Содержание к диссертации
1. Введение 10
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 21 2.1 БОЛЕЗНЬ МАРЕКА 21
2.1.2. Классификация ВБМ 22
2.1.2.1. Вирусы 1 серотипа 23
2.1.2.2. Вирусы 2 серотипа 27
2.1.2.3. Вирусы 3 серотипа 28
2.2. МОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ 30
2.3. БИОЛОГИЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВБМ, ВГК И ВГИ 34
2.3.1. Патогенез и типы взаимодействия вируса с клеткой 34
2.3.2. Культивирование 36
2.3.3. Вирусные ДНК 39
2.3.4. Локализация генов 39
2.3.5. Различия и сходства между серотипами 40
2.4. СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА БОЛЕЗНИ МАРЕКА РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ВАКЦИН
2.4.1. Вакцины на основе штаммов ВБМ серотипа 1 46
2.4.1.1. Вакцины на основе аттенуированных вирулентных штаммов ВБМ
2.4.1.2. Вакцины на основе аттенуированных умеренно вирулентных штаммов ВБМ
2.4.1.3. Вакцины на основе особо вирулентных штаммов ВБМ. 48
2.4.2. Вакцины на основе штаммов ВБМ серотипа 2 48
2.4.3. Вакцины на основе штаммов ВБМ серотипа 3 49
2.4.4. Поливалентные вакцины 52
2.4.5. Рекомбинантные вакцины 53
2.4.6. Инактивированные вакцины 56
2.4.7. Сравнительная эффективность применяемых вакцин 57
2.4.8. Причины неэффективности вакцинации и способы их устранения
2.5. АНТИГЕНЫ ВБМ 62
2.5.1. Антиген А 63
2.5.2. Антиген В 64
2.5.3. Антиген С 67
2.5.4. Антиген D 67
2.5.5. Другие антигены и белковые комплексы, обнаруженные в составе ВБМ, ВГК и ВГИ
2.6. МЕХАНИЗМ ИММУНИТЕТА И ИММУННЫЕ PEAKЦИИ В ОРГАНИЗМЕ ЦЫПЛЯТ, ИНФИЦИРОВАННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ СЕРОТИПАМИ ВБМ
2.6.1. Персистенция вируса болезни Марека 72
2.6.2. Патогенез 73
2.6.3. Генетическая резистентность 74
2.6.3.1. Пассивно приобретенная резистентность к БМ 75
2.6.3.2. Активно приобретенная резистентность к БМ 76
2.6.4. Поликлональные антитела, обеспечивающие резистентность к болезни Марека
2.6.5. Моноклональные антитела к антигенам ВБМ, обладающие 81 высокой специфичностью
2.6.5.1. Получение гибридом, синтезирующих МАТ 81
2.6.5.2. Применение МАТ для изучения структуры и функций антигенов ВБМ 1,2 и 3 серотипов
2.6.6. Антиидиотипические антитела, участвующие в иммунных реакциях организма
2.6.6.1. Идиотипический каскад и внутренний образ антигена 85
2.6.6.2. Антиидиотипические антитела — вакцинные препараты нового поколения
2.7. СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВБМ, ВГК и ВГИ
2.7.1. Серологические методы, широко применяемые для индикации антигенов ВБМ и антител к ним
2.7.2. Особенности получения компонентов ИФА для индикации 92 антигенов ВБМ и антител к нему
2.7.3. Применение ИФА для индикации антигенов ВБМ, ВГК и ВГИ и антител к ним
2.8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ PEAKЦИИ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА
2.9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 109
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 109
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ 126
4.1. ТЕСТ-СИСТЕМА ИФА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ
МАРЕКА
4.1.1. Разработка способов выделения антител из желтков яиц кур для получения иммуноферментных
4.1.2. СИНТЕЗ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНОГО КОНЪЮГАТА 131
4.1.2.1. Гипериммунизация животных препаратом IgG 131
4.1.2.2. Определение специфической активности и чистоты гипериммунных сывороток к IgG кур
4.1.2.3. Выделение из гипериммунной сыворотки животных специфических антивидовых антител к IgG желтка яиц кур методом аффинной хроматографии
4.1.2.4. Конъюгация антивидовых антител (анти-IgG кур) с пероксидазой
4.1.3. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОСТАНОВКИ ИФА ДЛЯ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ ВГИ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА
4.1.3.1. Полиморфизм вирионов ВГИ в составе вакцины против БМ, выявляемый в ИФА
4.1.3.2. Изучение в ИФА фракций, полученных при разделении и концентрировании вируса герпеса индеек в системе водорастворимых полимеров
4.1.3.3. Изучение фракционного и морфологического состава бесклеточного ВГИ (производственные серии сухой вакцины против БМ на основе штамма FC-126)
4.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА СТАБИЛИЗАЦИИ ВГИ В ВАКЦИНЕ
4.2.1. Влияние метода стабилизации на сохранность активности ВГИ в сухой вакцине
4.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БМ ИЗ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ ШТАММА FC-126 МЕТОДОМ ИФА
4.2.3. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА НАТИВНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БМ МЕТОДОМ ИФА
4.3. ДЕТЕКЦИЯ АНТИГЕНЫХ ДЕТЕРМИНАНТ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОТИПОВ ВБМ И АНТИТЕЛ К НИМ МЕТОДОМ БЛОКИРОВАНИЯ ИФА
4.4. ВЫДЕЛЕНИЕ АПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ ВГК И ИЗУЧЕНИЕ В ИФА ИХ ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ
4.4.1. Исследование сывороток на наличие антител к ВБМ, ВГК и ВГИ в птицехозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ
4.4.2. Исследования сывороток крови на наличие антител к ВГИ, ВГК и ВБМ в птицехозяйствах с низким уровнем заболеваемости БМ
4.4.3. Разработка методов выделения и поддержания апатогенных вариантов ВГК
4.4.4. ИФА для детекции ВГК 164
4.4.5. Изучение взаимовлияния различных штаммов ВБМ при 165 применении биполивалентных вакцин против БМ
4.4.5.1. Изучение явления протективного синергизма отечественных штаммов ВГК
4.4.5.2. Испытания иммуногенных свойств поливалентной вакцины против болезни Марека (Комиссионный опыт)
4.4.6. Зависимость иммуногенных свойств штаммов "42" и "50" ВГК от репродуктивной активности вируса в культуре клеток (Производственный опыт)
4.4.7. Сравнительное изучение эффективности вакцин и вакцинных штаммов на SPF-цыплятах (Комиссионный опыт)
Щ 4.4.8. Экспериментальные серии сухой бивалентной вакцины 175
4.5. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВБМ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПЕРЕКРЕСТНОЙ СЕРОТИПИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ТЕРМОДЕНАТУРАЦИЯ АНТИГЕНОВ)
4.5.1. Влияние термоденатурации на антигенную активность препаратов на основе ВГИ
4.5.2. Изучение антигенных свойств препаратов на основе ВГК 183
4.5.3. Фракционирование антигенных (термоинактивированных) препаратов ВГИ на колонке
4.6. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, ИМИТИРУЮЩИХ «ВНУТРЕННИЙ ОБРАЗ» АНТИГЕНОВ ВГИ
4.6.1. Получение специфических сывороток, содержащих антитела первого порядка (ИД AT) к инфекционному ВГИ
4.6.2. Получение антител первого порядка к термоинактивированным антигенам ВГИ
4.6.3. Получение антиидиотипических антител на антитела к (Гф термоинактивированным антигенам ВГИ
4.7. ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЪНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВБМ
4.8. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВБМ С ПОМОЩЬЮ ИЦР 207
4.8.1. Применение ПЦР для дифференциации ДНК ВБМ 1 и 3 серотипов
4.8.2. Выявление ДНК ВБМ в патологическом материале с по- 212 мощью ПЦР
4.9. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ АНТИТЕЛ КЛАССА IgG В КОЛЛЕКЦИОННЫХ СЫВОРОТКАХ, РЕАГИРУЮЩИХ С РАЗНЫМИ СЕРОТИПАМИ ВБМ
4.9.1. Поликлональные анти-ВБМ антитела, полученные в лабораторных условиях
4.9.2. Поликлональные анти-ВБМ антитела, полученные в условиях птице хозяйств
4.10. ДИНАМИКА РАЗВИТИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У КУР, ПРИВИТЫХ МОНО-, БИ- И ПОЛИВАЛЕНТНЫМИ ВАКЦИНАМИ ПРОТИВБМ 4.10.1. Изучение динамики материнских антител класса IgG у цы- 225 плят из птицехозяйств с различной эпизоотической ситуацией по БМ
4.10.2. Динамика антител в сыворотке крови цыплят, привитых 230 вакциной на основе ВГИ с различным содержанием gA в препарате (Производственный опыт) ,
4.10.3. Взаимосвязь между уровнем поствакциналъных антител и 232 устойчивостью привитых цыплят к БМ (Производственный опыт)
4.10.4. Определение серологического статуса вакцинированной 238 против БМ птицы с целью оценки качества применяемых препаратов (Комиссионный опыт 1)
4.10.5. Изучение эффективности вакцинации различными сероти- 240 пами ВБМ и их сочетаниями (Комиссионный опыт 2)
4.10.6. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИН ПРОТИВ БМ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ПТИЦЕХОЗЯЙСТВАХ РФ (ОСТРЫЙ КОМИССИОННЫЙ ОПЫТ)
4.10.7. Динамика антител в сыворотках цыплят из птицехозяйств с различной степенью благополучия по БМ
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 253
6. ВЫВОДЫ 278
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 281
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 283
9. ПРИЛОЖЕНИЯ
Введение к работе
Болезнь Марека (БМ) - лимфопролиферативное заболевание кур, является серьезной проблемой для птицеводства. Возбудитель - онкогенный ДНК-содержащий альфагерпесвирус [153, 159, 160, 161, 205, 256] - обладает способностью сохраняться и в хозяине, и в экосистеме, при этом эволюционирует, что приводит к появлению более вирулентных популяций патотипов вируса болезни Марека (ВБМ) первого серотипа. Это, в свою очередь, порождает новые научные и хозяйственные проблемы [168, 189, 303, 326]. Кроме вирулентных штаммов ВБМ 1 серотипа, в природе существуют два неонкогенных: 2 се-ротип - вирус герпеса кур (ВГК) и 3 серотип - вирус герпеса индеек (ВГИ).
ВБМ - патогенный герпесвирус, который может вызывать: 1) Т-клеточные лимфомы; 2) изменения периферических нервов, характеризующиеся лимфопролиферативной инфильтрацией и демиелинизацией, как правило, приводящие к параличу или слепоте; 3) различные проявления иммунодефицита и 4) атеросклероз у цыплят с нормальной холестеринемией, необыкновенно схожие с болезнями человека [44, 105].
Болезнь Марека регистрируется практически во всех странах мира с развитым промышленным птицеводством, наносит огромный экономический ущерб [352]. Ведущим звеном в системе организации профилактических мероприятий при БМ является эпизоотическая характеристика птицехозяйств [4, 15, 23, 37], основанная на точной и своевременной диагностике заболевания. А правильный выбор подходящей по своим иммунизирующим свойствам вакцины для конкретного птице хозяйства способен полностью исключить вспышки БМ.
Многие годы превалирующее значение имели вакцинные препараты на основе штамма FC-126 ВГИ, выделенного от индеек Kawamura и Witter (независимо друг от друга) [266, 279]. Первая отечественная вакцина против БМ также создавалась из штамма FC-126 ВГИ. Существенный вклад в разработку нативной и сухой вирус вакцины внесли ученые ВНИТИБП (Никитин Е.Е., Лукина В.А. [56], Токарик Э.Ф., Слепенко Т.Б. [92], Блехерман Б.Е., Перель-штейн Л.Г.), ВНИВРШ (Коровин Р.Н. [46], Придыбайло Н.Д. [82]), ВГНКИ (Зубцова Р.В., Деревлева Т.А., Баррос Палома Е.В.) и др.
Однако в последнее время, в связи с селекцией полевых штаммов и появлением ОВВБМ данный тип вакцин значительно снизил эффективность, а порой и полностью утратил способность защищать птицу от БМ, так как высоко вирулентные мутанты содержат антигены-мишени, несоответствующие таковым на вакцинном вирусе [44, 239, 302, 451]. В исследованиях американских ученых, особенно в работах Witter [436, 445, 450, 454] показано, что эффективность ВГИ значительно усиливается даже против ОВВБМ, если применять его в комбинации с вирусами второго серотипа.
Эффективным инструментом для идентификации вирусных антигенов являются моноклональные антитела (МАТ), которые позволяют изучать структуру и функции вирусных белков [302, 325, 395, 436]. Bullow и Biggs подтвердили, что антиген A (gA) является группоспецифическим, но тем не менее имеет и типоспецифические детерминанты [177, 398].
В последнее время для идентификации патогенных и непатогенных штаммов и изолятов ВБМ широко применяют такие высокочувствительные методы исследования генома, как рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция, молекулярная гибридизация и секвенирование [166, 199, 401, 402, 467].
Применение рестрикционного эндонуклеазного анализа показало существенное различие между образцами ДНК 1, 2 и 3 серотипов, а также между ДНК вирусов низкого и высокого пассажа в культуре клеток [256, 299, 379].
Результаты проведения ДНК-ДНК гибридизации между геномами ВБМ и ВГИ указывают на то, что уровень гомологии нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих gA, составляет 73%, а сравнение генов, кодирующих gB трех серотипов ВБМ выявило наличие в них существенных различий [34].
Хотя серотипы ВБМ различимы в серологических реакциях, они имеют много общих антигенов. Сыворотка против одного серотипа обычно перекрестно реагирует с антигенами других серотипов, но гораздо слабее, чем с гомологичными [219, 222].
Возможность прогнозирования поствакцинального гуморального иммунитета у привитой птицы, а также создание и применение поливалентных вакцин, в составе которых имеются актуальные штаммы ВГК, позволяет надежно профилактировать БМ за счет вытеснения из птицехозяйств патогенных штаммов ВБМ.
Динамика накопления и уровень специфических антител зависит от генетической и возрастной резистентности птицы, но в большей степени — от самого вируса [181, 342]. Существование штаммо-, серотипо- и видоспецифических вирусных антигенных детерминант позволяет дифференцировать антитела к вакцинным и полевым вирусам БМ, а также выделять и исследовать отдельные вирусные антигены, ответственные за выработку антител, нейтрализующих цельные вирионы. Подобные работы уже привели к созданию экспериментальных вакцин без инфекционного вируса [176, 189].
Всестороннее углубленное изучение антигенных особенностей ВБМ и его взаимосвязей с другими представителями Herpesviridae будут способствовать в дальнейшем изготовлению новых поколений вакцинных препаратов, возможно препятствующих селекции ВБМ в природных условиях и появлению высоковирулентных патотипов вируса.
Изучение антиген-антительного взаимодействия в организме животных привело ученого N. Jerne (1974) [272] к заключению о существовании сетевой регуляции иммунной системы, элементами которой являются антитела 1, 2 и т.д. порядка. Предпринятые в последствии попытки экспериментально индуцировать образование антиидиотипических антител, несущих «внутренний об 13
раз» антигенов и использовать эти антитела в качестве вакцинных препаратов, оказались удачными. Что касается ВБМ, то исследования в этом направлении проводили в основном с антигеном MATS А [197] и опухоле-ассоциированными антигенами [309].
Таким образом, изучение антигенных и иммуногенных свойств штаммов ВБМ, входящих в коммерческие и экспериментальные вакцины, напрямую влияющих на эпизоотическую обстановку в птицехозяйствах, зависящую не только от типа применяемого препарата, но также и от циркуляции патогенных штаммов, представляется своевременным и обоснованным.
Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.
