Содержание к диссертации
Введение
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
2.1 Характеристика болезни Марека и вирусов герпеса птиц 9
2.2. Характеристика инфекционной бурсальной болезни 18
2.3.Характеристика инфекционной анемии цыплят 30
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
3.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
3.2.1 Изучение поствакцинального статуса поголовья птиц и эпизоотическое состояние птицепредприятий 55
3.2.2 Сравнительное изучение некоторых биологических свойств вакцинных штаммов вируса ИББ 62
3.2.2.1 Изучение реакции цыплят на парентеральное введение вакцин против ИББ из разных штаммов и вакцинацию в суточном возрасте 65
3.2.2.2 Изучение ммуносупрессивных характеристик разных вакцинных штаммов вируса ИББ 69
3.2.3. Эффективность вакцины против ИББ из штамма «Био-92»
в производственных условиях 74
3.2.4 Разработка метода совместного культивирования вирусов ИББ
и ВГИ для получения бивалентной вакцины 76
3.2.5 Эффективность опытных образцов бивалентной
вакцины в лабораторных условиях 81
4. ОБСУЖДЕНИЕ 84
5. ВЫВОДЫ 91
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 93
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 94
8. ПРИЛОЖЕНИЯ 128
- Характеристика болезни Марека и вирусов герпеса птиц
- Характеристика инфекционной бурсальной болезни
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Введение к работе
Эпизоотическое и финансовое благополучие птицеводческих хозяйств во многом обусловлено своевременным предупреждением вспышек наиболее опасных заболеваний вирусной этиологии, которые могут наносить катастрофический с экономической точки зрения ущерб промышленному птицеводству [11,12, 13, 14, 17, 18,20,21,22,23,24,25,29,40].
Вакцинопрофилактика этих заболеваний стала неотъемлемой частью технологии ведения птицеводства. Известна выраженная взаимозависимость эффективности вакцинации против БМ от эффективности вакцинации против ИББ и наоборот, которая объясняется наличием феномена иммунодепрессии как у полевых (патогенных), так и некоторых вакцинных штаммов [109, 134, 163, 164, 205, 305, 308, 317, 329].
Помимо этого, описан ряд заболеваний, возбудители которых обладают целенаправленно выраженными иммуносупрессивными свойствами: инфекционная анемия цыплят (ИАЦ), болезнь Марека [84] и др.
В связи с повторяющимися вспышками заболеваний, вызываемых новыми высоковирулентными штаммами возбудителя, в т.ч. на фоне вакцино-профилактики, учёные в нашей стране и за рубежом (В.А.Лукина и соавт., 1992, 1999, 2000; Ш.К.Кулешбякова и соавт., 1998; Э.Д.Джавадов, 1999; Н.Д.Придыбайло, 1991; А.С.Алиев 1995; А.В.Борисов 1998, 2000; В.В.Герман и соавт., 1995; В.И. Смоленский и соавт., 1996; Payne L.N. et.al.,2000; Purchase H.G. et.al. 1998; Rispens B.H.1992; Ross N.D.,1999; Witter R.L. 1997; BumsteadN.,1998; Dybin J.K. et.al.,1998; DarmitorioT.V. et.al., 1997; Etterodossi N. et.al., 1999; Van den Berg T.P. et.al., 1999; Fusell L.W., 1998) уделяют большое внимание совершенствованию вакцин, изучению биологических особенностей вакцинных и эпизоотических штаммов, изменений эпизоотической ситуации в том числе при широком использовании вакцин и иммунодепрес-сиях разной этиологии. Причинами возникновения, быстрого распространения ИББ и снижения эффективности вакцинопрофилактики являются высокая контагиозность вируса ИББ, его способность изменять степень патогенности [129]. Болезнь Гамборо (ИББ) с середины 80-х годов после появления высоковирулентных штаммов вируса стала настоящим бедствием для птицеводческой отрасли многих стран мира [186,187, 241]. Отход бройлеров достигал 25%, молодняка яйценоских пород птиц - более 70% [319].
В РФ [1,3] пик заболевания зарегистрирован в 1996 году, когда ИББ была установлена в 46 пунктах 27 административных территорий РФ [29].
Для обеспечения эффективности иммунизации живыми вакцинами необходимо соблюдение целого ряда требований. Возникают проблемы точности дозировки при массовой выпойке вакцин, способов применения, появления выраженных или скрытых иммуносупрессий, роль которых до настоящего времени не достаточно изучена. В связи с этим изучение факторов иммуносупрессий, обусловленных как вакцинными, так и полевыми вирусами представляется актуальным. Проблема повышения иммунологической и про-тивоэпизоотической эффективности вакцинации против БМ и ИББ в том числе и в случаях циркуляции в хозяйстве высоковирулентных вариантов возбудителей, снижение или полное устранение влияния поставакцинальной иммуносупрессий, разработки новых более рациональных схем применения препаратов чрезвычайно актуальна.
1.2 Цель и задачи исследований
Целью исследований являлось изучение в сравнительном аспекте некоторых биологических свойств вакцинного штамма вируса ИББ «Био-92» для конструирования ассоциированной бивалентной вакцины против инфекционной бурсальной болезни и болезни Марека, причин иммунодепрессий у цыплят в производственных и экспериментальных условиях.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1 Провести эпизоотическое обследование птицехозяйств и изучить поствакцинальный статус поголовья птиц и причины иммуносупрессии, обусловливающие снижение эффективности вакцинопрофилактики.
2 Сравнительно изучить некоторые биологические свойства вакцинных штаммов вируса ИББ и эффективность вакцинопрофилактики.
3 Изучить реакцию цыплят на парентеральное введение вакцин против ИББ из разных штаммов и вакцинацию в суточном возрасте.
4 Изучить ммуносупрессивные свойства разных вакцинных штаммов вируса ИББ.
5 Установить эффективность вакцины против ИББ из штамма «Био-92» в производственных условиях.
6 Разработать метод совместного культивирования вирусов ИББ и ВГИ для получения комплексной вакцины.
7 Испытать эффективность опытных образцов бивалентной вакцины в лабораторных условиях.
1.3 Научная новизна
8 результате проведенных исследований в птицехозяйствах одной из областей РФ было установлено иммунодепрессивное состояние птицепого ловья, обусловленное циркуляцией вируса инфекционной анемии цыплят, коринбактерий и других факторов, получены положительные результаты по коррекции схем вакцинопрофилактики, получены новые данные о биологических свойствах вакцинного вируса ИББ штамма «Био-92» в сравнительном аспекте, разработан метод совместного культивирования штамма вируса ИББ «Био-92» и вируса герпеса индеек для конструирования бивалентной вакцины.
1.4 Практическая значимость
На основании полученных результатов подготовлены отчет о научных исследований по разработке бивалентной комплексной культуральной вакцины против ИББ и БМ, проект нормативной документации, необходимой для изготовления и испытания опытно-промышленных образцов препарата с целью последующей регистрации его в РФ и освоения производства — «Инструкция по применению бивалентной комплексной культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни и болезни Марека»; СТО и «Инструкция (лабораторныйо технологичекий регламент) по изготовлению бивалентной комплексной культуральной вакцины против инфекционной бур-сальной болезни и болезни Марека».
1.5 Положения, выносимые на защиту
На защиту вносятся сравнительные данные о реакции цыплят на внутримышечную вакцинацию цыплят вакцинами против ИББ из разных штаммов, о возможности использования вакцин для цыплят в суточном возрасте, эффективности вакцинопрофилактки ИББ препаратом из штамма «Био-92» вируса ИББ, методика совместного культивирования вируса ИББ штамма «Био-92» и вируса герпеса индеек для конструирования бивалентной комплексной культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни и болезни Марека и результаты испытания бивалентной комплексной культуральной вакцины против инфекционной бурсальной болезни и болезни Марека в лабораторных условиях.
1.6 Апробация
Основные положения, материалы диссертации и выводы доложены на:
- международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова, ВНИТИБП, г. Щелково (2006);
- научно-практической конференции «Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы», по священной памяти академика Россельхозакадемии Р.Н. Коровина, ВНИВИП, Санкт-Петербург (2007);
- научно-практической конференции «Актуальные проблемы здоровья скота, завозимого в Россию в рамках проекта «Развитие агропромышленного комплекса», ФГУ Федеральный центр по токсилогической и радиационной безопастности животных, Казань (2007 г.);
- межлабораторном совещании научных сотрудников ГНУ ВИЭВ имени Я.Р.Коваленко, Москва, (2008 г.);
- совещании научных сотрудников ОАО «Институт биотехнологий ветеринарной медицины», Москва (2008 г.).
1.7 Публикация научных исследований
Основные положения диссертации изложены в 6 научных работах, в том числе в журнале списка ВАК по специальности биология - 1.
1.8 Структура и объем работы
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 2 рисунками. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения. Список литературы включает 340 источников, в том числе 295 зарубежных.
Выражаем искреннюю признательность сотрудникам лаборатории лей-козологии и болезней птиц ВИЭВ за консультативную и практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы. Сердечно благодарим коллег и администрацию ОАО «Птицефабрика Михайловская», ОАО «Институт биотехнологии ветеринарной медицины», а также соавторов в списке публикаций по теме.
Характеристика болезни Марека и вирусов герпеса птиц
Болезнь Марека (БМ, нейролимфоматоз птиц, паралич птиц, энзоотический нейроэнцефаломиелит птиц) - высококонтагиозная вирусная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в 2-х формах: классической (поражение периферической и центральной нервной системы) и острой (лимфоидный лейкоз). Заболевание впервые описал в 1907 г Ж. Марек - ветеринарный патолог, профессор Королевского Венгерского университета [36].
Болезнь Марека - первая и пока единственная инфекционная болезнь домашней птицы, названная по имени его первооткрывателя. Несмотря на то, что болезнь была впервые описана, как полиневрит с параличами ног и крыльев у петухов, ещё" в 1907 году, возбудитель был идентифицирован в 1968 году [72, 95], специфическая профилактика вошла в практику промышленного птицеводства с начала 70-х годов прошлого века [275].
Вирусная природа этой болезни предполагалась давно, но лишь в 1967 г. 3 группы ученых, в Англии [95], и в США [229] одновременно и независимо друг от друга выделили от больных в культуре клеток герпесвирус цыплят и предоставили доказательства, указывающие на этиологическую роль этого агента. Многочисленные безуспешные попытки обнаружить и выделить его в инфекционной форме из опухоли или из органов больных птиц находились в противоречии с данными о высокой контагиозности этого заболевания. В 1969 г Calnek и др. [91] выявили вирусспецифический ИФ АГ в эпителии перьевых фолликул зараженных цыплят. Оказалось, что перьевые фолликулы — постоянное место локализации АГ в высокой концентрации. В 1970 г. вы делили из этого источника инфекционный внеклеточный вирус и вызвали с его помощью заболевание у цыплят. Эта работу продолжили Nazerian и Wit ter [230].
Возбудитель БМ, относится по современной классификации к семейству Herpesviridae [36, 68], роду Alphaherpesvirus. Вирионы имеют кубический тип симметрии и форму икосаэдра. Размер их составляет 85-100 нм, но иногда встречаются вирионы с оболочкой, размер которых достигает 150-170 нм. Вирионы содержат электронно-плотное ядро, 162 капсомера, представляющих полые цилиндры длиной 9-12 нм. Кольцеообразный нуклеокапсид с подковообразной сердцевиной расположен между двумя круглыми частицами, сердцевина нуклеокапсида с палочкообразными структурами представлена двумя круглыми пересекающимися пластинками, края которых электронно-плотные, а центр светлый [26,42]. Геном ВБМ представлен 2-мя уникальными последовательностями (U1 и Us) и целым набором прямых и инвертированных повторов [58]. В ПЦР дифференцировали патогенные и непатогенные варианты ВБМ серотип 1 [265, 288, 340]. ДНК ВБМ линейная двунитчатая, состоит примерно из 170 тыс пар нук-леотидов, включает уникальную длинную область (UL), фланкирующую часть инвертированных повторов (TRL и IRL) и уникальную короткую область (Us), фланкирующую другие участки областей инвертированных повторов (TRS и IRS) [272]. Таким образом геномная структура ВБМ слева направо описывается следующим образом: TRL - UL - IRL -IRs Us- TRS и похожа на таковую других альфагерпесвирусов [119].
Вирус БМ обладает сложной антигенной структурой. Основными глико-протеинами ВБМ являются А- АГ- (gp57-65) и В- АГ- комплекс (gplOO, gp60 и gp49). В составе вируса БМ выявлено 6 АГ, из которых наиболее важные А, В, С. [117, 118]. Выдвинута гипотеза о том, что gA является иммуносу-прессором на ранних стадиях инфекции. MATS А антиген обнаруживается в большинстве опухолевых клеток, трансплантируемых опухолях и трансформируемых клеточных линиях, но его нет в культуре фибробластов, инфицированной ВБМ либо ВГИ [286].
Характеристика инфекционной бурсальной болезни
Инфекционная бурсальная болезнь (инфекционный бурсит птиц, болезнь Гамборо) - широко распространенное, высококонтагиозное вирусное заболевание, поражающее неполовозрелых цыплят и индюшат.
Впервые установлено в 1957 году на птицефермах в окрестностях города Гамборо, штат Делавар (США), откуда и произошел основной синоним «болезнь Гамборо» (БГ) (Cover, 1960). Сообщения об инфекционной природе заболевания появились в 1962 году.
Cosgrove [115], отмечая высокую степень поражения почек у естественно и экспериментально зараженных цыплят, предложил назвать эту болезнь «инфекционный нефроз птиц» или «нефрозо-нефритный синдром». В дальнейшем возникли противоречия в отношении правильности данных обозначений, т.к. сходную картину вызывали некоторые другие возбудители, в частности, нефропатогенные штаммы вируса инфекционного бронхита птиц, что было показано в опытах Winterfield [322]. У птиц, зараженных возбудителем «нефроза», наряду с описанными Cosgrove признаками наблюдали специфические изменения фабрициевой сумки. Тогда же Winterfield [322, 323, 324, 325] и другим авторам [232] удалось выделить на куриных эмбрионах вирусный агент, вызывающий поражения бурсы, который был назван "инфекционный бурсальный агент". В 1970 г. Hitchner предложил использовать для обозначения заболевания, сопровождающегося специфическим поражением фабрициевой сумки термин "инфекционная бурсальная- болезнь" (ИББ).
Характерным для ИББ явилось быстрое распространение. Уже в 1960 г было поражено большинство бройлерных хозяйств США и Канады. Через 2 года ИББ зарегистрировали в Англии, с середины 70-х выявляли в большинстве стран с развитым промышленным птицеводством, с начала 90-х годов -в Австралии, Новой Зеландии и островах Тихого океана [103, 144].
В России ИББ начали отмечать с конца 70-х годов, о чем имеется ряд сообщений [1, 3]. Если в начале 80-х годов выявляли единичные случаи заболевания, то к началу 90-х годов зараженность птичьих стад была практически повсеместной. В этот период, в основном, циркулировали штаммы вируса со слабо выраженной вирулентностью, вызывающие гибель цыплят в пределах 5-6%.
С середины 90-х годов в Европе и Азии получили широкое распространение штаммы, обладающие высокой вирулентностью, вызывающие гибель молодняка 15-100 дневного возраста, вне зависимости от породы, направленности и условий содержания. Вспышки болезни сопровождались летальностью, достигающей 40-60, в некоторых случаях - 70 % [5, 7, 186, 241, 259].
В 1979 г после детального изучения структуры генома, биофизических и биохимических характеристик было предложено объединить вирус ИББ и еще четыре не классифицированных вируса животных в одно новое семейство Birnaviridae (Dobos, 1979) [124, 238 ] по структуре генома, представленной двумя сегментами двухцепочечной РНК (дцРНК) (BI RNA). Официально новое семейство было объявлено в 1984 г. Международной комиссией по таксономии вирусов на очередном конгрессе в Сендае (Япония) [75, 125].
Морфолгия и химический состав вирусов с двумя сегментами двухцепочечной РНК были описаны Dobos с соавторами. Морфологические особенности вируса ИББ были изучены Hirai с соавторами [171, 172] с использованием электронной микроскопии. Вирионы бирнавирусов лишены внешней оболочки, имеют икосаэдрический капсид диаметром 60 нм, состоящий примерно из 132 морфологических субъединиц [114, 124].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в период 2006-2008 гг. согласно рабочей программы в лабораториях болезней птиц и лейкозологии ГНУ ВИЭВ имени Я.Р.Коваленко и ОАО «Институт биотехнологий ветеринарной медицины».
Исследования проводились также на ряде птицепредприятий в 2005-2008 гг. В работе использовались первичнотрипсинизированные культуры клеток фибробластов эмбрионов перепелов (ФЭП), эпителиальных клеток эмбрионов перепелов (ЭКЭП), культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), б-10-дневные перепелиные и 6-14-дневные куриные эмбрионы, цыплята мясных и яичных пород и кроссов, SPF-цыплята, стандартные культу-ральные среды и растворы,
Вирус. Использовали штаммы вируса ИББ «Био-92» и ВГИ ФС-126, репродуцированные в разных биологических системах, а также вакцины из штаммов «БГ» и «Винтерфилд 2512», изготовленные во ВНИИЗЖ, вакцину против НБ из штамма Ла-Сота производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов» и другие вакцины. Вакцинный штамм-изолят вируса инфекционной бурсальной болезни "БИО-92" поддерживается на культурах фибробластов перепелиных и куриных SPF-эмбрионов.
Экспериментальные животные. В опытах использовали 9-10 дневные эмбрионы, полученные путём инкубации яиц SPF-кур, породы белый леггорн (Lomann); суточных цыплят породы белый леггорн из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств, SPF-цыплят, выведенных из яиц фирмы "Lomann", 8-9-дневные эмбрионы перепелов мясной линии ФГУП "Щёлковский биокомбинат".
Для изучение реакции цыплят на парентеральное введение вакцин против ИББ из разных штаммов и вакцинацию в суточном возрасте использовали вакцины против ИББ из штаммов «БГ», «Винтерфилд» и «Био-92». Исследования проводили на SPF-цыплятах 1-20 суточного возраста, выведенных из SPF-куриных эмбрионов, содержавшихся весь период эксперимента в изолированных условиях.
Для изучения возможности применения вакцин против ИББ парентеральным путем использовали 8 опытных групп по 10 SPF-цыплят, которых вакцинировали в 5 суточном возрасте внутримышечно по 0,5, 1 и 10 вакцинальных доз для вакцинации методом выпойки, 3 контрольные группы: контроль 1, группа вакцинированная вакциной из штамма «Био-92» в суточном возрасте, контроль 2 и 3 - контрольные невакцинированные группы.
Для изучения возможности применения вакцин против ИББ в суточном возрасте парентеральным путем и с питьевой водой использовали 9 опытных групп по 20 SPF-цыплят, которых вакцинировали в суточном возрасте внутримышечно разным количеством вакцинальных доз препаратов из штаммов «БГ», «Винтерфилд» и «Био-92», и одну контрольную группу - невакцинированные цыплята. Клиническое наблюдение вели в течение 21 дня.
Иммунодепрессивные свойства вакцинных штаммов вируса ИББ изучали на SPF-цыплятах, двукратно вакцинированных разными штаммами вируса ИББ по уровню поствакцинальных антител к вирусу НБ согласно " Manual of standards for diagnostic test and Vaccines//Offlce International des Epizooties. World organization for animal health, 1996" [326].
