Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Литературный обзор 11
2.1. Липиды как питательный субстрат микроорганизмов 12
2.2. Влияние экзогенных липидов на физико-химические свойства внешней мембраны 17
2.3. Роль АО в жизнедеятельности микроорганизмов 26
2.4. Метаболизм микроорганизмов в условиях дефицита железа 36
2.5. Взаимосвязь метаболизма липидов и АО у бактерий 47
2.6. Цитотоксичность сидерофоров. Применение биохелаторов в клинической практике 51
3. Экспериментальная часть 52
3.1. Материалы и методы исследования 52
3.1.1. Объекты исследования 54
3.1.1.1. Бактерии 54
3.1.1.2. Дрожжи 54
3.1.1.3. Препараты клеточных оболочек дрожжей 54
3.1.2. Питательные среды для культивирования микроорганизмов 55
3.1.3. Условия культивирования микроорганизмов 56
3.1.4. Подсчет титра микробных клеток 56
3.1.5. Методика биотестирования токсичности 57
3.1.6. Обработка АПС препаратами КОД 57
3.1.7. Методика выделения липидов 58
3.1.8. Определение антиокислительной активности липидов на метилолеатной окислительной модели 58
3.1.9. Методика йодометрического определения пероксидов 59
3.1.10. Методика количественного определения стеринов в липидах 60
3.1.11. Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии 60
3.1.12. Определение содержания а-токоферола в липидах 61
3.1.13. Измерение микровязкости мембран микроорганизмов 62
3.1.14. Качественное и количественное определение бактериальных эндотоксинов (липополисахаридов) с использованием ли-зата амебоцитов Limulus Pyrotell (ЛАЛ-тест) 62
3.1.15. Определение активности микробиальных сидерофоров феррозиновым методом 66
3.1.16. Статистическая обработка данных 68
3.2. Результаты и их обсуждение 69
3.2.1. Влияние нативных АО на стабильность состава и свойств липидов в изолированных клеточных стенках дрожжей при их хранении 69
3.2.1.1. Общая характеристика липидов клеточных оболочек дрожжей (КОД) 69
3.2.1.2. Изменение состава и свойств липидов КОД при хранении 73
3.2.2. Исследование функциональных свойств липофильных АО в механизме взаимодействий биосорбентов с липидами питательной среды 88
3.2.2.1. Изменение состава и АО А липидов АПС при центрифугировании 88
3.2.2.2. Влияние клеточных оболочек дрожжей на состав, содержание и свойства липидов АГТС 92
3.2.2.3. Корреляционно-регрессионный анализ взаимосвязи сорб-ционных и кинетических характеристик липидов КОД 105
3.2.2.4. Анализ кинетических кривых окисления липидов методом специальных графических построений 114
3.2.3. Кинетические и биологические свойства липофильных АО в средах роста условно-патогенных грамотрицательных бактерий 120
3.2.3.1 Взаимосвязь метаболизма липидов и липофильных АО в средах роста УП ГНБ 120
3.2.3.2 Влияние липидов из сред после роста бактерий на кинетикуокисления метилолеата 128
3.2.4. Метаболизм липофильных АО в клетках дрожжей 146
3.2.4.1 Метаболизм липофильных про- и антиоксидаптов в глубинной культуре дрожжей 146
3.2.4.2 Координация параметров системы регуляции ПОЛ мембран в зависимости от морфотип а дрожжей 149
3.2.4.3 Свойства липофильных АО в средах роста пленчатых дрожжей 156
Заключение 160
- Влияние экзогенных липидов на физико-химические свойства внешней мембраны
- Взаимосвязь метаболизма липидов и АО у бактерий
- Результаты и их обсуждение
- Кинетические и биологические свойства липофильных АО в средах роста условно-патогенных грамотрицательных бактерий
Введение к работе
Актуальность темы. Установлено, что в высших организмах некоторые ингибиторы окисления способны выполнять разные функции. В частности, такой известный биоАО как ТФ может эффективно защищать от окисления полиненасыщенные жирнокислотные (ПНЖК) цепи липидов мембран (308), влиять на активность ферментов (56), выполнять структурные (290), сигнальные и некоторые другие функции (38, 61).
Нет сомнений, что такие характеристики мембран как текучесть и ПОЛ также и для низших одноклеточных организмов. Тем не менее известно, что ТФ могут синтезировать только отдельные виды микроорганизмов, способных к фотосинтезу (цианобактерии).
В настоящее время нет четких представлений о механизмах регуляции ПОЛ мембран в клетках низших эукариотов и особенно прокариотов. В отличие от высших эукариотов липиды бактерий и дрожжей состоят в основном из насыщенных и мононенасыщенных ЖК, которые более устойчивы к окислению, чем ПНЖК. Таким липидам свойственны более низкие скорости инициирования окисления, поэтому стадия вырожденного разветвления вносит существенно больший вклад в общую скорость окисления. Отсюда следует, что для дрожжей и бактерий большую роль в процессах регуляции ПОЛ должны играть вещества, обладающие способностью разрушать пероксиды.
В зависимости от условий реакции способность веществ взаимодействовать с липопероксидами с образованием радикальных или молекулярных продуктов может быть важным регуляторным механизмом поддержания оптимальной интенсивности ПОЛ мембран в клетках низших эукариотов и в особенности прокариотов Однако о наличии таких веществ и их роли в регуляции процессов жизнедеятельности бактерий и дрожжей практически ничего не известно.
Цель и задачи исследования. Целью дайной работы было исследовать антиоксидантные и антипероксидные свойства структурных липидов и липофильных метаболитов, синтезируемых клетками дрожжей и бактерий, а также установить роль АП во взаимодействии клеток со средой.
В соответствии с общей задачей наши исследования проводились в следующих направлениях:
Целью данной работы было исследование функциональной роли АО и АП свойств структурных липидов и липофильных метаболитов, синтезируемых клетками дрожжей и бактерий в условиях естественной среды обитания.
В соответствии с общей задачей наши исследования были сгруппированы по четырем основным направлениям:
Исследовать способность липидных фракций изолированных клеточных оболочек дрожжей (КОД) разрушать гидропероксиды. Изучить взаимосвязь состава со структурными и кинетическими свойствами липидов КОД. Исследовать динамику состава, АП и АО свойств липидов в процессе хранения КОД.
Исследовать взаимосвязь гидрофобных свойств клеточной поверхности с АО и АП свойствами липидов мембран. Изучить взаимосвязь сорбционных и кинетических свойств липидов в составе жидких питательных субстратов, используемых для культивирования микроорганизмов.
Изучить взаимосвязь биологических и кинетических свойств липофильных метаболитов, обладающих АО и АП свойствами. Установить роль липофильных АО в механизме липидзависимой неспецифической токсигенизации питательного субстрата при культивировании условно-патогенных грамотрицательных бактерий (УПБ).
Изучить взаимосвязь кинетических свойств структурных липидов дрожжей в реакциях автоокисления с процессами клеточной морфологии. Провести сравнительный анализ состава и физико-химических свойств структурных липидов, а также липофильных мета- болитов, синтезируемых клетками дрожжей-сахаромицетов в глубинной культуре и на поверхности жидкой среды.
Основные положения, выносимые на защиту
Клетки токсигенных штаммов УПБ при взаимодействии с липида-ми питательного субстрата синтезируют и высвобождают в окружающую среду липофильные метаболиты, обладающие АО и АП свойствами в реакциях жидкофазного низкотемпературного автоокисления метилолеата (МеО); данные метаболиты оказывают влияние на биоцидные свойства сред культивирования;
Липофильные АП присутствуют в клеточных оболочках дрожжей, влияют на гидрофобные свойства поверхности и регулируют интенсивность окислительных процессов в мембранах;
Клетки дрожжей-сахаромицетов при культивировании в виде биопленок на поверхности жидких субстратов синтезируют липофильные метаболиты, обладающие АП и АО свойствами; в условиях окислительного стресса в клетках происходят согласованные изменения биохимических и ф.-химических свойств липидов;
В зависимости от условий реакции и состава реагентов синтезируемые микроорганизмами АП могут разрушать гидропероксиды с образованием как молекулярных, так и радикальных продуктов, влияя на скорость ПОЛ как интра-, так и экстрацеллюлярно.
Научная новизна. Впервые изучены функциональная роль и кинетические свойства структурных липидов клеток микроорганизмов и липофильных метаболитов в реакциях жидкофазного низкотемпературного автоакисления. Показано, что процессы распада гидропсроксидов играют важную роль в регуляции интенсивности ПОЛ мембран дрожжей и бактерий. Установлено, что некоторые штаммы УПБ при культивировании в питательных средах, со- -9-держащих липиды, синтезируют и высвобождают в субстрат липофильные сидерофоры, обладающие АО, АП и биоцидньши свойствами.
Впервые показано, что величина АПА липидов клеток микроорганизмов количественно зависит не только от присутствия в составе липидов веществ, способных разрушать гидропероксиды, но и от качественного и количественного содержания самих гидропероксидов.
Установленные в работе факты взаимосвязи величины АПА липидов клеточной стенки дрожжей с сорбционными свойствами стенки в отношении липидов питательного субстрата указывают, что липофильные АП прямо или косвенно влияют на гидрофобность клеточной поверхности.
Впервые установлено, что пленкообразующие дрожжи-сахаромицеты в условиях окислительного стресса синтезируют и высвобождают в субстрат липофильные метаболиты, обладающие АП и АО свойствами.
Показана способность липофильных АО (ТФ и ФЛ) в составе жидкой питательной среды, используемой для культивирования микроорганизмов, избирательно взаимодействовать с неполярными липидами с образованием микроструктур. Структурированность липидов предполагает взаимосвязь их сорбционных и кинетических свойств при взаимодействии с клеточной поверхностью микроорганизмов.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Исследованный механизм сорбционных взаимодействий клеточной поверхности дрожжей с липидами питательного субстрата позволяет оптимизировать технологию производства биосорбентов для применения в пищевой промышленности (виноделие и пивоварение), при экологических загрязнениях (нефть, тяжелые металлы, пестициды), сельском хозяйстве (детоксикация кормов), медицине (профилактика и лечение инфекционных заболеваний). Разработан метод специальных графических построений для исследования кинетических свойств липидов биосорбентов.
Установленный механизм токсигенизации питательного субстрата при культивировании УПБ позволяет выработать новые стретегии в лечении и профилактике инфекционных заболеваний.
Изученные физико-химические и биохимические свойства липидов пленкообразующих дрожжей-сахаромицетов могут быть использованы как для улучшения биотехнологии продуктов ферментации, так и для создания более эффективных антимикробных препаратов.
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
В конце 80-х - начале 90-х годов прошлого столетия в институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, московском государственном университете пищевых производств группой ученых была проведена работа по исследованию влияния состава питательной среды на токсигенные свойства УП эктеробактерий и других ГНБ, в результате которой были получены следующие принципиальные результаты (8): проведен скриннинг УПБ и выявлены отдельные штаммы, не относящиеся к активным продуцентам экзотоксинов, способные вызывать токсическую биоконверсию субстрата при росте в средах, содержащих липиды (1-5%), разработана тест-система для экспресс-диагностики токсичности (протистоцидный биотест на клетках инфузорий Paramecium aurelia), результаты применения которой коррелировали с другими биомоделями (летальность мышей), изучены изменения состава и физико-химических свойств липидов в токсичных средах. АОА липидов токсичных сред была выше, чем в нетоксичных для всех изученных видов бактерий. Групповой состав липидов сред выявил изменения во всех фракциях, однако определенных закономерностей найдено не было, в некоторых случаях при совместном культивировании бактерий с дрожжами-сахаромицетами АОА липидов и токсичность среды были значительно ниже, чем при раздельном культивировании. При всей практической и научной ценности работы, природа токсинов и механизм токсигенезации/детоксикации не были установлены. Между тем, основная суть проблемы состояла в том, чтобы выяснить 1) какое влияние могли оказывать липиды культуральной среды на метаболизм и свойства микроорганизмов, и 2) какова природа липофильных АО и их роль в механизме токсигенезации/детоксикации субстрата?
Влияние экзогенных липидов на физико-химические свойства внешней мембраны
Важным звеном в механизме утилизации липидов и повреждающего воздействия гидрофобных токсикантов является адсорбция липофильных соединений клеточной поверхностью бактерий и дрожжей. По степени гидро-фильности поверхности различают гладкие и шероховатые типы клеток, Присутствие гидрофильных полисахаридных молекул на поверхности внешней мембраны бактерий способствует ее гидрофилизации (гладкий тип), тогда как укорачивание длины полисахаридных молекул увеличивает гидро-фобность (шероховатый тип). Так как процесс адсорбции липидов предпочтителен на более гидрофобных поверхностях, то изменение поверхностных свойств клеток микроорганизмами является необходимым условием проникновения липидов в клетку, где возможно их биохимическое pacEBeiEiBHHginosa и других бактериях изменение структуры липополисаха-ридных молекул внешней мембраны влияет на гидрофобность клеточной поверхности. Амфифильная природа молекул ЛПС является результатом ковалентного соединения трех структурных элементов: ли пила А, олигосахарида кора и полисахаридного О-антигена. О-антигенный участок контактирует с окружающей средой и непосредственно определяет неспецифические свойства клеточной поверхности, такие как гидрофобность (205). Относительно гидрофильная поверхность проницаема для малых (ММ до 600) гидрофильных молекул и не проницаема для гидрофобных (193). Многие гидрофобные антибиотики неэффективны в отношении ГНБ как раз в силу плохой проницаемости внешнего липополисахаридного слоя. Интересно, что в присутствии бактериальных ФЛ, проницаемость этого слоя для антибиотиков резко возрастала (288). Не исключено, что увеличение содержания ФЛ в токсичных средах культивирования бактерий имеет прямое отношение к механизму утилизации липидов клетками (8). P.aeruginosa экспрессирует два различных типа молекул ЛПС; А-цепь и Б-цепь. Более короткая А-цепь ЛПС состоит из 23 рамнозных трисахаридных единиц, в то время как более длинная Б-цепь содержит многочисленные мо-носахаридные молекулы, также как и ди- и пентасахаридные единицы (264). Изменение условий роста бактерий может повлиять на экспрессию ЛПС и, как результат, на свойства клеточной поверхности. Например, рост бактерий на н-гексадекане приводит к сокращению структуры ЛПС и увеличению гидрофобное клеточной поверхности (94). Мутанты с отсутствующей Б-цепью имели увеличенную гидрофобность и адгезию к полистирену (205). При сравнении динамики роста и гидрофобности поверхности бактерий, образующих шероховатые и гладкие колонии, установлено, что при росте на глюкозе клетки содержали высокомолекулярную отрицательно заряженную Б-цепь ЛПС и низкомолекулярную нейтральную А-цепь, что обеспечивало низкую гидрофобность поверхности.
При выращивании обоих фенотипов на алканах А-цепи ЛПС не меняли структуру, тогда как Б-цепь была укорочена, что обеспечивало большую гидрофобность клеточной поверхности (237). Иной механизм увеличения гидрофобности поверхности при утилизации алканов обнаружен у бактерий и дрожжей, синтезирующих биосурфактанты (236), Деградация гексадекана синтезирующими рамнолипиды бактериями {P.aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Rhodococcus erythropolis, R. erythropolis) стимулировалась рамнолипидом в значительно большей степени, чем другими био- и синтетическими сурфактантами. Как оказалось, рам-нолипид увеличивает гидрофобность поверхности и адгезию к алканам путем экстракции гидрофильного ЛПС из внешней мембраны. Стимулирующий эффект рамнолипида связан также с улучшением растворимости гидрофобных молекул в водной среде (346). Сурфактанты, синтезируемые Candida antarctica, влияли не только на гидрофобность, но и на дзета-потенциал клеточной поверхности (151). Высвобождаемые из клеточной стенки молекулы ЛПС сами по себе являются анионными ПАВ и обладают афинностью к различным двухвалент- ным катионам, катализируя окисление некоторых из них (269). Способствовать экстракции ЛПС из мембраны могут липиды питательной среды. В отличие от средне- и низкомолекулярных жирных кислот, высокомолекулярные ЖК (ВМЖК) имеют очень низкие константы диссоциации карбоксильных групп. В этой связи очень низка вероятность образования прочных комплексов, например, между олеатом и железом. В то же время при щелочных рН ЖК могут находиться в ионизированной форме, образуя различные по растворимости соли с катионами кальция и магния, называемые также мылами. При этом фазовое состояние ЖК и их солей в водном растворе определяется степенью ионизации карбоксильной группы, которая зависит от рН среды, длины ацильной цепи и степенью ненасыщенности ЖК (76). То есть, в среде роста бактерий в процесс гидролиза липидов и накопления свободных ЖК могут образоваться анионные ПАВ, обладающие критической концентрацией мицеллообразования (ККМ) и способные влиять на свойства клеточной стенки подобно другим детергентам. Кальций- и магнийсвязывающая способность различных структурных фрагментов фосфолипида дипальмитоилфосфатидилсерина (ДПФС) была изучена в работе (182). Среди исследованных фрагментов были дипальмито-илфосфатидная кислота (ДПФК), пальмитиновая кислота (ПаК), дипальми-тоилглицерид, глицерин, глицерин-3-фосфат, глицерофосфорилсерип и фос-форилсерин. Как оказалось, наибольшим влиянием на структуру и проницаемость клеточной стенки, связанным с высвобождением молекул ЛПС, у псевдомонад обладает ДПФК, далее ДПФС и с большим отрывом от них ПаК. Остальные фрагменты влияние не оказывали. Способность разных ФЛ и их производны высвобождать молекулы ЛПС из клеточной стенки коррелировала с их способностью связывать матриксобразующие катионы (МОК) магния и кальция во внешней мембране. Данная способность, в свою очередь, определялась наличием анионной карбоксильной или фосфатной группы и гидрофобного ацильного заместителя. Все гидрофильные фрагменты ФЛ, независимо от наличия у них анионного заряда, были не способны связываться с МОК ЛПС и высвобождать эндотоксин из клеточной стенки зываться с МОК ЛПС и высвобождать эндотоксин из клеточной стенки бактерий. Предполагается, что наилучший доступ к связующим катионам ЛПС имеют те производные ФЛ, которые образуют мицеллы. Важным выводом было также то, что связывание и удаление катионов кальция из внешней мембраны бактерий структурными фрагментами ФЛ играло более значимую роль в дестабилизации ЛПС, чем связывание магния. Хотя амфифильные анионные вещества проникают через внешнюю мембрану ГНБ намного медленнее, чем незаряженные (247), мицеллообразую-щие свойства свободных ЖК могут позволить им свободно проникать через гидрофильный полисахаридный слой внешней мембраны и связываться с металлами, обеспечивающими прочность липо пол и сахар идного каркаса (254).
Установлено, что детергенты могут усиливать проницаемость внешней мембраны для различных повреждающих агентов (хелаторов, антибиотиков и др.), и наоборот, комплексобразующие агенты могут усиливать повреждающее действие детергентов (155). Если сурфактанты способствуют повышению гидрофобности поверхности и тем самым улучшают усвоение клетками липофильных веществ, то природные АО могут препятствовать этому процессу. Так, например, витамин Е в количестве 0,5 мг/л значительно уменьшал гидрофобность поверхности клеток Е.соіі (316). Полученные в работе результаты привели авторов к выводу, что окислительный стресс играет важную роль в модификации клеточной поверхности бактерий, и что ред-окс потенциал организма-хозяина может быть определяющим фактором в бактериальной колонизации животных тканей и органов. В сравнении с составом липидов низших и высших эукариотов лип иды мембран бактерий отличаются заметно практически по всем фракциям. Мембраны состоят в основном из ФЛ, жирнокислотпый состав которых может значительно варьироваться в зависимости от вида бактерий, условий их культивирования и многих других факторов. Внешняя и внутренняя мембраны Е.СОІІ содержат три основных ФЛ (146): ФЭ (75-80%), ФГ (15-20%) и КЛ (2-6%). Особенностью состава внутренней мембраны является то, что она содержит на 5-10% меньше ФЭ. Ацильные цепи ФЛ содержат четыре главные ЖК: миристинову (14:0), пальмитиновую (16:0), пальмитоолеиновую (16:1) и цисвакценовую (18:1) (83). Две минорных кислоты (лауриновая и 3-гидроксимиристиновая) входят в состав исключительно липида А, тогда как пальмитиновая, пальмитоолеиновая и цисвакцсновая входят в состав ФЛ. Липиды в составе мембран бактерий являются важнейшей частью эффективного адаптационного механизма, отражающего изменения состояния окружающей клетку среды (89).
Взаимосвязь метаболизма липидов и АО у бактерий
Как было недавно установлено в одной из приоритетных работ (166), высвобождение некоторых феназиновых пигментов бактериями рода Pseudomonas может быть стимулировано в присутствии липидов. Другими метаболитами псевдомонад, связанными с утилизацией липидов, являются хиноловые сигнальные молекулы-аутоиндукторы Максимум их накопления во внеклеточной среде приходится на позднюю стационарную фазу (32 - 45 ч) (216), что совпадает с динамикой токсичности липидсодер-жащих сред культивирования псевдомонад и под контролем которых находятся гены, кодирующие липазы и отвечающие за синтез биосурфактанта рамнолипида. Структура сигнальных молекул позволяет отнести их к липо- фильным АО (244). Это означает, что сочетание сигнальных и АО свойств аутоиндукторных молекул может быть дополнено их цитотоксичностью. Существование косвенной взаимосвязи между метаболизмом АО и липидов было показано на примере дрожжей-сахаромицетов, не синтезирующих сидерофоры. Таннин, обладая свойствами лиганда, замедлял скорость роста дрожжей, однако при дополнительном внесении в среду культивирования железа, так же как и при добавлении ненасыщенных жирных кислот, скорость роста дрожжей вновь достигала контрольного уровня (332). По одной из версий, экзогенные ЖК каким-то образом улучшают транспорт железа в клетки. Однако при этом не учитывается, что таннин, кроме того что он является лигандом железа, обладает также сильными АО свойствами, влияя на процессы ПОЛ мембран дрожжей. Наиболее вероятно, что функциональная активность мембранных белков зависит от микровязкостных свойств фосфо-липидного бислоя. Таннин, уменьшая интенсивность ПОЛ, увеличивает микровязкость мембраны, тогда как свободные НЖК делают ее более текучей. Вероятно, у бактерий при определенных условиях процесс синтеза и секреции сидерофоров (особенно тех, которые обладают высокой АОА и являются липофильными) также может быть функционально связан с процессом утилизации липидов. У микобактерий обнаружен металл-зависимый протеиновый регулятор IdeR, который в присутствии железа связывается с ДНК, коїпролируя транскрипцию генов, вовлеченных в метаболизм липидов и синтез сидерофоров (265). В частности, установлено, что в условиях обеспеченности железом в среде роста бактерий (50 иМ) данный регулятор репрессирует транскрипцию генов fadD.fadE и ПрК, участвующих в биодеградации липидов, а также генов, ответственных за синтез липофильного сидерофора микобактина.
В состав каталитических центров многих ферментов, участвующих в трансформации липидов внутри клетки, входит железо. Например, десатури-рование жирных кислот катализируется ферментами, содержащими два атома железа в каталитическом центре (107). Взаимосвязь между содержанием железа и продукцией экзолипазы клетками Acinetobacter calcoaceticus была исследована в работе (238). Липазная активность и продукция липофильных сидерофоров коррелировали с составом среды и содержанием железа. Так, в минимально обеспеченной по азоту среде в условиях дефицита железа липазная активность была низкой, а продукция сидерофоров высокой. Однако в обогащенной азотом среде в условиях дефицита железа активность липазы возрастала в 4 раза. Бактерии Pseudomonas fluorescens синтезируют пигмент пиовердин, выполняющий функции сидерофора. Пигмент в концентрации б мМ стимулировал синтез экстрацеллюлярной протеиназы и липазы, но не оказывал влияние на активность этих ферментов (214). Максимальный синтез пиовердина, протеиназы и липазы был получен при содержании железа (НІ) в среде роста равном 5,75 цМ. Скорость роста была максимальной при концентрации железа 8,75 цМ. Синтез пиовердина был снижен на 3,6%, протеиназы на 6,6% и липазы иа 30% при увеличении железа в субстрате до 23 цМ. Мутанты Pseudomonas fluorescens, не способные к синтезу пиовердина, не продуцировали экзолипазу, в то время как продукция экзопротеазы оставалась в норме (103). Рост мутантов в присутствии пиовердина стимулировал активность липазы в 2,5 раза. В железодефицитной среде мутанты росли плохо, однако при добавлении Fe3+ скорость роста и активность протеазы возрастали, тогда как активность липазы мало изменялась. Очевидно, синтез и секреция экзолипазы взаимосвязаны не только с содержанием железа в среде и клетках, но и с продукцией сидерофоров. Как известно, скорость роста является важным фактором микробиальной патогенности и вносит существенный вклад в распространение инфекции. Во время инфекции скорость роста популяции варьирует от низкой до быстрой в зависимости от стадии инфекции, концентрации и доступности основных рост-лимитирующих нутриентов. В условиях недостатка железа условный патоген Burkholderia cepacia выделенный у пациентов с кистозным фиброзом легких, синтезировал сидерофоры в строгой зависимости от скорости роста и степени аэрации (215). В кислородной среде бактерии синтезировали максимум сидерофоров при максимальной скорости роста. В бескислородной среде синтез хелаторов практически не зависел от скорости роста культуры. При тех же условиях активность протеазы имела такие же зависимости, тогда как активность липазы находилась в противофазе к активности протеазы и сидерофоров, снижаясь до нуля уже при средних скоростях роста. Фактически, в условиях периодической культуры скорость синтеза сидерофоров должна достигала максимума в середине логарифмической фазы роста, предшествуя стадии усвоения липидов в условиях стационарной фазы. Хотя активность синтеза сидерофоров заметно снижается в постлогарифмическую стадию, концентрация хелаторов может оставаться высокой в течение нескольких суток стационарного роста (175). Таким образом, утилизация липидов клетками бактерий всегда происходит на фоне высокого содержания в среде роста сидерофоров. Представленные выше данные указывают на наличие тесной взаимосвязи между процессом утилизации липидов питательного субстрата и появлением в среде роста бактерий сидерофоров. Логика данной взаимосвязи становится понятной, если учесть, что утилизация липидов бактериями сопряжена с влиянием продуктов гидролиза (свободных ЖК) на свойства мембран бактерий, с одной стороны, и на величину активной кислотности в среде обитания, с другой. Присутствие в среде железа в количествах, позволяющих ему свободно диффундировать через мембрану, может усилить стресс и привести к гибели клетки. Решить проблему могли сидерофоры, инактивирующие каталитические свойства железа путем связывания его в прочные комплексы.
Однако синтез хелаторов находится в обратной зависимости от содержания железа в среде роста, поэтому в условиях перегрузки железом липиды бактериями не усваиваются и сидерофоры не высвобождаются. В условиях, когда среда роста изначально содержит липиды, повышенная концентрация сидерофоров может быть вызвана как превентивной необходимость обеспечения биохимических процессов усвоения липидов и роста культуры, так и негативным влиянием на комплексообразующие свойства хелаторов в условиях снижения рН, вызванного гидролизом ТАГ. Параллельно, процесс гидролиза липидов и накопление свободных ЖК в среде обитания бактерий мог вызвать дезорганизацию клеточной стенки и высвобождение эндотоксина, что должно также улучшить контакт липофильных сидерофоров с мембранными рецепторами. Возможно, что сидерофоры в механизме утилизации липидов играют какую-то особую роль, не обязательно связанную с обеспечением клеток железом или его инактивацией. Если при свободной диффузии ненасыщенных ЖК через мембраны бактерии испытывают окислительный стресс, то у них должна возникнуть необходимость в дополнительной защите мембран и ДНК от повреждающего действия продуктов ПОЛ. Частично такая защита может быть обеспечена путем дополнительного синтеза ферментов антиоксидант-ной защиты, но для их активации также требуется железо и, соответственно, средства для его доставки в клетку. При этом в условиях дефицита железа, даже при наличии средств его доставки в клетку, бактерии не застрахованы от проблем с активацией ферментов. Не исключено поэтому, что в регуляции ПОЛ мембран бактерий могут быть задействованы АО свойства липофильных сидерофоров, которые при определенном состоянии клеточной стенки способны диффундировать в мембраны вместе с ЖК питательного субстрата, обеспечивая защиту от окислительного стресса. 2.6. Цитотоксичность сидерофоров. Применение липофильных хелаторов в клинической практике.
Результаты и их обсуждение
Как известно, среда обитания во многом определяет структуру и свойства клеточной поверхности микроорганизмов. Сорбционные свойства клеточной стенки дрожжей и бактерий тесно связаны с такими характеристиками, как гидрофобность и электрический потенциал. В свою очередь, эти свойства могут изменяться под воздействием рИ и состава среды, температуры и других факторов (138, 139). При этом состав и свойства липидов мембран также взаимосвязанно реагируют на условия среды обитания микроорганизмов, В настоящее время липиды клеточной стенки редко рассматриваются как основной фактор, определяющий гидрофобность клеточной поверхности микроорганизмов. На поверхности неповрежденной дрожжевой клетки гид рофобные участки обычно формируют N-концевые фрагменты белковых мо лекул (флокулины, лектины, гидрофобины и т.д.), обогащенные серином и треонином (158, 210, 23). Тем не менее, большинство из этих молекул заяко рены С-концевым фрагментом в плазматической мембране (170, 331), и их физико-химические свойства модулируются состоянием липидной фракции мембраны (322). Кроме того, мембранная транслокация белков сама по себе тесно связана с составом ФЛ мембран (106, 95). Известны также многочис ленные экспериментальные данные, которые указывают на тесную взаимо связь между составом липидов мембран и функциональными свойствами и клеточной поверхности (59, 96, 297, 53). Изменение гидрофобности клеточ- ной поверхности дрожжей и бактерий коррелирует с содержаним основных фракций ФЛ в мембранах (161), изменением их жирнокислотного состава (246), текучестью липидов мембран (48) и другими характеристиками. В отличие от интактных клеток, у которых участки с гидрофобными свойствами могут образовывать белки и пептидогликаны, на поверхности изолированных дрожжевых оболочек дополнительные гидрофобные зоны могут формировать фрагменты фосфолипидного бислоя ЦПМ и стерины. Поскольку состав липидов питательного субстрата во многом определяет условия роста и характер метаболизма микроорганизмов, в данной работе нам предстояло также выяснить, какую роль в адсорбции липидов из среды культивирования микроорганизмов могут играть липиды дрожжевых оболочек.
Для оценки степени гидрофобности поверхности клеток наиболее часто используют методы, использующие хроматографию (287), адгезию клеток к углеводородам (267), изменение контактного угла между поверхностью клеток и границей раздела фаз (63), проницаемость клеток для флуоресцентных гидрофобных молекул (283), подсчет числа адсорбированных полистирсно-вых микросфер на поверхности клетки и др.(137, 138). Характерной особенностью этих методов является то, что в них клетки исследуются как правило изолированно от той среды, в которой они росли, что, по-видимому, является одной из основных причин частого несоответствия в оценке гидрофобности, полученной разными способами. Для устранения этого недостатка в определении поверхностных свойств клеток нами была разработана и использована модель, основанная на способности гидрофобных молекул в водных растворах адсорбироваться на твердых гидрофобных поверхностях. То есть о степени гидрофобности клеточной поверхности можно судить, например, по степени адсорбции липидов из жидких культуральных сред. Кроме того, использование естественной среды обитания дрожжей позволяет определять не только степень гидрофобности клеток, но и свойства липидов, адсорбируемых клеточной стенкой из среды. На первом этапе работы было исследовано содержание, состав и физико-химические свойства липиднои компоненты клеточных оболочек дрожжей и изучено влияние состава и физико-химических свойств липидов КОД на их устойчивость к деструктивным процессам в течение длительного периода хранения препаратов. Из полученных нами данных (табл. 1-12) следует, что на состав и содержание липидов в препаратах существенное влияние оказывали не только таксономические различия дрожжей, но и способы получения препаратов, а также продолжительность их хранения. Наибольшее количество липидов в начальный период хранения было обнаружено в препарате КОД-Ф (15,1%), наименьшее - в препарате КОД-С (0,9%). Во всех препаратах основными фракциями ФЛ были: фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилсерин (ФС), фос-фатидилинозитол (ФИ) и фосфатидилэтаноламин (ФЭ). Их содержание колебалось в следующих пределах: ФХ - от 16% (КОД-С) до 47% (КОД-90); {ФС+ФИ} - от б% (КОД-Т) до 40% (КОД-С); ФЭ - от 3,5% (КОД-90) до 41% (КОД-Т). Наибольшее количество ФЛ содержали препараты КОД-УР и КОД-Ф (соответственно 44% и 42% от общего содержания липидов). Содержание стеринов в составе липидов препаратов также характеризовалось широким интервалом значений: от 2% (КОД-С) до 41% (КОД-Ф). Во всех исследованных нами препаратах обнаружен се-токоферол (ТФ) в количестве от 0,013 до 0,029% от массы липидов (табл. 4). Также во всех препаратах присутствовали липидные гидропероксиды (LOOH). Их наибольшая концентрация обнаружена в составе липидов препаратов КОД-90 и КОД-А (4,0 и 1,8 ммоль/г соответственно). Липиды препаратов КОД-С и КОД-90 обладали прооксидантными свойствами, то есть ускоряли окисление МеО, тогда как липиды остальных четырех препаратов в разной степени обладали слабыми АО свойствами. В работе проводилось исследование структурного состояния препара тов КОД методом ЭПР спиновых зондов. Результаты исследований сравни вали с аналогичными, полученными при работе с нативными клеточными » стенками дрожжей рода Saccharomyces и Shizosaccharomyces.
Сравнение спектров ЭПР зонда I, встроенного в гидрофобные участки липидных моле- кул нативных клеток и регидратированных клеточных стенок показало, что как способ выделения клеточных стенок, так и видовые различия дрожжей оказывали значительно меньшее влияние на подвижность ацильных цепей и плотность упаковки липидных молекул, чем процессы де- и регидратации клеточных стенок. тельно локализующегося по всему объему клеточной стенки, оказывали влияние ряд параметров липидов. Установлена зависимость времени корреляции вращения зонда II от концентрации в липидах ФЛ (рис.1) и величины АОА липидов (рис.2), из чего следует, что структурные свойства липидной фракции могли быть тесно взаимосвязаны с физико-химическими свойствами всей клеточной стенки, либо зонд 2 взаимодействует преимущественно с полярными липидами. В сравнении с нативными клетками дрожжей скорость вращения зонда II в суспензиях регидратированных препаратов КОД была от 2 до 25 раз медленнее, что говорит о необратимых изменениях в структуре молекул клеточной стенки дрожжей под воздействием процесса обезвоживания. Как было показано в работе (48) для бактериальных клеток, плотность упаковки ли-пидных молекул в составе клеточной стенки взаимосвязана с гидрофобнос-тью стенки и ее проницаемостью для липофильных соединений. Вероятно также, что уплотнение упаковки липидных молекул клеточных стенок дрожжей повлияло на окислительную стабильность фракции при хранении препаратов (например, вследствие ограничения диффузии кислорода). 3.2.1.2. Изменение состава и свойств липидов КОД при хранении Установлено, что процессы окисления полимеров происходят по гете-рогенно-гетерофазному механизму (10). Кинетика протекания гетерофазных цепных реакций с участием АО в полимерной матрице отличается от гомо-генно-жидкофазных реакций наличием сопряженных реакционных цепей, локализованных в раздельных зонах цепочно-губчатых мицелл (9). В этой связи, процессы окислительной деструкции липидов в препаратах КОД могут существенно различаться в зависимости от структуры биополимеров и локализации липидов. Из полученных данных (табл. 1-6) следует, что изменения в содержании исследуемых фракций липидов в большей или меньшей степени затронули все без исключения препараты. Однонаправленными на исследуемом этапе хранения и характерными для всех препаратов можно назвать изменения содержания лишь некоторых фракций ФЛ.
Кинетические и биологические свойства липофильных АО в средах роста условно-патогенных грамотрицательных бактерий
Ранее в работе (8) был исследован феномен токсигенизации сред роста энтеробактерий, не относящихся к активным продуцентам белковых экзотоксинов, при культивировании в синтетических и натуральных средах, содержащих растительные масла (1-2% w/v), том числе в арахисовой питательной среде. Некоторые виды семейства Enterobacteriaceae обнаруживали ряд общих закономерностей метаболизма липидов, однако природа токсинов и механизм токсигенизации не были установлены. Обмен ФЛ между бактериальной клеткой и окружающей средой может являться показателем метаболической активности клеток (110) и следствием повреждения внешней мембраны (246). В продолжении работы по исследованию механизма неспецифической токсигенизации субстрата нами был изучен метаболизм ФЛ клетками бактерий E.coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Cilrobacter freundii и Pseudomonas aeruginosa при азробном культивировании в АПС с содержанием общих липидов (ОЛ) до 10 г/л и ФЛ до 10% отОЛ. В процессе усвоения липидов клетками бактерий могло происходить повреждение внешней мембраны в результате окислительного стресса, вызванного диффузией свободных ЖК. Во внешней мембране ГНБ ЛПС тесно сопряжен с фосфолипидным монослоем, состоящем в основном из нейтрально заряженного ФЭ. Высвобождение эндотоксина в виде свободных молекул или в виде везикул может в той или иной степени затрагивать этот монослой, в результате чего в супернатанте может повышаться относительная доля этого ФЛ (348, 145). Так как кроме ФЭ другими основными фракциями в клетках энтеробактерий являются ФГ и КЛ, мы определили соотношение этих основных фракций ФЛ, а именно ФЭ/(КЛ+ФГ), в средах роста токсигенных клебсиелл и эшерихий. Как видно из данных рис.29, соотношение основных ФЛ изменялось согласованно с ростом токсичности, приближаясь в остротоксичных средах к величинам, которые более характерны для мембран самих бактерий, в частности E.coli (222). Исследование состава ФЛ клеток токсичного штамма цитробактерий, а также токсичных и нетоксичных сред после их роста, показало, что в клетках величина соотношения ФЛ достигает значения 6:1, тогда как в средах роста она не превышает 2:1, причем в нетоксичных вариантах этот показатель был выше, чем в токсичных (табл.24). То есть, утечка мембранных ФЛ, как фактор повреждения внешней мембраны, не является определяющим звеном в механизме неспецифической токсигенизации субстрата при культивировании бактерий.
Схожие с цитробактериями результаты были получены для клеток и остротоксичных сред после роста псевдомонад (табл.24), причем в данном случае величина соотношения основных ФЛ была значительно ниже, чем в средах после роста нетоксичных штаммов эшерихий (0,23 против 0,9). Эти величины сильно отличаются от тех, что были ранее установлены для других эн-теробактерий, особенно штаммов Е.соїі. Цитробактерии по этому показателю были ближе к пседомонадам, чем к другим энтеробактериям. Если учесть, что гибель и автолиз клеток в средах роста бактерий был незначительным (на что косвенно указывает низкое содержание липидных гид-ропероксидов), то можно предположить, что у разных видов токсигенных бактерий процесс высвобождения фрагментов клеточной стенки, содержащих ФЛ внутреннего слоя внешней мембраны, происходил с разной интенсивностью, и, по всей видимости, не всегда был взаимосвязан с высвобождением токсичных продуктов. Сравнительный анализ биологических, биохимических и физико-химических свойств различных типов бактериальных токсинов показал, что предполагаемый механизм токсигенеза липидсодержащих субстратов мог быть связан с высвобождением живыми бактериями в среду культивирования липополисахаридного эндотоксина в свободной форме, либо в виде везикул (145, 150, 327). Для многих патогенных бактерий ЛПС является одним из основных факторов вирулентности (261, 31). С целью выяснить роль эндотоксина в липидзависимой токсигенизации субстрата при росте УПБ мы определили с помощью ЛАЛ-теста содержание ЛПС в средах роста токсичного и нетоксичного штаммов Е.соїі, Как оказалось (рис.30), содержание ЛПС в токсичных средах значительно (в 20 - 160 раз) превосходило этот показатель в нетоксичных средах. Очевидно, свободный эндотоксин мог быть одним из основных токсичных компонентов культуральных сред после роста УПҐНБ. Поскольку в работе (8) для контроля токсичности сред использовались разные биомодели, включая тесты на подвижность инфузорий {Paramecium auretia) и летальность мышей, результаты которых коррелировали, мы исследовали биоактивность отечественного коммерческого препарата «пирогенал» в соответствующих концентрациях. Как самостоятельный токсичный компонент ЛПС не вызывал гибель беспородных мышей при внутрибрюшишюм введении без предварительной сенсибилизации галактозамином в дозах до 150 иг/мышь. При тех же концентрациях, которые обнаружены нами в обеспложенных остротоксичных средах после роста бактерий, эндотоксин не оказывал влияние и на активность парамеций. Более того, альтернативный биотест на дафниях (род пресноводных животных подотряда ветвистоусых рачков) показал, что при концентрациях эндотоксина, сопоставимых с его содержанием в остротоксичном супернатанте после роста бактерий, он также не являлся токсичным. Из этого нами был сделан вывод, что помимо эндотоксина клетки бактерий высвобождают другие токсичные метаболиты или синергисты эндотоксина, например, биогенные амины (309, 184). Ранее в работе (8) было установлено, что токсичные среды после роста бактерий, не зависимо от их видовой принадлежности, содержали липиды, величина АОА которых многократно превосходила аналогичный показатель липидов нетоксичных сред. Учитывая природу эндотоксина и возможности модификации его структуры в зависимости от условий роста бактерий (47), нами было сделано предположение о возможном вкладе ЛПС в показатель АОА липидов. Как известно, в результате модификации ЛПС может терять полисаха-ридную цепь, образуя шероховатый тип поверхности бактериальной клетки с увеличенными гидрофобными свойствами. Несмотря на то что в опытах in vivo токсичность эндотоксина связана со свободнорадикальным окислительным механизмом (334), в ряде исследований показано, что отдельные структурные фрагменты эндотоксина после модификации могут приобретать свойства, типичные для АО (126). Так, например, фосфорилэтаноламин в отличие от фосфорилхолина in vivo может обладать антиоксидантиыми свойствами, являясь эффективной ловушкой супероксида.
При этом вирулентность патогенных бактерий, связанная со свойствами Липида А, также может изменяться при модификации структуры ЛПС (132). Мы провели исследование АО свойств липополисахарида, выделенного из сальмонелл (препарат «пирогенал»), на метилолеатной окислительной модели. Как оказалось (табл.26), ЛПС обладает слабыми АО свойствами и его присутствие не может объяснить высокую АОА липидов токсичных сред. Поскольку в качестве питательной среды для культивирования бактерий использовалась АПС, приготовленная на основе зерен арахиса, богатого маслом и токоферолом, было сделано предположение о возможном вкладе этого ингибитора в величину АОА липидов. Тем более, что ранее (глава 3.2.2.1) при исследовании влияния центрифугирования на свойства липидов АПС было установлено, что величина АОА липидов может возрастать в несколько раз за счет качественного и количественного перераспределения доли ингибиторов, инициаторов и их синергистов в результате селективных сорбцион-ных взаимодействий липидных фракций с коллоидными частицами пульпы. На примере токсигенного штамма Citrobacter freundii 1922 нами было установлено (рис.21), что в процессе роста культуры и накопления токсичных продуктов, концентрация ТФ в составе липидов среды резко снижается (в остротоксичных средах в 15 и более раз). По сравнению с токсичными, рост нетоксигенных штаммов в аналогичных условиях обычно сопровождал незначительное падение содержания ТФ. Учитывая динамику величины АОА липидной фракции в токсичных средах, можно сделать вывод, что ТФ а) не является основным ингибитором, определяющим высокие величины АОА липидной фракции в токсичных средах, и б) активно используется токсиген-ными бактериями в процессе утилизации липидов субстрата. Взаимосвязь между метаболизмом липидов и ТФ становится понятной, если учесть, что свободные ненасыщенные ЖК, также как и их моноглице-ридные формы, при диффузии через клеточную стенку оказывают повреждающее действие на мембраны бактерий, вызывая окислительный стресс (296, 120), тогда как ТФ, обладая протекторными свойствами, мог быть использован бактериями для стабилизации мембранных структур.
