольцово, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Варадеро, Куба, 2011), Международной научно-практической конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Мальдивские острова, 2011), Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Рим-Флоренция, Италия, 2011), Международной научно-практической конференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва-Париж, Россия-Франция, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 21 статья (16 статей - в журналах, рекомендованных ВАК), 2 патента и 17 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах текста, состоит из глав: «введение», «обзор литературы», «материалы и методы», «результаты и обсуждение», «заключение», «выводы» и списка литературы, который содержит 482 источника, из них 79 отечественных и 403 -иностранных. Диссертация включает 66 таблиц и 20 рисунков.

Похожие диссертации на Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин

Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рициномГрачева Мария Андреевна

Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растенийАндрианова, Екатерина Павловна

Антагонистическая активность штамма Bacillus subtilis ИБ-54 к дерматомицетам и его использование в разработке антимикотического препаратаГиззатуллина, Светлана Вадимовна

Разработка биологических препаратов для повышения питательности и эффективности использования кормовЛаптев Георгий Юрьевич

Разработка и использование новых нетрадиционных сорбирующих и антиоксидантных препаратов в системе оптимизации питания и повышения продуктивности бройлеров и кур-несушекЕрисанова, Оксана Евгеньевна

Разработка технологии рекультивации нефтезагрязненных объектов с использованием комплекса микробиологических препаратовБиккинина Альмира Габдулахатовна

Разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата и оценка эффективности его использованияСолдатова, Любовь Сергеевна

Разработка технологии получения препарата литических ферментов, расщепляющих клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов, с использованием мутантного штамма Streptomyces griseinus 11-84Петрова Наталья Тихоновна

Антигенные и иммуногенные свойства штаммов вируса болезни Марека при создании эффективных экспериментальных и производственных вакцинЯрыгина Елена Игоревна

Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс]Ефременко Анна Александровна