Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 19
1.1. Современные биоаналитические системы, основанные на микроорганизмах
1.2. Биоимитирующие системы на основе клеток микроорганизмов
1.3. Наномодифицированные микроорганизмы. Функционализация единичных клеток и их применение в качестве компонентов функциональных устройств
1.4. Характеристика метода послойного нанесения пленок 53
полиэлектролитов как эффективного способа функционализации поверхностей и коллоидных частиц
1.5. Применение метода послойного нанесения пленок полиэлектролитов для поверхностной модификации клеток
1.6. Искусственные многоклеточные кластеры из клеток микроорганизмов Экспериментальные исследования
II.Материалы и методы 81
II.1. Материалы и аналитические методы 82
II.1.1. Материалы и реактивы 81
II.1.2. Микроорганизмы 82
II.1.2.1. Дрожжи 82
II.1.2.2 Бактерии 84
II.1.2.3. Одноклеточные водоросли 85
II.1.3. Физико-химические методы исследования 86
II.1.3.1. Динамическое светорассеяние (ДСР) для определения размеров и поверхностного потенциала ( -потенциала) клеток и частиц
II.1.3.2. Кварцевый микрогравиметрический анализ динамики адсорбции полимеров
II.1.3.3. Ультразвуковая обработка 87
II.1.3.4. Микроскопические методы 8 8
П.1.3.5. Спектроскопические методы 92
II.1.3.6. Рентгеноструктурный анализ 94
II.1.3.7. Магнитометрические исследования 94
П.1.3.8. Методы определения жизнеспособности клеток 94
П.2. Синтез, очистка, функционализация и характеристика наночастиц, углеродных нанотрубок и микрокристаллов
П.2.1. Синтез золотых наночастиц 95
П.2.2. Синтез серебряных наночастиц 96
П.2.3. Синтез и стабилизация магнитных наночастиц 96
II.2.4. Солюбилизация многостенных углеродных нанотрубок 97
П.2.5. Синтез и характеристика микрокристаллов карбоната кальция
П.З. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов при помощи полиэлектролитов и наноматериалов
П.З Л. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов полиэлектролитами
П.З.2. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов полиэлектролитами и наночастицами (нанотрубками)
П.3.3. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов полиэлектролит-стабилизированными наночастицами оксида железа (биосовместимым магнитными наночастицами)
П.З .4. Инкапсуляция микроорганизмов с помощью мезопористых оболочек из карбоната кальция
П.4. Клеточные биосенсоры на основе клеток микроорганизмов, функционализированных при помощи магнитных наночастиц и углеродных нанотрубок
П.4.1. Микрофлюидные системы (микрочипы) — дизайн, создание микрочипов и оптимизация их операционных характеристик
П.4.2. Электрохимические биосенсоры на основе живых клеток 105
микроорганизмов, функционализированных углеродными нанотрубками или магнитными наночастицами
П.4.2.1. Электрохимический биосенсор на основе клеток пекарских дрожжей, функционализированных углеродными нанотрубками и стеклоуглеродных электродов
П.4.2.2. Электрохимический биосенсор на основе магнитно- модифицированных клеток водорослей Chlorella pyrenoidosa, и печатных электродов
П.4.3. Клеточные биосенсоры на основе магнитно- 109
модифицированных ГМ-биорепортерных клеток бактерий Acinetobacter baylyi
П.4.4. Многоклеточные трехмерные кластеры (цитозомы) - техника формирования и характеристика
П.4.4.1. Методы получения цитозом 112
П.4.4.2. Сферические (изотропные) цитозомы 112
П.4.4.3. Анизотропные цитозомы иглообразной, планарной и кубической формы
Результаты исследований и их обсуждение. характеристика синтезированных наноматериалов и микрокристаллов
III. 1. Наночастицы благородных металлов (золота и серебра) 116
III.2. Суперпарамагнитные наночастицы оксида железа 119
III.З. Характеристика многостенных углеродных нанотрубок 123
III.4. Характеристика микрокристаллов карбоната кальция 125
III.5. Формирование многослойных полиэлектролитных пленок 131
на планарных поверхностях и на неорганических микрочастицах
IV. Функционализация микроорганизмов при помощи полимерных пленок, наночастиц и нанотрубок, включенных в состав полимерных пленок; полимер-стабилизированных наночастиц и мезопористых оболочек из карбоната кальция
IV. 1. Многослойные пленки полиэлектролитов для модификации поверхностей живых микроорганизмов
IV.2. Модификация поверхностей живых микробных клеток при помощи многослойных пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами и нанотрубками
IV.2.1. Алгоритм метода поверхностной модификации клеток 140
IV.2.2. Модификация клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae при помощи полиэлектролитных нанопленок и наноматериалов
IV.2.3. Модификация клеток бактерий Escherichia coli, Acinetobacter baylyi и Staphilococcus cohnii при помощи многослойных полиэлектролитных нанопленок и наноматериалов
IV.2.4. Функционализация клеток дрожжей, одноклеточных водорослей Chlorellapyrenoidosa и бактерий Acinetobacter baylyi и Staphilococcus cohnii при помощи РАН-стабилизированных магнитных наночастиц
IV.3. Оценка жизнеспособности клеток микроорганизмов, функционализированных при помощи многослойных полиэлектролитных нанопленок и наноматериалов
IV.4. Микроинкапсуляция клеток микроорганизмов в 190
мезопористые микрооболочки из карбоната кальция
V. Функционализированные микроорганизмы 200 как компоненты биоаналитических устройств
V.I. Характеристика микроорганизмов с использованием 200
поверхностно-усиленной Рамановской спектроскопии
V.2. Электрохимический биосенсор на основе клеток дрожжей, 212
функционализированных полиэлектролитными пленками и многостенными углеродными нанотрубками
V.3. Магнитно-модифицированные клетки как компоненты 221
биосенсоров для определения токсических веществ
V.4. Магнитно-модифицированные бактериальные 239
биорепортерные клетки (клетки-биосенсоры)
VI. Искусственные многоклеточные системы (цитозомы) на основе функционализированных микроорганизмов
VI. 1 Создание сферических цитозом на основе микропузырьков 250
воздуха
VI.2. Создание анизотропных цитозом на основе микрокристаллов карбоната кальция
VI.3. Создание анизотропных цитозом на основе магнитно- модифицированных микрокристаллов карбоната кальция
VL3.1. Магнитная модификация микрокристаллов карбоната кальция
VT.3.2. Формирование цитозом с использованием в качестве темплатов магнитно-модифицированных микрокристаллов карбоната кальция
VI.4. Создание анизотропных цитозом на основе полых 274
микрокапсул, полученных с использованием магнитно модифицированных микрокристаллов арагонита и кальцита
VL4.1. Получение полых анизотропных магнитно- модифицированных микрокапсул
VI.4.2. Формирование цитозом с использованием полых анизотропных магнитно-модифицированных микрокапсул
Выводы 290
Список литературы
- Биоимитирующие системы на основе клеток микроорганизмов
- Динамическое светорассеяние (ДСР) для определения размеров и поверхностного потенциала ( -потенциала) клеток и частиц
- Функционализация клеточных стенок микроорганизмов полиэлектролит-стабилизированными наночастицами оксида железа (биосовместимым магнитными наночастицами)
- Модификация поверхностей живых микробных клеток при помощи многослойных пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами и нанотрубками
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы развитие практически-ориентированных технологий на стыке биологии, физики, химии, электроники и материаловедения привело к формированию нового взгляда на роль микроорганизмов в создании биоаналитических и биоэлектронных устройств, которые уже в ближайшее время могут из прототипных проектов превратиться в рабочие инструменты биомедицины, экологического мониторинга и вычислительной техники.
Микроорганизмы рассматриваются как перспективный объект исследований в области синтетической биологии и биомиметики, междисциплинарных науках, целями которых являются создание искусственной жизни и биоимитирующих материалов и функциональных устройств, соответственно. Достижения синтетической биологии и биомиметики позволяют конструировать новые, основанные на биологических механизмах и процессах, технологии и устройства, применяемые практически во всех областях хозяйственной деятельности человека. Так, генетически модифицированные микроорганизмы могут быть использованы в качестве элементов биосенсоров (Huang et al., 2008), в масштабном производстве рекомбинантных белков и лекарств, а также в выработке биотоплива (Ro et al., 2006; Atsumi et al., 2009), а такие свойства микробных сообществ как, например, чувство кворума, могут быть использованы в логических устройствах и в микроэлектронике (Silva-Rocha, Lorenzo, 2008; Danino et al., 2010). В связи с развитием нанотехнологии как междисциплинарной области исследований, возник особый интерес исследователей к работам, в которых осуществляется комбинация функциональных свойств микробных клеток и наноразмерных структур (нанопленок, наночастиц, квантовых точек, нанотрубок и т.д.) (Berry, Saraf, 2005; Sugunan et al., 2007). В результате были получены и описаны гибридные биоимитирующие системы, состоящие из клеток микроорганизмов и наночастиц (Bai et al., 2009). Предполагается, что такие системы могут быть использованы в качестве электронных микроконтактов (Berry et al., 2005), микропроводов (Li et al., 2003) и средств эффективной терапии онкологических заболеваний (Kuo et al., 2008). Кроме того, модификация клеток микроорганизмов позволяет придать им дополнительные функции, не свойственные исходным, не модифицированным клеткам. Например, искусственный магнетотаксис, обусловленный комбинацией магнитных наночастиц и микробных клеток, обеспечивает осуществление манипуляций с модифицированными клетками в пространстве с использованием внешнего магнитного поля, что, в итоге, дает возможность создания новых сорбентов и ферментативных комплексов на основе микроорганизмов (Safarik et al., 2007). Кроме того, были разработаны методы упорядоченной иммобилизации клеток на поверхностях биоэлектронных устройств (Berry et al., 2004) и созданы прикрепленные к субстратам биопленки (Eun, Weibel, 2009), имеющие строго определенную геометрическую форму. В ряде последних публикаций наблюдается тенденция к переходу от работы с миллиардами клеток к использованию единичных, индивидуальных клеток микроорганизмов (Song et al., 2005), организованных в виде искусственных многоклеточных кластеров (Gupta et al., 2008; Gupta et al., 2010; Regot et al., 2011). Таким образом, функционализация клеток микроорганизмов, то есть контролируемое придание клеткам новых
функциональных возможностей, и создание биоаналитических устройств и упорядоченных многоклеточных кластеров является одним из наиболее перспективных направлений на стыке микробиологии, физической и коллоидной химии, нанотехнологии и биоэлектроники.
В соответствии с вышеизложенным были определены цель и задачи настоящего исследования.
Целью работы стала разработка методологических основ функционализации клеток микроорганизмов с помощью модификации поверхности микробных клеток полимерными нанопленками и наночастицами различной природы и формирования на их основе гибридных биоаналитических систем и упорядоченных многоклеточных кластеров. Основные задачи исследования:
1.Разработка биосовместимых методов функционализации клеток микроорганизмов при помощи многослойных пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами золота, серебра, оксида железа и углеродными нанотрубками.
2.Биоимитирующая микроинкапсуляция клеток микроорганизмов при помощи мезопористых неорганических микрооболочек из карбоната кальция.
3.Разработка методов пробоподготовки образцов микроорганизмов для их характеристики при помощи поверхностно-усиленной спектроскопии комбинацинного рассеяния (Рамановской спектроскопии).
4. Определение возможности использования функционализированных клеток микроорганизмов в качестве биорецепторных элементов электрохимических биосенсоров и микрофлюидных аналитических устройств.
5.Оценка эффективности использования функционализированных клеток-биорепортеров в анализе токсичности жидких сред.
6.Конструирование трехмерных многоклеточных кластеров определенной геометрии с использованием функционализированных клеток микроорганизмов и неорганических темплатов.
Научная новизна и значимость работы. Разработан универсальный метод функционализации клеток микроорганизмов при помощи функциональных наночастиц, включенных в состав многослойных пленок полиэлектролитов, позволяющий сохранить жизнеспособность клеток. Показано сохранение жизнеспособности и ферментативной активности в функционализированных клетках. Установлено, что некоторые аспекты жизнедеятельности и биохимического состава функционализированных клеток могут быть изучены с использованием спектроскопических и электрохимических методов.
Впервые показан феномен образования микрооболочек из карбоната кальция (фатерита) на поверхности клеток микроорганизмов в процессе копреципитации ионов CaZT и СО» в водной среде без утраты жизнеспособности инкапсулированных клеток.
Установлено, что функционализация клеток микроорганизмов при помощи биосовместимых полимер-стабилизированных магнитных наночастиц не оказывает ингибирующего воздействия на генотоксин-обусловленный синтез зеленого флуоресцентного белка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и люциферазы в бактериях Acinetobacter baylyi, а также на процесс фотосинтеза в одноклеточных водорослях Chlorella pyrenoidosa.
Впервые были получены и охарактеризованы стабильные трехмерные многоклеточные кластеры (названные нами цитозомами), представляющие собой гибридные коллоидные микрочастицы, состоящие из живых клеток дрожжей, включенных в микроскопические полиэлектролитные полые капсулы с определенной и контролируемой геометрической структурой. Морфологическое сходство цитозом с некоторыми примитивными колониальными и многоклеточными организмами, а также простота и широкая распространенность в природе частиц, подобных использованным нами темплатам (микрокристаллы и микропузырьки воздуха) дает основание предполагать, что аналогичный процесс мог иметь место в эволюционном процессе возникновения многоклеточных организмов.
Практическая значимость работы. Разработан метод иммобилизации широкого спектра наноматериалов на поверхности клеточных стенок микроорганизмов (Патент РФ № 2377310). На основе данного метода разработаны электрохимические биосенсоры для определения общей токсичности среды и гербицидов триазинового ряда с использованием функционализированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и одноклеточных водорослей Chlorella pyrenoidosa. Впервые разработана методика пробоподготовки образцов микроорганизмов путем послойной функционализации единичных клеток с помощью полимерных пленок и наночастиц благородных металлов для их идентификации при помощи Рамановской спектроскопии.
Разработана эффективная методика синтеза стабильных гидрофильных биосовместимых наночастиц (средний диаметр 15 нм) оксида железа. С использованием данных наночастиц в качестве модификаторов поверхности клеток были впервые созданы микрофлюидные биоаналитические устройства для анализа генотоксичности (на основе магнитно-модифицированных клеток дрожжей GreenScreen) и магнитно-модифицированные клетки-биорепортеры для анализа широкого спектра токсикантов (салициловая кислота, толуол, алканы с различной длиной углеродной цепи) на основе штаммов бактерий Acinetobacter baylyi (заявка на Патент Китайской Народной Республики № ZL201010513790.5).
Разработанная методика контролируемого нанесения клеток на поверхности коллоидных частиц позволит оптимизировать методические подходы в создании биологических микрореакторов, а также в тканевой инженерии.
Материалы диссертации используются в лекционных курсах «Основы бионанотехнологии» и «Философские вопросы в биологии» биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета; "Topics in Physical Chemistry" химического отделения университета г. Халл (University of Hull, United Kingdom) и учебном курсе «Основы биологической химии» для студентов специальности «Химическая технология пищевых добавок и косметических средств» в Национальном университете «Львівська Політехніка», Львов, Украина.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанный метод функционализации клеток микроорганизмов, основанный на послойном нанесении тонких пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами золота, серебра, оксида железа и углеродными нанотрубками, применим для создания новых биоимитирующих систем.
Реакция соосаждения ионов СО и Са из растовора в присутствии клеток микроорганизмов приводит к образованию мезопористых неорганических микрооболочек из карбоната кальция на клеточных стенках.
Модификация поверхности микробных клеток функциональными наночастицами (наночастицы благородных металлов, оксида железа, углеродные нанотрубки) позволяет осуществлять характеристику микроорганизмов методом поверхностно-усиленной Рамановской спектроскопии и использовать их в качестве биорецепторных элементов в микрофлюидных и электрохимических биоаналитических устройствах.
Микроорганизмы и неорганические темплаты, модифицированные при помощи многослойных полиэлектролитных пленок, образуют трехмерные многоклеточные кластеры (цитозомы), воспроизводящие геометрическую форму темплата и являющиеся гипотетической моделью первичных колониальных микроорганизмов.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены и обсуждены на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2008-2010 гг.); II и IV международных конференциях «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2008, 2010); II международной научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2008); XII и XIV международных научных молодежных школах "Когерентная оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2008, 2010); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); всероссийской школе для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010, пленарный доклад), 2nd Saint - Petersburg international conference of NanoBioTechnologies «NanoBio'08» (С.-Петербург, 2008); VIII научной конференции научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2008); XIII всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Казань, 2009); Annual Materials Research Society Fall Meeting (Boston, USA, 2009); XIII международной конференции «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009); 13th Annual European Symposium «SymBioSE 2009: «Biology: Expansion of Borders» (Kazan, 2009); 14l UK Polymer Colloids Forum Annual Meeting (Hull, United Kingdom, 2009); V Міжнародна конференція"Біологія: від молекули до біосфери" (Харьків, Україна, 2010, пленарный доклад); Ist International Conference of Young Scientists "Chemistry and Chemical Technology" (Lviv, Ukraine, 2010, приглашенный доклад); 14і International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Groningen, The Netherlands, 2010).
Место выполнения работы и личный вклад соискателя. Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала базируются на результатах собственных исследований автора. Личный вклад автора состоял в планировании и проведении исследований, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов, их оформлении для публикаций. Экспериментальные данные были получены автором за время работы на кафедрах биохимии и микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Эксперименты по характеристике
клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии и Рамановской микроскопии проведены в лаборатории др-а М. Чулха на кафедре генетики и биоинженерии университета Йедитепе (Yeditepe Universitese, Стамбул, Турция). Исследования по созданию цитозом и синтезу магнитных наночастиц проведены в лаборатории др-а В. Паунова на кафедре химии университета г. Халл (University of Hull, Халл, Великобритания). Исследования по магнитной функционализации и характеристике бактериальный биорепортерных клеток осуществлены в лаборатории экологической микробиологии др-а В. Хуанга в Исследовательском институте Крото университета г. Шеффилд (University of Sheffield, Шеффилд, Великобритания).
Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с темами НИР Казанского (Приволжского) федерального университета: «Механизмы регуляции функциональной активности клетки» и «Исследование биомакромолекул, участвующих в регуляции метаболизма животных и растительных клеток. Разработка нанотехнологических методов определения компонентов». Исследования выполнены при поддержке грантов Правительства Республики Татарстан «Алгарыш» (2006, 2008), Академии наук Республики Татарстан №14/15 (Г)-2009 и РФФИ № 09-04-05079-6, а также персональных стипендий университетов г. Халл, Великобритания (2009, 2010), г. Шеффилд, Великобритания (2010) и универститета Йедитепе, Стамбул, Турция (2007, 2008, 2009).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 49 печатных работ, 18 из которых представлены в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Получен патент Российской Федерации и подана заявка на патент Китайской Народной Республики. Также опубликованы: глава в учебно-методическом пособии, 4 статьи в сборниках материалов конференций и 24 тезиса докладов научных конференций.
Объем и структура диссертационной работы. Работа изложена на 340 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 133 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав, где описаны и обсуждены результаты исследований, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 400 источников и приложения.
Биоимитирующие системы на основе клеток микроорганизмов
Эмульсификация приводит к образованию микрокапсул, имеющих большой разброс размеров, кроме того, не всегда удается обеспечить одинаковую плотность заполнения гелевого носителя клетками. Оптимизировать инкапсуляцию клеток позволяют микрофлюидные устройства (Zeringue et al., 2004), в которых раствор биополимера поступает в микроканальную систему, где происходит контролируемое смешивание реагентов, что позволяет регулировать диаметр микрокапсул и даже количество клеток, находящихся в каждой из них. Например, были получены микрокапсулы из агарозы с диаметром 50-110 мкм, содержащие в своем составе клетки дрожжей (Luo et al., 2007). Аналогичные методы были использованы при создании эмульсий, стабилизированных живыми клетками Acinetobacter venetianus, когда клеточные суспензии вводили при помощи микропипеток в гексадекан (Loredana et al., 2004). Также были описаны и более сложные системы для получения микрокапсул, позволяющие инкапсулировать клетки дрожжей S. cerevisiae и бактерий Oenococcas оепі в альгинатные сферические микрокапсулы, покрытые, в свою очередь, оболочкой из оксида кремния. Функция неорганического слоя на поверхности микрокапсул заключалась в повышении их механической стабильности и предотвращении спонтанного удаления клеток из микрокапсул. Авторам удалось, используя проточно-инжекторную систему, получить практически монодисперсные микрокапсулы со средним диаметром около 450 мкм, в которых клетки дрожжей и бактерий сохраняли ферментативную активность (Callone et al., 2008).
Методология и функциональные преимущества необратимой иммобилизации микробных клеток как компонентов биотехнологических установок описаны в ряде работ (Cassidy et al., 1996; Leenen et al., 1996). Принципиальным отличием такой иммобилизации является ее неизбирательность и формирование множественных слоев клеток на относительно больших площадях. Такой подход к иммобилизации клеток оправдан при конструировании биореакторов и т.п. установок в пищевой промышленности, оперирующих значительными производственными объемами, однако для создания микрофлюидных микробных биосенсоров такая иммобилизация клеток неприменима. В настоящее время существует значительное количество микроаналитических устройств, основанных на контролируемой иммобилизации клеток микроорганизмов. Такие устройства используются для анализа экспрессии генов (Van Dyk et al., 2001; Kuang et al., 2004), оценки содержания различных химических веществ в образцах почв или сточных вод (Mbeunkui et al., 2002), а также для детекции токсичных веществ (Brogan et al., 2005; Lee et al., 2005). Основным преимуществом этих сенсорных устройств является низкая стоимость и возможность масштабного культивирования микроорганизмов (Belkin, 2003). Технологически более сложным направлением является контролируемая иммобилизация микробных клеток, позволяющая формировать клеточные монослои на неоднородных поверхностях со сложным узором нанесения. Одним из наиболее перспективных материалов для иммобилизации микроорганизмов как элементов биологических сенсоров являются золотые электроды и пластинки (Jenkins et al., 2004; Oh et al., 2004; Mantzila et al., 2008), так как именно золото часто используется в сенсорных элементах электрохимических и иных биоаналитических устройств. Существует несколько методических подходов к формированию сложных узоров из живых клеток, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Необходимо отметить, что выбор техники «фигурной» иммобилизации клеток микроорганизмов зависит как от биологических свойств клеток, так и от природы функционализируемой клетками поверхности.
Один из методов упорядоченного нанесения клеток бактерий Salmonella enterica заключался в нанесении на кремниевые и золотые подложки, модифицированные при помощи искусственно созданного узора, полимеров, к которым были присоединены антитела к фимбриям S. enterica (антигенам фактора колонизации), позволяющие иммобилизовать бактерии. Узор в виде логотипа университета штата Монтана (United States) был нанесен при помощи электронной литографии (Рис. I.2.). После помещения в питательную среду, клетки постепенно заполняли всю поверхность узора, практически не мигрируя за его пределы. Используя микроскопические наблюдения, авторам удалось показать процесс деления и заполнения субстрата клетками in situ. Было отмечено, что клетки могут самопроизвольно менять свою пространственную ориентацию при постепенном заполнении всей доступной площади (Suo et al., 2008). Учитывая высокую специфичность антител, авторам удалось применить данный метод и в разделении клеточных суспензий, состоящих из нескольких видов микроорганизмов (Suo et al., 2008).
Динамическое светорассеяние (ДСР) для определения размеров и поверхностного потенциала ( -потенциала) клеток и частиц
Другой важной областью применения метода послойного нанесения полиэлектролитов является функционализация и инкапсуляция объемных субстратов и изготовление коллоидных микроскопических капсул, состоящих из полых трехмерных полимерных пленок (An et al., 2005). Техника послойного нанесения тонких пленок для приготовления полых капсул привлекает особое внимание благодаря возможности осуществления контроля таких свойств капсул, как размер и форма, состав, размер пор, коллоидная стабильность, химия поверхностных групп и осуществляемых функций (Dai, Mohwald, 2002; Correa-Duarte, et al., 2005). Алгоритм создания таких капсул заключается в предварительном послойном нанесении полимерных электролитов на частицы носителя, так называемые ядра, которые затем разрушаются физическим или химическим путем, приводя к формированию полых трехмерных свободно-перемещаемых структур. Последовательное формирование подобных капсул позволяет вводить в их состав различные функциональные группы и элементы, тем самым позволяя создавать новый класс материалов с заданной структурой и функцией, что особенно важно для адресной доставки лекарственных препаратов и генотерапии (Johnson et al., 2006).
Методика послойного нанесения полиэлектролитов на поверхность микрочастиц с целью создания полых микрокапсул впервые была применена в 1998 году. Данная техника также основана на электростатическом взаимодействии между поликатионными и полианионными полимерами, в результате чего формируется супрамолекулярная многослойная пленка на поверхности частиц, однако в отличие от техники, предложенной Decher, в этом случае вместо планарных поверхностей используются объемные частицы разной формы (Sukhorukov et al., 1998). Процесс начинается с формирования заряда на поверхности частиц, что достигается либо в процессе синтеза частиц, либо в результате стабилизации коллоидной суспензии в растворителе. Затем на поверхность заряженного субстрата наносится монослой противоположно заряженного полимера путем инкубации частиц в насыщенном растворе полиэлектролита в течение определенного времени (от 10 до 60 мин). На следующем этапе, модифицированные частицы отделяют центрифугированием или фильтрованием и промывают в избытке растворителя для удаления излишка полиэлектролита, не связанного с поверхностью. Далее частицы помещают в раствор противоположно заряженного полиэлектролита и повторяют процедуру инкубации и отмывки. Этапы нанесения полиэлектролитов чередуют до достижения заданного количества слоев и определенного заряда на поверхности частиц (Hyde et al., 2005).
Как и для модификации планарных поверхностей, при формировании многослойных покрытий и полых капсул методом послойного нанесения используют несколько пар противоположно заряженных коммерческих полимеров, таких как полиаллиламин гидрохлорид/полистирол сульфонат (Donath et al., 1998; Lebedeva et al., 2004), полиаллиламин гидрохлорид/полипиррол (Zheng et al., 2004; Park et al., 2005), полианилин/полистирол сульфонат (Cheung et al., 1997), полидиметил-диаллиламмоний хлорид/полистирол сульфонат (Caruso et al., 2001; Mueller et al., 2005), хитозан/полистирол сульфонат (Nolte et al., 2004). Изучение влияния распределения заряда полиэлектролита на рост полиэлектролитных пленок в процессе их послойного нанесения из водных растворов показало, что величина плотности электростатического заряда является важным условием для получения стабильных многослойных пленок в воде (Glinel et al., 2002). Другим важным условием при выборе полиэлектролитов для формирования полых капсул является сохранение проницаемости полученных капсул.
Разнообразные частицы могут быть использованы в качестве темплатов - основ для создания оболочек или полых капсул. Например сферические частицы меламинформальдегида были использованы для конструирования полых капсул путем чередующегося нанесения полиаллиламин гидрохлорида и полистирол сульфоната (Donath et al., 2002). Формирование капсул заключалось в следующем: на поверхность монодисперсных коллоидных частиц меламинформальдегида поэтапно наносили полиэлектролитные монослои из насыщенных водных растворов, а затем растворяли частицы, уменьшая кислотность суспензии до рН 1,6. Схематическое изображение процесса показано на Рис. 1.14. Полученные таким образом полиэлектролитные капсулы были охарактеризованы с помощью сканирующего электронного микроскопа (Рис. 1.14). На электронных микрофотографиях видны многочисленные складки и неровности на поверхности капсул, что может быть обусловлено высушиванием образца при подготовке для электронной микроскопии. Средний диаметр полых микрокапсул (4 мкм) несколько больше диаметра частиц субстрата (3 мкм), что связано с действием сил отталкивания, возникающих между одноименно заряженными полиэлектролитами в процессе формирования капсул (Donath et al., 1998).
Функционализация клеточных стенок микроорганизмов полиэлектролит-стабилизированными наночастицами оксида железа (биосовместимым магнитными наночастицами)
На первом этапе на поверхность клеток наносили необходимое количество полимерных пленок (например PAH/PSS/PAH или PAH/PSS/PAH/PSS). Затем, для включения наноструктур в состав пленок на поверхности клеток, в суспензию, содержащую наноматериалы (золотые и серебряные наночастицы, магнитные наночастицы или углеродные нанотрубки), вносили определенный объем суспензии клеток, модифицированных таким образом, чтобы поверхностный заряд отличался по знаку от поверхностного заряда наночастиц (нанотрубок). После чего клетки инкубировали при постоянном встряхивании, отмывали от несвязавшихся наночастиц. На следующем этапе, клетки, модифицированные нанопленками полиэлектролитов и наночастицами (нанотрубками), покрывали дополнительно полимерными бислоями для эффективного закрепления наноматериалов на поверхности клеток. В ряде экспериментов, были использованы флуоресцентно-меченые полиэлектролиты для визуализации полимерных пленок. При использовании магнитных наночастиц, отделение клеток от среды в процессе отмывки и нанесения дополнительных слоев полиэлектролитов осуществляли при помощи постоянного магнита.
Были использованы суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, стабилизированные РАН. Процедура модификации клеток этими наночастицами значительно упрощена в связи с уменьшением количества циклов, «нанесение-инкубация-отмывка». Использовали два типа суспензий наночастиц, когда: 1) водный раствор содержал высокую концентрацию свободного РАН и 2) магнитные наночастицы были предварительно отмыты от свободного РАН. Для нанесения наночастиц, 100-300 мкл клеток вносили в 1 мл суспензии наночастиц, интенсивно встряхивали и инкубировали 5-10 мин, после чего отделяли от неприсоединившихся НЧ и жидкой среды при помощи магнита, а затем отмывали. В ряде случаев были использованы наночастицы, стабилизированные флуоресцентно-меченым РАН для визуализации пленок.
Для инкапсуляции клеток микроорганизмов в микрооболочки из карбоната кальция нами была разработана методика копреципитации ионов Са2+ и СОз2" в присутствии клеток дрожжей и микроскопических одноклеточных водорослей. Для инкапсуляции предварительно отмытую суспензию клеток дрожжей (100 мкл, 109кл/мл) добавляли в 0,33 М водный раствор СаСЬ. В данный раствор добавляли эквимолярный раствор Na2C03, смешивали растворы солей и инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 5 мин. В растворе наблюдалось помутнение, вызванное образованием белой взвеси нерастворимого СаСОз- Осадок отделяли фильтрованием на нейлоновых или бумажных фильтрах, промывали и высушивали при комнатной температуре. Инкапсулированные клетки хранили в виде порошка при 4 С.
Кристаллическую структуру микрооболочек изучали при помощи метода рентгенструктуроного анализа и оптической микроскопии в поляризованном свете. Структуру и линейные размеры гибридной системы «микрооболочкиЪкивые клетки» (в сравнении с интактными клетками) изучали при помощи оптической и сканирующей электронной микроскопии. Жизнеспособность клеток, инкапсулированных в микрооболочки из карбоната кальция, определяли при помощи ФДА.
Магнитная модификация дрожжей GreenScreen была осуществлена в соответствии с описанной ранее методикой. Использовали микрофлюидные чипы, сконструированные по схемам «стекло на стекле» и «полидиметилсилоксан (ПДМС) на стекле». В основу рабочего дизайна микрочипов был заложен принцип многоградинетного потока. Схема расположения каналов микрочипов была изготовлена с использованием компьютерной программы auto-CAD, затем был осуществлен перенос узора микрочипа на пленку-шаблон («маску») (J. D. PhotoTools, Oldham, UK). Стеклянные пластинки, несущие на своей поверхности слой хрома и фоточувствительную пленку (Telic Co., СА, United States), покрывали пленкой-шаблоном и облучали ультрафиолетом для переноса узора микроканалов на поверхность пластинок. Следующим этапом осуществляли обработку («проявление») фоточувствительной пластинки и удаление слоя хрома при помощи специального раствора для удаления хрома (Rohm-Haas Ltd., United Kingdom). Затем осуществляли формирование микроканалов,
Модификация поверхностей живых микробных клеток при помощи многослойных пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами и нанотрубками
Для более детальной характеристики многослойных композитных пленок на поверхности клеток дрожжей в работе были применены методы просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии.
На микрофотографиях тонких срезов клеток (Рис. IV.14.), полученных с использованием ПЭМ , видно, что гладкая и ровная поверхность клеточной стенки дрожжей после нанесения на ее поверхность полиэлектролитных слоев и многостенных углеродных нанотрубок приобретает «ворсистый» вид по причине упорядоченного нанесения длинных нитей углеродных нанотрубок на поверхность клеток. По данным ПЭМ было установлено, что толщина многослойной пленки, содержащей углеродные нанотрубки, составляет около 80 нм, при этом на микрофотографиях можно обнаружить и более тонкие участки с толщиной 20-30 нм, и значительно более широкие участки с толщиной 200 нм, что связано со спонтанным формированием агрегатов («узлов») из углеродных нанотрубок. На микрофотографиях тонких срезов поверхности клеточных стенок модифицированных клеток видны как единичные углеродные нанотрубки, так и их агрегаты, образующиеся вследствие иммобилизации в полиэлектролитной матрице изначально агрегированных углеродных нанотрубок, либо непосредственно из неагрегированных нанотрубок в процессе модификации. При детальном изучении ПЭМ-микрофотографий установлено, что нанотрубки ориентированы на поверхности модифицированных клеток хаотично: некоторые из них достаточно плотно прилегают к клеточным стенкам, тогда как другие прикреплены к поверхности лишь частично, и направлены наружу, придавая «ворсистый» внешний вид модифицированным клеткам.
Как и в случае с другими видами наноматериалов, можно предположить, что полиэлектролитные многослойные пленки обеспечивают эффективное присоединение многослойных углеродных нанотрубок к поверхности клеток, не препятствуя при этом проникновению низкомолекулярных веществ внутрь клетки.
Далее структура многослойной пленки, содержащей углеродные нанотрубки, была охарактеризована при помощи сканирующей электронной микроскопии. Этот метод позволяет получить изображения ненарушенных в процессе микротомирования композитных пленок, так как процедура подготовки образца для СЭМ не предусматривает механического воздействия на клетки. Было установлено, что иммобилизация многослойных углеродных нанотрубок приводит к формированию однородного, равномерного покрытия из нанотрубок и пленок на поверхности дрожжей, которое четко видно при сравнении изображений интактных и модифицированных клеток. позволяет различить длинные волокна углеродных нанотрубок, относительно неплотно прилегающих к клеточной стенке дрожжей, как и на микрофотографиях, полученных при помощи ПЭМ. Опираясь на данные литературы (Berry et al., 2004; Berry, Saraf, 2005), можно предположить, что подобные частично прикрепленные и потому находящиеся на некотором расстоянии от клеток углеродные нанотрубки могут быть использованы в качестве1 микроконтактов («проводящих мостиков») между клетками и каким-либо источником электрического тока в микроэлектронньгхустройствах(Weibeletah, 2007). Таким образом, с использованием дрожжей S. cerevisiae в качестве модельного объекта был впервые продемонстрирован универсальный метод иммобилизации наноматериалов на поверхности клеток микроорганизмов.
Разработка метода поверхностной модификации дрожжей с использованием различных наноматериалов и техники послойного нанесения полиэлектролитов позволила нам провести аналогичные эксперименты с использованием бактерий. В работе были использованы бактерии трех видов, отличающиеся по форме и биохимическому составу клеточной стенки, а именно грамположительный вид S. cohnii и грамотрицательные виды Е. coli и A. baylyi. Модификацию поверхностей клеточных стенок бактерий осуществлялся следуя вышеописанной схеме -последовательное нанесение нескольких слоев полиэлектролитов, сопровождаемое включением наночастиц благородных металлов в состав композитных пленок и последующее закрепление наночастиц на поверхности клеток при помощи внешних полиэлектролитных слоев. показано, что изначально слабоокрашенные суспензии бактерий, также как и пекарские дрожжи, изменяют цвет после нанесения наночастиц на их поверхность. Однако методом оптической микроскопии, даже при максимальном увеличении объектива с высокой числовой апертурой (100х, ч.а. 1,4) определить какие либо различия между интактными и наномодифицированными клетками бактерий не представлялось возможным. Это связано с малыми размерами бактерий, которые позволяют визуализировать силуэты клеток, но не дают возможности различить их реальную окраску.
Тем не менее, окраска суспензий модифицированных клеток соответствует окраске наночастиц, которыми данные клетки были модифицированы, что позволяет предположить, что исключительно оптические ограничения в световом микроскопе проходящего света не позволяют визуализировать изменение окраски наномодифицированных бактерий. Однако с применением микроскопии отраженного света это препятствие можно преодолеть. Известно, что наночастицы благородных металлов обладают свойством эффективно рассеивать, и отражать свет (Е1-Sayed et al., 2005; Jain et al., 2008). При этом высушивание наночастиц и нанопленок на поверхности клеток приводит к образованию агрегатов наночастиц, которые также способны отражать видимый свет. Благодаря этой способности, высушенные образцы бактерий, модифицированных полиэлектролитными пленками и наночастицами, приобретали характерный для агрегированных наночастиц металлический блеск (Рис. IV.15. (а) и (Ь)) и могли быть эффективно визуализированы под объективом микроскопа отраженного света. На микрофотографии видно, что " клетки, модифицированные полимерными пленками и золотыми наночастицами, приобретают характерный для микроскопических кластеров золота желтый металлический блеск. Также можно заметить, что модифицированные бактерии образуют меньшее количество многоклеточных агрегатов по сравнению с интактными клетками, и эти агрегаты несколько меньше по размерам. Такое поведение наномодифицированных клеток можно объяснить взаимным электростатическим отталкиванием полиэлектролит-инкапсулированных клеток. В результате такие слабо агрегированные клетки значительно легче локализовать под микроскопом и, соответственно, изучать как отдельные клетки, так и клеточные агрегаты.
