Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1. Поступление и распределение нефтепродуктов в водных объектах 9
1.2. Процессы самоочищения водных масс от нефтепродуктов 11
1.2.1. Биологическое самоочищение водных масс 14
1.2.2. Интенсификация процессов самоочищения водным 16 гидробионтом
1.3. Распространенность и некоторые особенности углеводородокисляющих микроорганизмов 21
1.3.2. Пути поступления углеводородов в клетку 23
1.3.3. Влияние некоторых небиологических факторов на степень деградации нефти 24
1.4. Иммобилизованные клетки микроорганизмов 28
1.4.1. Иммобилизация в Са-альгинатный гель 30
1.5. Опыт создания и применения биопрепаратов в России и странах СНГ 33
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Выделение и идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов
2.2.1. Морфологические исследования 37
2.3. Культивирование микроорганизмов 38
2.4. Определение количества микроорганизмов 38
2.5. Иммобилизация микроорганизмов 39
2.6. Исследования деструкции нефти 40
2.6.1. Определение содержания остаточных нефтепродуктов 41
42 Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Применение альгината натрия для иммобилизации микроорганизмов - нефтедеструкторов
3.1.1. Иммобилизация бактериальных клеток в Са-альгинатных гранулах
3.1.2. Ассимиляция нефти иммобилизованными и свободными клетками Acinetobacter valentis в периодических условиях
3.1.3. Ассимиляция нефти иммобилизованными и свободными клетками Acinetobacter calcoaceticuss в периодических условиях
3.2. Разработка методики создания Са-альгинатных гранул, обладающих положительной плавучестью
3.2.1. Использование различных концентраций альгината натрия для получения плавающих Са-альгинатных гранул
3.2.2. Применение веществ с малой плотностью для придания Са-альгинатным гранулам положительной плавучести
3.3. Иммобилизация клеток нефтедеструкторов Acinetobacter valentis в гранулы Са-альгинатного геля, обладающих положительной плавучестью
3.3.1. Биодеструкция пленочной нефти иммобилизованными клетками Acinetobacter valentis
3.4. Исследования параметров, влияющих на свойства препарата 58
3.4.1. Влияние размера Са-альгинатных гранул на скорость биодеструкции нефти
3.4.2. Влияние концентрации иммобилизованных клеток на скорость биодеструкции нефти
3.4.3. Влияние биогенных элементов на скорость биодеструкции 68 нефти
3.4.4. Исследования возможности биоразложения Са-альгинатных гранул 74
3.5. Хранение полученного препарата 75
3.6. Механизм действия препарата 78
3.6.1. Рост и размножение микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах 78
3.6.2. Механизм биодеструкции пленочной нефти препаратом 81
3.6.3. Распределение клеток по глубине 84
3.7. Применение препарата 85
3.7.1. Влияние количества вносимого препарата на процесс биодеструкции 85
3.7.2. Влияние толщины нефтяной пленки на динамику биодеструкции нефти 88
3.7.3. Исследование динамики биодеструкции различных нефтей 92
3.8. Натурные испытания 93
3.9. Использование препарата для биоремедиации морской воды 95
3.9.1. Выделение и отбор галотолерантных штаммов микроорга-низмов-нефтедеструкторов 95
3.9.2. Деструкция нефти в морской воде галотолерантными штаммами 98
3.9.3. Биодеструкция нефти в морской воде ассоциациями микроорганизмов 100
3.9.4. Биодеструкция пленочной нефти в морской воде иммобилизованной ассоциациями микроорганизмов 103
3.9.5. Рост и размножение клеток дрожжей Yarrowia lipolytica в Са-альгинатных гранулах 106 3. 10. Микроводоросли 109
3.10.1. Культивирование микроводорослей Platymonas viridis и Dunaliella tertiolecta на средах, содержащих нефть 111
3.10.2. Исследование влияния на жизнедеятельность микроводорослей наличия сплошной нефтяной пленки 116
3.10.3. Влияние различных фракций нефти на скорость роста микроводорослей Platymonas viridis 123
3.11. Иммобилизация микроводорослей 125
3.12. Биодеструкция нефтяной пленки препаратом с совместно иммобилизованными микроорганизмами и микроводорослям 128
Выводы 132
Список использованной литературы 133
Приложения
- Поступление и распределение нефтепродуктов в водных объектах
- Выделение и идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов
- Применение альгината натрия для иммобилизации микроорганизмов - нефтедеструкторов
Введение к работе
Актуальность работы. Одним из основных и крупномасштабных
загрязнителей акваторий является нефть и продукты ее переработки. Применение комплексных методов ремедиации воды подразумевает использование на последнем этапе микробиологических методов очистки, основанных на применении микроорганизмов - нефтедеструкторов, для которых нефтепродукты являются основным источником углерода и энергии. Большинство биопрепаратов, применяемых для биоремедиации водных поверхностей, представляют собой сухие порошки, содержащие высушенные клетки нефтедеструкторов, либо пастообразные формы микроорганизмов. В последние годы для биоремедиации водных поверхностей используются иммобилизованные формы микроорганизмов, обладающие рядом преимуществ по сравнению со свободными клетками, наиболее ценным из которых следует считать положительную плавучесть. В качестве носителей для иммобилизации могут быть использованы как материалы природного происхождения, так и синтетические носители различной природы с плотностью меньшей, чем плотность воды. В основном, во всех методах биоремедиации воды с использованием иммобилизованных микроорганизмов наряду с окислением нефти происходит её сорбция на самих носителях. Это свойство, с одной стороны, позволяет быстрее удалить загрязнения с поверхности воды, делая доступным растворение кислорода в приповерхностном слое. С другой стороны, возрастающая концентрация загрязнителя непосредственно в зоне окисления снижает скорость биодеструкции. Разработка новой формы биопрепарата для ремедиации водных поверхностей является актуальной задачей, при решение которой возможно улучшение многих экологических приемов очистки пресных и морских акваторий.
Цели и задачи исследования Основной целью работы явилась создание новой формы биопрепарата, обладающей положительной плавучестью,
7 предназначенной для очистки водных поверхностей от тонких нефтяных пленок. Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:
Разработать метод иммобилизации клеток - нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах, обладающих положительной плавучестью.
Адаптировать данный метод к различным группам микроорганизмов: бактерий, дрожжей, а также микроводорослей.
Изучить свойства полученной препаративной формы: активность препарата, срок хранения и способность к разложению в естественной экосистеме.
Определить дозы вносимого препарата при различных концентрациях нефтяных загрязнений.
Провести опытные испытания по ликвидации нефтяных загрязнений в реальных условиях.
Научная новизна. Впервые применен для создания биопрепарата метод иммобилизации микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах, позволяющий увеличить их деструкционный потенциал.
Показано, что н-алканы, эмульгированные в Са-альгинатные гранулы, позволяют придать гранулам положительную плавучесть.
Показано, что применение новой препаративной формы с эмульгированными н-алканами позволяет увеличить скорость биоремедиации за счет локализации иммобилизованных и свободных клеток в приповерхностном слое воды.
Установлено, что одновременная иммобилизация клеток микроводорослей с клетками нефтедеструкторов способствует интенсификации процесса биоремедиации за счет обогащения биогенным кислородом.
Практическая значимость. Разработан новый метод удаления тонких нефтяных пленок с поверхности акваторий с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов. Определены параметры получения
8 Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками нефтедеструкторов, влияющие на характеристики биопрепарата. Наработана опытная партия новой препарата для удаления тонких нефтяных пленок с поверхности пресных водоемов и испытана в реальных условиях ЗАО «Транснефть». Показано, что применение нового биопрепарата позволяет снизить количество нефтяных углеводородов (НУГВ) за 21 сутки при температуре от 10 до 22С в экспериментальном варианте до 95%. Получен патент Российской Федерации на способ получения биопрепарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами и способ очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Международном конгрессе по управлению отходами «ВэйсТэк-2003» (Москва, 2003), III Международной научно-технической конференции «Экология и научно - технический прогресс» (Пермь, 2005), III Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), IV Международной научно-технической конференции «Экология и научно - технический прогресс» (Пермь, 2005), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе патент Российской Федерации и две статьи. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах текста и включает 34 рисунка и 22 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, содержащего 170 ссылок, из которых на иностранных языках 42 .
Поступление и распределение нефтепродуктов в водных объектах
Большое количество нефтепродуктов поступает в поверхностные воды со сточными водами предприятий нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей, химической, металлургической и других отраслей промышленности, предприятий транспорта, с хозяйственно-бытовыми водами, при транспортировке нефти, а также с поверхностным стоком с загрязненных территорий [82, 98-99]. Нефтепродукты находятся в различных миграционных формах: растворенной, эмульгированной, сорбированной на твердых частицах взвесей и донных отложений, в виде пленки на поверхности. Соотношение масс нефти, находящейся в разных миграционных формах, определяется комплексом факторов, в частности, составом и свойствами нефти, условиями ее поступления в водоем, гидрологическим режимом, уровнем и характером фоновой загрязненности водоема, концентрацией поверхностно - активных веществ (ПАВ). Это соотношение непостоянно из-за неравномерности поступления нефти в водоем, ее деградации, а также миграции и трансформации [36, 66].
Каждая из форм существования нефти в гидросфере отличается от других составом и свойствами. Истинно растворенные компоненты нефти -это низшие ароматические соединения и алканы. В поверхностном микрослое вод концентрируется полярные низкомолекулярные вещества. Первичные нефтяные пленки и слики на начальных этапах эволюции сходны по составу с источниками загрязнения [106]. Капли эмульгированной нефти окружены бронирующими оболочками маслорастворимых ПАВ и твердых эмульгаторов или ПАВ из водной фазы. На взвеси чаще сорбируются липкие смолистые компоненты нефти. Они же, как и тяжелые компоненты, накапливаются в донных осадках. Поэтому характер и степень влияния каждой из форм существования нефти на физические, химические, и биологические процессы, протекающие в водной среде и на геохимических барьерах, механизмы трансформации, биологического и химического окисления нефти, воздействия на флору и фауну водоемов весьма специфичны.
Характер распределения нефтепродуктов и естественных углеводородов по вертикали и акватории водоема весьма сложен и непостоянен. Обычно прибрежные зоны наиболее загрязнены нефтепродуктами и содержат повышенные количества естественных углеводородов в результате поступления со стоком и интенсивного продуцирования в менее глубоких и наиболее прогреваемых участках водоема. Концентрация нефтепродуктов чаще бывает повышена в поверхностном и придонных слоях, хотя возможно и возникновение локальных очагов с повышенным содержанием нефтепродуктов в водной толще [20, 36, 66,68, 105].
Обычно в момент поступления нефтепродуктов в водный объект основная масса сосредоточена в пленке. Нефтяное загрязнение в виде пленки или сликов представляет наибольшую опасность для экосистем гидросферы, мореплавания, береговых зон, влаго-, газо- и теплообмена между океаном и атмосферой. Со временем, по мере удаления от источника загрязнения, происходит перераспределение между основными формами миграции, направленное в сторону повышения доли растворенных, эмульгированных, сорбированных нефтепродуктов, и соответствующим уменьшением их содержания в пленке [66].
Поступление нефтепродуктов в водоемы заметно нарушает их кислородный режим, при этом особенно затрудняется поступление кислорода из воздуха в воду [88]. Некоторые нефтепродукты при попадании на поверхность воды образуют нерастворимые пленки, распространяющиеся при достаточной площади растекания в монослои. К ним относятся вещества, в молекуле которых содержится сильная полярная группа, например, карбоновые кислоты и их эфиры, спирты. Нерастворимы в воде высшие гомологи органических соединений с числом неполярных углеводородных групп больше 12 [94].
Выделение и идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов
Объектами исследований служили углеводородокисляющие штаммы из различных коллекций:
Штамм бактерий Н-1 Acinetobacter valentis sp. paraffinicum, B-6727 из ВКПМ; выделен из почв Иркутской обл. и селекционирован в условиях длительного непрерывного культивирования на карбамидных парафинах. Штамм бактерий ВСБ-567 Acinetobacter calcoaceticus (Acinetobacter oleovorum sp. paraffinicum), B-5064 из ВКПМ; выделен из почв, пропитанной нефтепродуктами.
Культура дрожжей Yarrowia lipolytica, любезно предоставленная Звягильской Р. А.
Штаммы бактерий выделенных из различных образцов почв прибрежной зоны Каспийского моря.
Культуры микроводорослей Platymonas (Tetraselmis) viridis, Dunaliella tertiolecta (коллекция МГУ им. М.В. Ломоносова).
Выделение и идентификация углеводородокисляющих микроорганимов.
Для получения накопительных культур углеводородокисляющих микроорганизмов использовали образцы почв прибрежной зоны Каспийского моря. Накопительную культуру получали следующим образом: каждый исследуемый субстрат (нефтезагрязненная почва или песок) в массе 1 г вносили в колбы с 99 мл стерильной воды, смесь взбалтывали и 1 мл суспензии переносили в колбы с 200 мл стерильной минеральной среды Раймонда с 2% NaCI. В качестве единственного источника углерода в среду добавляли нефть (10 г/л). Стерилизацию нефти проводили автоклавированием (0,5 атм. 30 мин.).
Культивирование проводили при температуре 25 С в течение 5 суток.
Далее из всех накопительных культур проводили высев на плотную питательную среду МПА по методу Коха.
Культуры, выделенных микроорганизмов поддерживали на МПА.
Морфологическое состояние культур определяли методом фазово -контрастной микроскопии. Дифференциацию бактерий по Граму проводили с использованием 3% раствора КОН; способность образовывать кислоты из углеводов, способность расти при различной температуре определяли по методам общей бактериологии [64]. Идентификацию микроорганизмов проводили по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам, используя определители бактерий Берджи, 1997 [136]; Смирнов, 1990 [108]. При микроскопировании бактерий отмечали величину и форму клеток, особенности морфологии.
Применение альгината натрия для иммобилизации микроорганизмов - нефтедеструкторов
Иммобилизацию клеток микроорганизмов проводили по оригинальной методике, где предварительно простерилизованный (20 мин, 120 С) 2% раствор альгиновой кислоты смешивали с микроорганизмами нефтедеструкторов вместе с культуралыюй жидкостью в объемном соотношении 1:1. Для иммобилизации использовали культуры в поздней экспоненциональной фазе развития.
В качестве нефтедеструкторов были использованы бактериальные штаммы Acinetobacter valentis и Acinetobacter calcoaceticus, характеризующиеся широким спектром окислительной активности по отношению к углеводородам нефти.
Для получения Са-альгинатных гранул использовали собранную нами установку (рис.1), где суспензия микроорганизмов в растворе геля посредством работы перистальтического насоса подается в инжектор со скоростью 500 мл/ч, и после прохождения через иглу происходит отрыв под воздействием потока воздуха, подаваемого со скоростью 2м3/мин, при этом капли полимера попадают в раствор сшивающего агента СаС12. Гранулы с иммобилизованными клетками выдерживали в растворе хлорида кальция в течение получаса, далее промывали их декантированием и хранили в физрастворе при температуре 4 С.
Ассимиляция нефти иммобилизованными и свободными клетками Acinetobacter valentis в периодических условиях
Исследование способности иммобилизованных в Са-альгинатный гель микроорганизмов-нсфтедеструкторов ассимилировать нефтяные загрязнения, проводили при периодическом культивировании их в аэробных условиях. Для этого в колбы с минеральной синтетической средой №2, объёмом 100 мл вносили 1% нефти и 1 мл иммобилизованных клеток, отобранных с помощью микропипетки емкостью 2 мл. В контрольную колбу вносили 1 мл нативных клеток. Далее колбы помещали на качалку (110 об./мин.) и проводили культивирование при температуре 25С. В ходе эксперимента каждые сутки определяли численность свободных клеток в среде путем высева серийных разведений на агаризованные среды. Учет микроорганизмов вели подсчетом выросших колоний на чашках Петри.
В процессе культивирования иммобилизованных клеток Acinetobacter valentis численность свободных клеток в культуральной жидкости уже на вторые сутки составляла 4,8x106 кл/мл. Максимальная численность клеток наблюдалась на третьи сутки культивирования и составляла 7,6x10 кл/мл, после чего их количество уменьшилось до 6,4x10 кл/мл (рис.2).
Результаты контрольного эксперимента с использованием нативных клеток Acinetobacter valentis представлены на рис. 3
Как можно заметить из рис.3 в первые двое суток прирост клеток Acinetobacter valentis не существенный, за это время численность увеличилась лишь на 2 порядка. Максимальное количество клеток приходится на 3 сутки культивирования и составляет 4,5x10 кл/мл и, на конец культивирования численность бактериальных клеток Acinetobacter valentis в среде составляла 2,7x10 кл/мл.
Культивирование как иммобилизованных, так и нативных клеток микроорганизмов Acinetobacter valentis при аэрации в колбах на качалке сопровождалось дисперсией нефти, также наблюдалось выпадение осадка в виде комков биомассы с нефтью.
К концу культивирования на 4 сутки из колб была экстрагирована остаточная нефть четыреххлористым углеродом. Для экстракции использовали 100 мл экстрагента на 100 мл среды. Измерение суммарного содержания остаточных нефтяных углеводородов проводили методом ИК спектрофотометрии, позволяющим контролировать общее содержание группы соединений, составляющих основную часть нефти и продуктов её переработки [85]. В эту группу входят все алканы нормального и разветвленного строения, нафтеновые и неполярные ароматические углеводороды. Степень утилизации нефти иммобилизованными микроорганизмами Acinetobacter valentis на 4 сутки культивирования составила 68% (рис. 2), в то время как для нативных клеток этот показатель составлял 53%.
