Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОМАССЫ 13
1.1. Строение и свойства целлюлозы как главного компонента растительной биомассы 14
1.2. Другие полисахариды растений и лигнин 19
1.2.1. Гемицеллюлозы 19
1.2.2. Пектины и Р-глюканы 27
1.2.3. Лигнин 30
ГЛАВА 2. ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ФЕРМЕНТЫ 33
2.1. Распространение и классификация р-1,4-глюканаз (целлюлаз и ксилоглюканаз) 33
2.2. Особенности молекулярного строения и механизм действия целлюлаз 38
2.2.1. Бифункциональная организация молекул грибных целлюлаз 38
2.2.2. Механизм действия целлюлазного комплекса 53
2.3. Микроскопические грибы как продуценты целлюлолитических ферментов...58
2.4. Свойства грибных целлюлаз 65
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ 73
3.1. Осахаривание лигноцеллюлозного сырья 74
3.1.1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его предобработка 74
3.1.2. Аппаратурное оформление процессов ферментативного гидролиза целлюлозы 80
3.2. Ферментная обработка текстильных материалов. 83
3.3. Применение целлюлаз и сопутствующих им ферментов в сельском хозяйстве и пищевой промышленности 88
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 92
ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 92
4.1. Использованные ферменты 92
4.2. Субстраты и реактивы 94
4.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка 96
4.4. Методы определения активности ферментов 97
4.5. Использование окрашенной целлюлозы для исследования ингибирования целлюлаз продуктами реакции 99
4.6. Методы выделения и очистки ферментов 99
4.7. Определение адсорбционных характеристик ферментов 101
4.8. Исследование термостабильности ферментов 101
4.9. Исследование трансгликозилирования ЦБГ1 102
4.10. Масс-спектрометрический анализ пептидов и белков 102
4.11. Анализ молекулярно-массового распределения продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов 103
4.12. Исследование кинетики ферментативного гидролиза целлюлозы в ячейках с перемешиванием и в реакторах различного типа 104
4.13. Численные методы решения дифференциальных уравнений и определения кинетических параметров 105
4.14. Методы иммобилизации Р-глюкозидазы и использование иммобилизованного фермента 107
4.15. Оценка способности целлюлаз к биодепигментации джинсовой ткани 109
4.16. Определение индекса ресорбции индиго 112
4.17. Исследование взаимодействия индиго с аминокислотами и белками 114
4.18. Оценка способности ферментов к биоотварке («биоскорингу») суровой хлопчатобумажной ткани 115
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 117
ГЛАВА 5. ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЙ КОМПЛЕКС ГРИБА CHRYSOSPORIUM LUCKNOWENSE 117
5.1. Общая характеристика ферментного комплекса С. lucknowense 118
5.2. Субстратная специфичность, классификация и свойства эндоглюканаз и целлобиогидролаз 127
5.3. Целлобиогидролазы 1а и lb (Се17А и Се17В) из 7-й семьи гликозид-гидролаз 135
5.3.1. ЦБГ 1а (Се17А): аминокислотная последовательность, молекулярные характеристики, кинетика действия и свойства разных форм фермента 135
5.3.2. ЦБГ lb (Се17В): пептидный «фингерпринт» фермента и гомология с другими целлюлазами 154
5.4. Целлобиогидролазы Па и ПЬ (СеІбА и Се16В) из 6-й семьи
гликозид-гидролаз 157
5.4.1. Аминокислотная последовательность и особенности молекулярного строения ЦБГ Па (СеІбА) 157
5.4.2. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ЦБГ lib (СеІбВ) и гомология с другими целлюлазами 162
5.5. Низкомолекулярные эндоглюканазы ЭГIII (Се112А) и ЭГ V (Се145А): аминокислотные последовательности, гомология и моделирование трехмерных структур 165
5.6. Масс-спектрометрический и пептидный анализ высокомолекулярных эндоглюканаз (Се15А, Се16С, Се17С) 172
5.7. Специфичные ксилоглюканазы С. lucknowense, Т. reesei и A. japonicus как представители нового класса гликозид-гидролаз 177
5.7.1. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ксилоглюканаз 179
5.7.2. Субстратная специфичность и основные свойства ксилоглюканаз 187
5.7.3. Тип действия ксилоглюканаз на полимерные субстраты 189
5.7.4. Кинетика гидролиза ксилоглюкана и состав конечных продуктов 193
ГЛАВА 6. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТАМИ РЕАКЦИИ И ТРАНС-ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ПРИ КАТАЛИЗЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ 200
6.1. Теоретический анализ ингибирования целлюлаз продуктами реакции:
оценка влияния различных факторов 200
6.2. Использование окрашенной целлюлозы для изучения ингибирования целлюлаз продуктами гидролиза 215
6.3. Реакции трансгликозилирования, катализируемые целлобиогидролазой I
из Т. longibrachiatum 221
ГЛАВА 7. ПРИМЕНЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ 227
7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз...228
7.2. Математическое моделирование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы и оценка влияния различных факторов на кинетику процесса 242
7.3. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторе с интенсивным массообменом на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора 252
7.4. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторах
с виброперемешиванием 266
7.5. Применение иммобилизованной Р-глюкозидазы для обработки
гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы 275
ГЛАВА 8. ПРИМЕНЕНИЕ «ТОПОЛИТИЧЕСКИХ» ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ТЕКСТИЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ 289
8.1. Сравнение осахаривающей и тополитической активности различных ферментных препаратов и очищенных индивидуальных целлюлаз 290
8.2. Адсорбционная способность ферментов как основной фактор, влияющий
на ресорбцию индиго в процессе биодепигментации джинсовой ткани 300
8.3. Особенности молекулярного строения целлюлаз, определяющие эффективность их действия при ферментативной депигментации джинсовой ткани 307
8.4. Эффективные ферментные препараты на основе ЭГ HI P. verruculosum
и ЭГ V С. lucknowense для депигментации джинсовых изделий 322
8.4.1. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ III P. verruculosum....322
8.4.2. Белковая инженерия ЭГ III P. verruculosum 329
8.4.3. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ V С. lucknowense 334
8.5. Биоотварка («биоскоринг») суровой хлопчатобумажной ткани с
использованием препаратов целлюлаз 338
ВЫВОДЫ 355
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 358
- Строение и свойства целлюлозы как главного компонента растительной биомассы
- Распространение и классификация р-1,4-глюканаз (целлюлаз и ксилоглюканаз)
- Осахаривание лигноцеллюлозного сырья
Введение к работе
Современный этап развития физико-химической энзимологии имеет две характерные особенности. С одной стороны, происходит накопление и развитие фундаментальных знаний, осуществляется углубленное изучение механизма действия ферментов и ферментных систем, выявление характерных особенностей их функционирования. С другой стороны, активизируются усилия, направленные на поиск возможности использования биокатализаторов в различных областях технологии. Принципы биокатализа, биотрансформации веществ все более широко применяются для реализации новых биотехнологических процессов, решения насущных задач, связанных с переходом на новые источники сырья и энергии, для разработки прогрессивных методов утилизации отходов, а также для замены традиционных химических процессов на биокаталитические, которые протекают в более мягких условиях и гораздо более безопасны с точки зрения экологии.
Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы -самого распространенного биополимера на Земле, по праву занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. Поэтому не случайно, начиная с середины прошлого века, во многих странах мира стали проводиться исследования целлюлаз.
Резкое увеличение интенсивности подобных исследований произошло в 1970-е годы в США и странах Западной Европы из-за разразившегося энергетического кризиса, связанного с резким повышением цен на нефть и другие энергоносители [1]. Целлюлоза растительной биомассы представляет собой практически неисчерпаемый источник возобновляемого сырья, которое может быть конвертировано ферментативным путем в глюкозу. В свою очередь, глюкоза является незаменимым сырьем для микробиологических процессов получения жидких и газообразных видов топлива (этанола, бутанола, этилена и др.), органических и аминокислот, кормового белка и многих других полезных продуктов микробиологического синтеза. Общие запасы на Земном шаре возобновляемого сырья, представляющего собой растительную биомассу, оцениваются в 800-1000 млрд. т, причем ежегодно в результате фиксации 10 кал солнечной энергии образуется примерно 50 млрд. т биомассы, а также накапливается 4-5 млрд. т отходов или вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растений и древесины [1,2]. Таким образом, в будущем растительная биомасса может играть ту роль, которая в настоящее время принадлежит нефти.
Прогрессирующий дефицит невозобновляемых источников энергии и материалов наблюдается и в настоящее время. В последние годы интерес к биоэтанолу и другим видам топлива из лигноцеллюлозного сырья вновь резко повысился из-за дальнейшего роста цен на нефть, а также в связи с Киотским соглашением 1997 г., направленным на снижение выброса в атмосферу газов, вызывающих парниковый эффект. В отличие от ископаемых видов топлива, биоэтанол и другие виды топлива из возобновляемого растительного сырья не приводят к накоплению углекислого газа в атмосфере, т.к. он вновь превращается в кислород в процессе фотосинтеза, осуществляемого растениями (т.е. происходит круговорот СО2/О2 при параллельном возобновлении целлюлозы и других компонентов растительной биомассы).
Таким образом, помимо фундаментальных исследований в области целлюлолитических ферментов, направленных на выяснение биохимических и физико-химических закономерностей биодеградации целлюлозы в природе, механизмов действия грибных и бактериальных ферментов, в последние 30 лет наиболее активно развивались прикладные исследования в области ферментативного гидролиза целлюлозы, а также разработки, направленные на поиск и получение новых штаммов - суперпродуцентов целлюлаз. При этом основные усилия были направлены на поиск и изучение ферментов, способных наиболее эффективно и полно разрушать целлюлозу до растворимых Сахаров и в итоге - до мономера (глюкозы).
С конца 1980-х годов целлюлазы стали активно применяться для обработки текстильных изделий и материалов [3,4]. Первым таким процессом стала ферментная обработка джинсовых изделий, приводящая к частичному удалению красителя с поверхности ткани, в результате которой изделия приобретают внешний вид «вареных джинсов». В течение нескольких лет ферменты практически заменили пемзу и химические агенты, применявшиеся для этой цели ранее. Позднее целлюлазы стали широко использоваться для биополировки трикотажа и изделий на основе хлопчатобумажных и смесовых тканей. В результате такой обработки с поверхности материала удаляются ворсинки и неровности, в результате чего материал становится более гладким, приятным на ощупь, и после серии стирок на нем не происходит образования «катышков» (пилей), что повышает потребительские свойства изделий. Наконец, в последние годы стало развиваться направление применения целлюлаз (совместно с пектиназами) для биоотварки («биоскоринга») суровых хлопчатобумажных тканей с целью увеличения смачиваемости целлюлозных волокон, что облегчает окрашивание материала на последующих стадиях технологического процесса. Такая обработка является необходимой стадией в текстильной промышленности, однако в течение многих столетий отварка производится в горячем растворе щелочи, приводя к быстрой коррозии оборудования и вредным выбросам в окружающую среду.
В последнее десятилетие целлюлазы также стали активно использоваться в качестве добавок к детергентам и моющим средствам [3,4] для того, чтобы воздействуя при стирке на текстильные материалы, содержащие в своем составе целлюлозные волокна, облегчить удаление грязей за счет гидролиза части поверхностных волокон и предотвратить образование пилей.
В отличие от ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, где ферменты должны обладать максимальной «агрессивностью» по отношению к полимерному субстрату (высокой сахаролитической активностью), в процессах биообработки текстиля (в том числе, при стирке современными моющими средствами) требуются целлюлазы, способные мягко воздействовать на поверхность волокон, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы, т. е. так называемые «тополитические» ферменты.
Среди других областей применения целлюлолитических ферментов следует отметить их использование в качестве добавок к кормам животных и птиц для разрушения некрахмальных полисахаридов [3,4]. В данном случае, как правило, используются мультиферментные препараты, содержащие широкий спектр карбогидраз, т.е. не только целлюлазы, но и ксиланазы, [3-глюканазы, пектиназы. Например, добавка таких препаратов в составе премиксов к комбикормам в птицеводстве позволяет не только повысить их усвояемость, но и использовать кормовые диеты на основе таких трудноусвояемых видов злаков, как рожь и ячмень.
Специфика применения целлюлолитических ферментов в новых технологиях часто требует, чтобы ферменты обладали высокой активностью не только в кислой среде (при рН 4-5), что типично для грибных целлюлаз, но также и в нейтральной и слабощелочной среде. Поэтому в последнее время различными научными и производственными коллективами ведется интенсивный поиск нейтральных и щелочных целлюлаз.
Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Т. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatum) играют ведущую роль [3]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Препараты целлюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во многих странах ведущими компаниями -производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), Genencor International (США), Iogen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Rohm Gmbh (ФРГ), Meiji Seika Kaisha Ltd. и Shin Nihon Chemical Co. (Япония) и др. В последние годы в связи с бурным развитием «текстильного» направления целлюлаз некоторыми компаниями стали производиться ферментные препараты на основе других грибных продуцентов, оптимизированные для использования в конкретных биотехнологических процессах. Например, на основе грибного продуцента Humicola insolens фирмой Novozymes (Дания) производятся ферментные препараты серии Denimax для «биостонинга» джинсовых изделий. Для этой же цели выпускаются специальные ферментные препараты фирмой Meiji (Япония). В отличие от целлюлаз Trichoderma указанные ферменты функционируют в нейтральной области рН.
По оценкам зарубежных специалистов общий объем продаж промышленных ферментов на мировом рынке должен составить в 2005 г. от 1,7 до 2 млрд. долларов США, при этом доля целлюлаз может составить 15-20% [3,4].
В СССР в 1970-1980-е годы микробиологическая промышленность также производила в промышленных масштабах или в виде опытно-промышленных партий ферментные препараты целлюлаз - такие как Целловиридин ГЗх (Т. viride), Целлобранин ПОх (Т. longibrachiatum), Целлолигнорин ПЮх (Т. lignorum), Целлокандин ПОх (Geotrichum candidum) и некоторые другие [5-7]. Несмотря на то, что по продуктивности секреции внеклеточного (целлюлолитического) белка и удельной целлюлазной активности указанные продуценты и ферментные препараты на их основе, как правило, уступали зарубежным аналогам, с точки зрения качества целлюлазного комплекса (т.е. набора целлюлаз с различной специфичностью) отечественные препараты мало чем от них отличались, а иногда обладали более интересными свойствами. К середине 1990-х годов из-за распада СССР и общего экономического кризиса производство ферментных препаратов на большинстве биохимических заводов стран СНГ прекратилось.
Начиная с конца 1980-х годов, в Лаборатории физико-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН в рамках Государственной научно-технической программы «Новейшие направления биоинженерии» велись разработки, направленные на поиск новых перспективных продуцентов грибных целлюлаз, усовершенствование существующих штаммов микроорганизмов, повышение удельной активности секретируемых ферментных комплексов, а также использование препаратов целлюлаз для биоконверсии лигноцеллюлозного растительного сырья в различные полезные продукты. В 1991 г. на основе штамма Т. reesei 18.2КК на Приволжском биохимическом заводе при участии кафедры химической энзимологии МГУ было налажено производство ферментного препарата Целловиридин А (взамен менее продуктивного штамма Т. viride, на основе которого до этого производился Целловиридин ГЗх). Несмотря на то, что к середине 1990-х годов на Приволжском заводе производство данного ферментного препарата прекратилось, оно в дальнейшем было возобновлено на ряде биохимических заводов России и бывших республик СССР (препараты Целловиридин Г20х и Г2х). В течение последних 15 лет в ИБФМ РАН путем селекции и мутаногенеза были получены новые штаммы гриба Т. reesei TW-1 и TW-307 (отличающиеся повышенной секрецией целлюлаз), на основе которых были произведены ферментные препараты с улучшенной осахаривающей способностью при гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Были также получены новые промышленные штаммы гриба Penicillium verruculosum В40-221-6 и В40-221-151, дерепрессированные по глюкозе и способные секретировать на дешевых питательных средах до 40-50 г/л внеклеточного белка. Основным достоинством ферментных препаратов P. verruculosum по сравнению с целлюлазами Т. reesei является более сбалансированный состав целлюлазного комплекса, и, в частности, более высокий уровень Р-глюкозидазной активности, что, как будет показано в диссертационной работе, позволяет получать более высокий выход целевого продукта (глюкозы) при ферментативном гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Наконец, в результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз — гриб Chrysosporium lucknowense, на основе которого были получены новые штаммы (в частности, UV 18-25), отличающиеся крайне высокой секреторной способностью. По уровню секреции внеклеточного белка (50-80 г/л) С. lucknowense UV 18-25 не уступает, либо превосходит лучшие известные промышленные продуценты целлюлаз (например, различные штаммы Т. reesei). Серьезным преимуществом С. lucknowense также является то, что некоторые из целлюлаз данного продуцента обладают высокой активностью в нейтрально-щелочной среде, что делает данные ферменты перспективными для использования в ряде биотехнологических процессов (в частности, для обработки текстиля, а также для применения в моющих средствах).
Следует отметить, что к настоящему времени ферменты целлюлазного комплекса Т. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. За последние 50 лет опубликовано более тысячи статей, патентов и монографий, а также проведены десятки международных конференций, посвященных микробиологическим, биохимическим и биотехнологическим аспектам гриба Т. reesei (Т. viride), а также продуцируемых данным грибом целлюлаз. Тем не менее, полный геном Т. reesei до сих пор не расшифрован, и далеко не все карбогидразы данного гриба были выделены и охарактеризованы. В литературе имеется также немалое количество публикаций по целлюлазам, продуцируемым различными видами грибов рода Penicillium, однако сведения, касающиеся пеницилльных ферментов-карбогидраз (и целлюлаз в частности), весьма противоречивы. Что касается ферментов, продуцируемых грибом С. lucknowense и другими видами грибов рода Chrysosporium, то сведения по ним практически отсутствуют в научной литературе, а также в белковых и других базах данных.
Учитывая актуальность исследования целлюлазных комплексов, продуцируемых различными микроорганизмами, как главных разрушителей растительной биомассы в природе, а также принимая во внимание все более широкое применение целлюлолитических ферментов в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах, в данной работе были поставлены следующие задачи и цели:
• детально охарактеризовать внеклеточный целлюлазный комплекс, продуцируемый грибом С. lucknowense, включая выделение всех секретируемых эндоглюканаз и целлобиогидролаз, изучение их субстратной специфичности, основных биохимических и физико-химических свойств, а также получение информации по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов из данных белков), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения их принадлежности к той или иной семье гликози д-гидрол аз;
изучить закономерности трансгликозилирования и ингибирования продуктами реакции при катализе целлюлолитическими ферментами (как важных факторов, влияющих на эффективность гидролиза природных субстратов целлюлаз);
провести сравнение осахаривающей способности широкого круга отечественных и зарубежных целлюлазных препаратов на основе различных грибных продуцентов при гидролизе реальных видов целлюлозосодержащего сырья и выявить наиболее эффективные целлюлазные комплексы и штаммы-продуценты;
найти возможности интенсификации процесса ферментативного осахаривания целлюлозы в лабораторных гидролиз-аппаратах различной конструкции; с помощью экспериментальных подходов, а также используя методы математического моделирования, выявить основные факторы, влияющие на кинетику ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов;
выявить наиболее перспективные «тополитические» целлюлазы, обладающие высокой эффективностью при действии на текстильные материалы - в таких процессах, как ферментативная депигментация джинсовой ткани и биоотварка («биоскоринг») суровых хлопчатобумажных тканей; разработать теоретические основы действия «тополитических» целлюлаз; получить и испытать новые ферментные препараты, наиболее подходящие для применения в процессах биообработки текстильных материалов.
Строение и свойства целлюлозы как главного компонента растительной биомассы
Целлюлоза содержится в древесине, однолетних растениях, травах, льне, хлопке, конопле, в оболочках семян плодов, в морских и пресноводных водорослях. В природе встречается также бактериальная и животная целлюлоза (некоторые ракообразные и улитки) [2,8].
По молекулярному строению целлюлоза представляет собой линейный полимер, ангидроглюкозные звенья которого связаны р-1,4-0-глюкозидными связями. Степень полимеризации (СП) нативной целлюлозы может составлять более 10 тыс., а молекулярная масса - более 1,5 млн. [10,11]. Длина одного ангидро-глюкозного звена составляет 5,5 А, следовательно, длина молекулы целлюлозы -около 5 мкм. СП изменяется в зависимости от фазы роста растения. На ранних стадиях роста целлюлоза имеет низкую СП, пориста и обладает более высокой сорбционной способностью по сравнению с целлюлозой созревшего растения.
Целлюлоза в нативном состоянии представляет собой полимолекулярное соединение, в состав которого входят молекулы, идентичные по своему строению, но отличающиеся по длине. Например, для хлопковой целлюлозы установлено наличие двух фракций: основной с интервалом по степени полимеризации от 7500 до 9000 с максимумом при 8500, и меньшей по содержанию фракции - с СП от 5500 до 7500 с максимумом при 6500. Для бактериальной целлюлозы показано наличие двух максимумов на кривой молекулярно-массового распределения - при значении СП 2000 и 6000 [2].
Элементарные звенья макромолекулы целлюлозы находятся в форме кресла, гидроксильные группы расположены в горизонтальном направлении, а атомы водорода - в вертикальном (рис. 1,1). Каждое второе звено цепи повернуто на 180 по отношению к оси молекулы. Таким образом, с точки зрения молекулярного строения более правильно считать элементарной структурной единицей целлюлозы не ангидроглюкозное, а целлобиозное звено, которое выделено на рис.1.1 скобками.
Целлюлоза - классический пример полимера, макромолекулы которого имеют линейное строение и который характеризуется повышенной скелетной жесткостью. Конфигурация макромолекулы целлюлозы дает возможность реализации внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Современная точка зрения на структуру целлюлозы имеет в своей основе теорию аморфно-кристаллического ее состояния и основывается на данных электронографических, рентгенографических и других исследований [2,10,12]. Как и все гидрофильные линейные полимеры, целлюлоза обладает склонностью к образованию первичных (элементарных) фибрилл, в которых группы параллельно расположенных цепей макромолекул связаны между собой множественными водородными связями. Первичная фибрилла представляет собой наименьшее надмолекулярное звено целлюлозы. Общепринятой в настоящее время является модель первичной фибриллы Денниса и Престона (рис. 1.2) [2,13].
Распространение и классификация р-1,4-глюканаз (целлюлаз и ксилоглюканаз)
Ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляется в природе системой различающихся по субстратной специфичности ферментов, которая получила название целлюлазного комплекса [7,46].
Основными разрушителями целлюлозы, как главной составляющей растительной биомассы, являются микроорганизмы, а именно микроскопические аэробные грибы - возбудители мягкой, бурой и белой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий [7,47-49]. Целлюлазные комплексы грибов (мультиферментные системы гифо-, аско- и базидиомицетов), как правило, секретируются в виде внеклеточных ферментов, не связанных между собой в агрегаты и функционирующих индивидуально. Целлюлазные системы актиномицетов и аэробных бактерий имеют много похожего с ферментами аэробных грибов. В отличие от указанных микроорганизмов, целлюлазы анаэробных бактерий часто функционируют в виде агрегатов. Например, ферменты клостридий (наиболее изученных анаэробных бактерий) действуют на растительные клеточные стенки в виде целлюлосом - высокомолекулярных внеклеточных агрегатов, связанных с цитоплазматической мембраной [47,49]. Склонность к образованию белковых агрегатов также обнаружена у целлюлолитических анаэробных грибов и бактерий, населяющих рубец жвачных животных [49,50].
Целлюлолитические ферменты также найдены в растениях, моллюсках, червях и других наземных и морских беспозвоночных, а также у некоторых насекомых (в частности, в термитах) [51-58]. Однако целлюлазы этих организмов исследованы намного хуже, чем микробные ферменты.
Целлюлолитические ферменты относятся к классу Р-1,4-глюканаз, т.е. карбогидраз, гидролизующих р-1,4-связи в О-гликозильных соединениях. По типу действия на субстраты целлюлазы делят на эндо-1,4-р-глюканазы (КФ 3.2.1.4), экзо-целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91), экзо-1,4-Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74) и Р-глюкозидазы (целлобиазы) (КФ 3.2.1.21) [58,59].
Эндо-1,4-Р-глюканазы (ЭГ) - ферменты, гидролизующие внутренние Р-1,4-глюкозидные связи, удаленные от концов полимерной цепи целлюлозы (а также лихенана, р-глюкана злаков, карбоксиметилцеллюлозы - КМЦ) с образованием фрагментов полимерного субстрата и целлоолигосахаридов, что сопровождается существенным уменьшением степени полимеризации (СП) субстрата. ЭГ, как правило, гидролизуют аморфные участки целлюлозы, но известны ЭГ, гидролизующие и кристаллическую целлюлозу [58,154]. ЭГ часто делят на ферменты «менее упорядоченного» и «более упорядоченного» типа действия [58,60-62]. Первые вызывают более резкое уменьшение СП субстрата с образованием крупных олигосахаридов (без образования моно- или дисахаридов). ЭГ «более упорядоченного» действия одновременно с деполимеризацией отщепляют моно-, ди-и трисахариды и не столь существенно уменьшают СП полимера.
Целлобиогидролазы (ЦБГ) отщепляют остатки целлобиозы с конца полимерных молекул нативной или частично гидролизованной целлюлозы. В отличие от эндоглюканаз, ЦБГ могут гидролизовать как аморфную, так и кристаллическую целлюлозу, причем считается, что из всех целлюлаз способность гидролизовать кристаллическую целлюлозу характерна именно для ЦБГ [59,63].
Р-Глюкозидазы (целлобиазы) отщепляют концевые нередуцирующие остатки P-D-глюкозы от целлобиозы и олигосахаридов, причем скорость гидролиза уменьшается с увеличением числа глюкозидных остатков в олигосахариде [58,59]. В отличие от эндоглюканаз и целлобиогидролаз, специфичность действия р-глюкозидаз, как правило, более широкая, и часто они способны расщеплять не только Р-1,4-, но и р-1,2-, р-1,3-, р-1,6-глюкозидные связи. Некоторые ферменты способны также гидролизовать p-D-галактозиды, a-L-арабинозиды или P-D-ксилозиды. Кроме того, многие р-глюкозидазы могут отщеплять терминальные гликозидные остатки от арил- и алкил-гликозидов.
Экзо-1,4-Р-глюкозидазы (1,4-Р-О-глюкан глкжогидролазы) гидролизуют р-1,4-связи в 1,4-Р-Б-глюканах и целлоолигосахаридах с последовательным отщеплением глкжозных остатков, причем скорость гидролиза увеличивается с увеличением числа глюкозидных остатков в олигосахариде [58,59]. Очень медленно данные ферменты могут гидролизовать целлобиозу. Следует отметить, что к настоящему времени известно очень мало истинных экзо-1,4-Р-глюкозидаз. Все они были выделены либо из растительных источников [64-66], либо из бактерий [67-69]. В литературе был описан также дрожжевой фермент с подобной специфичностью [70]. Существование экзо-1,4-Р-глкжозидаз в грибах остается до настоящего времени под вопросом, и, по-видимому, достоверно известен всего лишь один такой фермент [71].
Осахаривание лигноцеллюлозного сырья
Природную целлюлозу можно разделить на два типа: лигноцеллюлоза (древесина, кустарники, листья и трава, морские и речные макро- и микроводоросли и т.д.) и чистая целлюлоза (хлопок и его отходы, лен). Оба типа природной целлюлозы обладают кристаллической структурой, и биодеградация таких субстратов затруднена. Кроме того, находящийся в составе лигноцеллюлозы лигнин затрудняет доступность целлюлозы для молекул ферментов [308]. Реакционная способность природного целлюлозосодержащего сырья при ферментативном гидролизе, как правило, невелика [7,309,310], поэтому возникает необходимость его предварительной обработки с целью увеличения реакционной способности. Смысл предобработки заключается в разрушении кристаллической структуры целлюлозы и (или) удалении лигнина. Происходит также увеличение поверхности целлюлозы, что оказывает дополнительное положительное влияние на скорость гидролиза.
К целлюлозосодержащим материалам, которые могут быть использованы в качестве сырья для получения Сахаров ферментативным путем, относятся древесина, вторичные продукты лесопиления и деревообработки, а также отходы переработки сельскохозяйственных культур, т.е. материалы, которые в относительно небольшой степени употребляются для нужд народного хозяйства и поэтому достаточно дешевы. Критериями использования тех или иных материалов являются их стоимость, размеры запасов, возможности концентрирования их в районе расположения гидролизного производства, технологические свойства. Например, ежегодно в республиках СНГ накапливается до 200 млн т злаковой соломы (в мире до 4-5 млрд т), содержащей до 30% целлюлозы. Она мало используется, гниет или сжигается [311]. В хлопководческих республиках неиспользуемыми отходами являются стебли хлопчатника - гузапая (выход - 0,8 т на 1 т хлопка), хлопковая шелуха, семена хлопчатника (отходы хлопкоочистительных и маслобойных заводов), коротковолокнистые остатки хлопка (хлопковый линт), циклонный пух, улюк и т.д. В сельскохозяйственных районах, где производится кукуруза, отходом является кукурузная кочерыжка, запасы которой измеряются сотнями тысяч тонн в год. На маслозаводах накапливается подсолнечная лузга, на крупорушных и мукомольных предприятиях - рисовая шелуха (до 25% от массы зерна). Отходом первичной обработки льна и конопли является так называемая костра (до 70% от массы поступающей на обработку) [14,309,310]. Источником растительной биомассы может быть тростник. Длина стебля этого многолетнего растения достигает 4-6 м, и его урожай составляет до 10 т/га. Наконец, следует упомянуть верховой малоразложившийся (степень разложения до 15-20%) торф, химический состав которого во многом повторяет химический состав растений, образующих его. Запасы торфа огромны, причем имеются крупные месторождения, содержание торфа в которых достигает от 2 до 28 млн т [312,313]. Химический состав различных видов целлюлозосодержащего сырья приведен в табл. 3.1.
Интересным представляется использование в качестве сырья промышленных отходов, содержащих делигнифицированную или обработанную иным образом целлюлозу. В этой связи можно отметить отходы вискозных заводов. В отличие от древесной или хлопковой, эта целлюлоза в значительной степени аморфизована. Другим источником являются отходы целлюлозно-бумажного производства. Наибольший интерес представляет та часть отходов, которая попадает в стоки после сульфитной или сульфатной варки [314]. Источником делигнифицированной целлюлозы являются также отходы ткацких фабрик и других текстильных предприятий (нити хлопковой, льняной и вискозной пряжи, пух и т.д.). Целлюлозу содержат также муниципальные отходы и макулатура.
Известен широкий круг методов предобработки целлюлозосодержащих материалов, которые по характеру воздействия можно разделить на четыре типа: физические, механические, химические и биологические. Иногда реализуется смешанный тип предобработки, например, когда сырье одновременно подвергается воздействию физических и химических факторов — примерами служат так называемые паровой и аммиачный взрывы (см. ниже).