Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Иммобилизация наночастиц на поверхность живых клеток 12
1.1.1. Непосредственная иммобилизация наночастиц 12
1.1.2. Взаимодействие живых клеток с многослойными полимерными пленками 17
1.1.3. Полимер-опосредованная иммобилизация наноматериалов на поверхность клеток 1.2. Взаимодействие Caenorhabditis elegans с наноматериалами 26
1.3. Токсическое влияние серебряных наночастиц на организм Caenorhabditis elegans 29
1.4. Взаимодействие нематод с бактериями 33
1.5. Антибактериальное действие серебряных наночастиц 35
1.6. Взаимодействие бактерий с магнитными наночастицами 38
1.7. Общая характеристика нанотрубок галлуазита и их использование в биотехнологии 39
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Реактивы 45
2.2. Расходные материалы 45
2.3. Оборудование 46
2.4. Объекты исследования и их подготовка 47
2.5. Методы исследования
2.5.1. Синтез полиаллиламин гидрохлорид-стабилизированных магнитных наночастиц оксида железа 47
2.5.2. Определение концентрации магнитных наночастиц спектрофотометрическим методом 49
2.5.3. Синтез цитрат-стабилизированных серебряных наночастиц 50
2.5.4. Характеристика наноматериалов 51
2.5.5. Культивирование микроорганизмов 54
2.5.6. Модификация клеточной стенки микроорганизмов наночастицами и полимерными пленками з
2.5.7. Оптическая микроскопия в режиме светлого поля и флуоресценции 59
2.5.8. Темнопольная микроскопия 59
2.5.9. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
2.5.10. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) 61
2.5.11. Оценка жизнеспособности наномодифицированных клеток 62
2.5.12. Культивирование нематоды С. elegans 64
2.5.13. Подготовка пищевого субстрата для нематод 65
2.5.14. Получение синхронной культуры нематод 66
2.5.15. Растворы для поддержания культуры C.elegans 67
2.5.16. Оценка влияния наномодифицированных бактерий и наночастиц на рост нематод 68
2.5.17. Оценка влияния наномодифицированных бактерий на размножение нематод 69
2.5.18. Статистическая обработка данных 69
2.5.19. Процедура загрузки бриллиантового зеленого 71
2.5.20. Формирование нанопокрытия из комплекса бензотриазол-медь на поверхности галлуазита 72
2.5.21. Динамика высвобождения бриллиантового зеленого из нанотрубок галлуазита 74
2.5.22. Термогравиметрический анализ 75
2.5.23. Оценка жизнеспособности Staphilococcus aureus 76
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 77
3.1. Характеристика магнитных и серебряных наночастиц 77
3.2. Модификация клеточной поверхности микроорганизмов магнитными и серебряными наночастицами 80
3.3. Характеристика распределения наноматериалов на поверхности клеточных стенок микроорганизмов 82
3.4. Характеристика жизнеспособности наномодифицированных клеток 89
3.5. Характеристика нанотрубок галлузита 94
3.6. Изучение кинетики высвобождения бриллиантового зеленого из просвета нанотрубок галлуазита 95
3.7. Оценка цитотоксического эффекта нанотрубок галлуазита 104
3.8. Токсическое влияние наномодифицированных клеток микроорганизмов на нематоду С. elegans 108
Выводы 119
Список сокращений и условных обозначений 120
Список литературы
- Непосредственная иммобилизация наночастиц
- Объекты исследования и их подготовка
- Подготовка пищевого субстрата для нематод
- Модификация клеточной поверхности микроорганизмов магнитными и серебряными наночастицами
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последнее время значительное внимание уделяется развитию и перспективам бионанотехнологий и возможностям их применения в различных отраслях человеческой деятельности. Установлено, что свойства наноматериалов принципиально отличаются от свойств более крупных частиц того же химического состава. В связи с этим, оценка безопасности наноматериалов должна стать приоритетным направлением (Schmid, Journal of Occupational and Environmental Hygiene, 2010). Это связано, прежде всего, с ожидаемой повсеместной распространенностью этих материалов и вероятностью воздействия на организм человека, как при непосредственном контакте, так и при проникновении через окружающую среду.
Нанотехнологии обещают большие возможности для разработки новых гибридных материалов, которые содержат в своем составе компоненты органической и неорганической природы. В качестве органического компонента зачастую используют живые клетки микроорганизмов, которые являются чувствительным элементом для оценки токсического влияния различных веществ и материалов. Так, например, клетки микроорганизмов, обладающие чувствительностью к гербицидам и генотоксинам, могут служить чувствительными компонентами электрохимических биосенсоров и микрофлюидных чипов для определения гербицидов и генотоксинов. Иммобилизация неорганических наноматериалов (углеродных нанотрубок и магнитных наночастиц оксида железа) на клеточную стенку таких микроорганизмов позволяет усилить электрохимический сигнал сенсоров (Zamaleeva, Analytical Methods, 2011), а также временно зафиксировать клетки в камерах микрофлюидных устройств (Zhang, Microbial Biotechnology, 2011). В последние годы внимание исследователей привлек глинистый минерал – галлуазит, который представляет собой многослойные нанотрубки с диаметром просвета около 50 нм. Биологическая совместимость и достаточно широкий просвет нанотрубок представляют идеальное сочетание для создания наноконтейнеров для хранения биологически активных веществ, таких как ферменты и антисептики, с функцией медленного высвобождения (Lvov, Progress in Polymer Science, 2013). Такие гибридные материалы могут служить основой для создания антисептических покрытий и наполнителей для лакокрасочной продукции, основным свойством которой является предотвращение роста плесневых грибов и бактериальных колоний (Abdullayev, Journal of Materials Chemistry, 2010; Levis, International journal of pharmaceutics, 2003).
На сегодняшний день опубликованы результаты исследований по изучению токсического влияния наноматериалов с использованием клеток микроорганизмов и культур клеток человека и животных, однако практически отсутствуют данные о влиянии наноматериалов на высокоразвитые многоклеточные организмы. Наноматериалы, попавшие в окружающую среду, в первую очередь взаимодействуют с одноклеточными микроорганизмами, которые являются одним их первых звеньев в пищевой цепи. Далее наноматериалы аккумулируются в организме консументов первого и второго порядка.
Таким образом, актуальным является разработка комплексного подхода для оценки токсического влияния наноматериалов на различных уровнях организации живого (клеточном и организменном).
Цель настоящей работы – разработать систему оценки токсичности нанотрубок галлуазита, серебряных и магнитных наночастиц и выявить их токсические эффекты по отношению к прокариотам и эукариотам.
Основные задачи исследования:
1. Определить характер взаимодействия серебряных и магнитных наночастиц с клеточной стенкой бактерий (Escherichia coli), дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) и микроскопических водорослей (Chlorella pyrenoidosa).
2. Исследовать влияние наноматериалов на жизнеспособность модифицированных клеток.
3. Выявить оптимальные условия для формирования функционального материала с пролонгированным антисептическим действием на основе нанотрубок галлуазита и бриллиантового зеленого.
4. Исследовать токсическое влияние функциональных наноматериалов на основе нанотрубок галлуазита с потенциальным антибактериальным свойством на клетки грамположительных бактерий S. aureus.
5. Установить характер влияния модифицированных клеток микроорганизмов на нематоду Caenorhabditis elegans.
Научная новизна
В работе впервые предложен универсальный метод оценки токсического влияния магнитных и серебряных наночастиц с использованием свободноживущей почвенной нематоды C. elegans путем доставки наноматериалов в организм нематод посредствам их иммобилизации на поверхности клеток микроорганизмов.
Показано, что наноматериалы аккумулируются в пищеварительном тракте C. elegans и оказывают значительное влияние на жизненные показатели нематод (рост, репродуктивный потенциал) в зависимости от природы исследуемого наноматериала.
Впервые были получены и охарактеризованы гибридные системы на основе нанотрубок галлуазита и антисептика бриллиантового зеленого. Были продемонстрированы антибактериальные свойства функциональных нанотрубок галлуазита и длительное выделение активного антисептика из просвета нанотрубок.
Практическая значимость
Разработанный метод оценки токсического влияния наноматериалов с использованием клеток микроорганизмов и многоклеточных организмов является дешевым, и поэтому может быть использован в качестве стандартного метода для тестирования биологической безопасности вновь полученных наноматериалов в производственных лабораториях.
Гибридные системы с антибактериальным действием на основе нанотрубок галлуазита могут быть использованы в качестве активного компонента для создания антисептических повязок, которые найдут свое применение в раневой хирургии и покрытий с антибактериальными свойствами.
Положения, выносимые на защиту:
-
Полиаллиламин-стабилизированные магнитные наночастицы и многослойные полимерные пленки, содержащие цитрат-стабилизированные серебряные наночастицы, задерживают активное клеточное деление, но незначительно влияют на эстеразную активность бактерий E. coli и дрожжей S. cerevisiae и фотосинтетическую способность водорослей C. pyrenoidosa.
-
Инкапсуляция антисептика бриллиантового зеленого в просвете нанотрубок галлуазита увеличивает время его полного высвобождения и повышает эффективность антисептического действия по отношению к грамположительным бактериям.
-
Использование наномодифицированных клеток-носителей, несущих на своей поверхности магнитные и серебряные наночастицы, позволяет осуществлять контролируемую доставку наноматериалов в организм многоклеточного модельного организма нематоды C. elegans. При этом серебряные наночастицы оказывают ингибирующий эффект на рост и размножение нематод, в то время как магнитные наночастицы являются биосовместимыми.
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены на X научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2011), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия» (Воронеж, 2011), Всероссийском конкурсе НИР студентов и аспирантов в области химических наук и наук о материалах в рамках Всероссийского фестиваля науки (Казань, 2011), конкурсе научных работ студентов и аспирантов им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2012), конференции молодых ученых «Молодежь и инновации Татарстана» (Казань, 2012), Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012), VI международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2012), 17-ой международной Пущинская школе-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2013), VI всероссийском с международным участием конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз - Россия» (Иркутск, 2013), II Международной научной конференции для молодых ученых, студентов и школьников «Наноматериалы и нанотехнологии: проблемы и перспективы» (Саратов, 2013).
Связь работы с научными программами. Работа была поддержана молодежным грантом РФФИ «Мой первый грант» (№ 12-04-32054 мол_а) и международным грантом РФФИ (№ 12-03-93939- G8_а), а также стипендией президента Российской Федерации на обучение за рубежом (приказ № 539 от 17.07.2012).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, включает 45 рисунков и 9 таблиц. Библиография включает 179 источников.
Непосредственная иммобилизация наночастиц
Одним из самых простых способов направленной модификации поверхностных клеточных структур является электростатическое осаждение катионных наночастиц на клетки с отрицательным поверхностным зарядом. Berry с соавт. (Berry et al., 2004) продемонстрировали осаждение золотых наночастиц на поверхность грамположительных бактерий Bacillus cereus (3-5 мкм в длину и 0.9 мкм в диаметре). Процесс осаждения был основан на взаимодействии полилизин-стабилизированных золотых наночастиц с диаметром 30 нм с отрицательно заряженной клеточной стенкой бактерий. Описанная процедура включала несколько этапов. Сначала клетки иммобилизовали на субстрат, покрытый слоем полилизина, затем промывали раствором щелочи для того чтобы очистить клеточную стенку бактерий от поверхностных белков и открыть доступ к отрицательно заряженным пептидогликанам. Затем иммобилизованные клетки инкубировали в растворе полилизин-стабилизированных наночастиц в течение 12 часов. В связи с тем, что бактерии были иммобилизованы на субстрате, покрытом полилизином, связывания золотых наночастиц с одноименно заряженной поверхностью не происходило. Такие гибридные системы из клеток и золотых наночастиц образовывали проводящие микромостики между золотыми электродами. Сродство полилизин-стабилизированных наночастиц к клеточной стенке бактерий авторы объяснили наличием в структуре последней тейхоевых кислот, связанных пептидогликаном (Berry, Saraf, 2005). Позднее подобный подход был применен для модификации клеточной стенки В. cereus с использованием Аи НЧ, стабилизированных цетилтриметиламоний бромидом (СТАВ) - (Berry et al., 2005). Являясь эффективным стабилизатором наночастиц, СТАВ образует бислой на поверхности Аи НЧ, придавая им положительный поверхностный заряд в широком диапазоне рН. Это позволяет непосредственно присоединить наночастицы на клеточную поверхность.
Rosi с соавт. продемонстрировали ДНК-опосредованную иммобилизацию Аи НЧ на поверхность диатомовых водорослей рода Navicula и Synedra. Клетки предварительно обрабатывали кислотной смесью "Пиранья" для того, чтобы растворить органические компоненты их клеточной стенки. Затем на клеточную стенку наносили слой аминопропилтриметоксиксилана, чтобы функционализировать поверхность клеток аминогруппами. Клетки водорослей, функционализированные аминогруппами, конъюгировали с тиоловыми олигонуклеотидами, меченными флуоресцентной меткой. При добавлении в среду Аи НЧ, функционализированных комплементарным олигонуклеотидами, происходила реакция преципитации наночастиц на поверхности клеток водорослей. Такая ДНК-опосредованная иммобилизация наночастиц является обратимым процессом, поскольку при увеличении температуры среды происходит дегибридизация олигонуклеотидных дуплексов с последующим отсоединением наночастиц (Rosi et al., 2004). Позднее эта же группа исследователей напылила Ті (5 нм) и Ag (30 нм) НЧ на поверхность диатомовых водорослей, в результате чего получали реплики, отражающие тонкую структуру поверхности диатомовых водорослей (Payne et al., 2005). Safarik с соавт. иммобилизовали наночастицы оксида железа, стабилизированные хлорной кислотой, на клетки дрожжей. Предварительно клетки промывались раствором уксусной кислоты для удаления экстрагируемых компонентов и усилению сродства клеточной стенки по отношению к магнитным наночастицам (Safarik et al., 2007). В качестве альтернативы на клетки дрожжей иммобилизовали магнитные наночастицы, стабилизированные гидроксидом тетраметиламмония, суспендированные в щелочном глицин-NaOH буфере (Yavuz et al., 2006). Полученные системы могут найти свое применение в качестве дешевых магнитных сорбентов для ионов тяжелых металлов (Patzak et al., 1997; Ji et al., 2010) и органических красителей (Safarikova et al, 2005; Safarik et al., 2007)
Другой способ модификации поверхностных структур клеток - синтез наночастиц in situ, например, при длительной экспозиции живых клеток бактерий в растворе, содержащем Au3+ (Kuo et al., 2008). Макромолекулы, ассоциированные с клеточной стенкой, выступают в качестве сайтов присоединения и восстановления ионов Au+. Этот метод, соответствующий подходу синтеза наночастиц "снизу вверх", приводил к образованию нанооболочек из золота толщиной 7-8 нм, окружающих живые клетки E.coli. Ранее уже описывали способность живых клеток синтезировать наночастицы, однако, в этих случаях демонстрировалось наличие наночастиц в культуральной жидкости, а не на клеточной стенке (Ahmad et al., 2003). Существует предположение о том, что ионы восстанавливаются продуктами клеточного метаболизма в непосредственной близости от клеточной стенки. Наночастицы благородных металлов синтезируются с использованием веществ, которые выполняют двойную функцию - являются одновременно и восстановителем, и стабилизатором. Примером таких веществ могут служить цитрат натрия и тетрагидроборат натрия (NaBtLt). Введение клеток микроорганизмов в реакционную смесь приводит к преимущественному осаждению наночастиц на них. Этот феномен был также показан с использованием вирусов. Вирусы намного меньше, чем клетки (диаметр около 100 нм). Вирионы бактериофага М13 помещали в растворы солей Rh +, Pd + и Rb +, затем проводили медленное восстановление этих ионов металлов при помощи NaBH4. В результате были получены удлиненные структуры, напоминающие нанопроволоку (Avery et al., 2009).
Объекты исследования и их подготовка
Галуазит обладает огромным потенциалом для применения в сфере нанобиотехнологий. Основными преимуществами галлуазита, по сравнению с другими наноматериалами, являются его дешевизна, доступность и биосовместимость.
В экспериментах с использованием клеток человека в качестве модели для изучения цитотоксических эффектов было показано, что нанотрубки галлуазита не оказывают значительного токсического влияния на нормальные клетки человека. (Kommireddy et al., 2005 Suh et al., 2011). Однако Lai с соавт. показали, что нанотрубки галлуазита провоцируют экспрессию провоспалительных цитокинов в клетках кишечника, которые ответственны за рост и пролиферацию клеток, и адаптивный ответ клеток при инфекции и повреждении клеток (Lai et al., 2013).
Возможность создания покрытий из нанотрубок галлуазита на поверхности клеток дрожжей была продемонстрирована в работе Konnova с соавт. Было отмечено, что клетки, покрытые таким способом, оставались жизнеспособными и сохраняли нормальную кинетику роста с задержкой экспоненциальной фазы роста (6 часов). Задержку активного деления дрожжей можно объяснить временем, которое необходимо для того, чтобы дочерняя клетка разрушила неорганическую оболочку (Konnova etal, 2013).
Нанотрубки галуазита показали себя как многообещающие наноконтейнеры для загрузки и хранения различных веществ с функцией медленного высвобождения. Положительно заряженная внутренняя полость нанотрубок может быть заполнена макромолекулами с отрицательным электрическим зарядом - ферментами (Shchukin et al., 2005; Zhai et al., 2010), биоцидами (Abdullayev et al., 2011; Wei et al., 2012), лекарственными веществами (Veerabadran et al., 2009; Vergaro et al., 2013), антикоррозионными веществами (Abdullayev et al., 2009; Abdullayev, Lvov, 2010; Fix et al., 2009), поверхностно-активными веществами (Cavallaro et al., 2012; Yah et al., 2012). Для загрузки внутренней полости обычно галлуазит в виде сухого порошка смешивают с насыщенным раствором выбранного вещества в воде, спирте, ацетоне или другом растворителе, смесь инкубируют в вакууме в течение определенного времени. Veerabadran с соавт. загружали нерастворимые в воде лекарственные средства (нифедипин, фуросемид, дексаметазон) и продемонстрировали длительное высвобождение этих веществ из просвета трубок (Veerabadran et al., 2007). Для замедления выхода дексаметазона из нанотрубок, авторы покрыли наполненные дексаметазоном нанотрубки, многослойной пленкой из полиэлектролитов, что позволило увеличить время выхода дексаметазона с 7 до 30 часов (Veerabadran et al., 2009).
Неорганическая природа галлуазита не позволяет использовать его в качестве субстанции для введения в кровяное русло, поэтому его использование в медицине ограничено пероральным и местным (кожным) применением, он также может быть использован при создании зубных и костных имплантатов.
Wei с соавт. загружали нанотрубки антибиотиком гентамицином и добавили их в костный цемент из полиметилметакрилата. Данная манипуляция позволила увеличить прочность костного цемента и его адгезивные свойства к кости значительно возросла, а нанотрубки обеспечили продолжительный выход гентамицина (до 300-400 ч.) (Wei et al., 2012).
Биомакромалекулы могут быть эффективно загружены в просвет нанотрубок. Так например, Zhai с соавт. загружали различные ферменты и низкомолекулярные вещества. Авторы продемонстрировали, что скорость выхода высокомолекулярных ферментов из нанотрубок значительно меньше скорости выхода более низкомолекулярных лекарственных средств. Например, время 80% выхода инсулина достигает 140 часов (Zhai et al., 2010). В целом отрицательно заряженные ферменты выходят из нанотрубок дольше, чем положительно заряженные, что объясняется положительным внутренним зарядом нанотрубок (Lvov et al., 2008а). Загрузка ферментов в нанотрубки также позволяет обеспечить их длительное хранение. Иммобилизованные в полостях нанотрубок а-амилаза и уреаза отличались повышенной термостабильностью по сравнению со свободными ферментами (Zhai et al., 2010).
Shchukin с совт. использовали нанотрубки галлуазита в качестве нанореактора для реакции биоминерализации на примере синтеза СаСОз из водного раствора, содержащего СаСЬ и мочевину. Реакцию катализировал фермент уреаза, адсорбированный на внутренних стенках трубок (Shchukin et al., 2005).
Нанотрубки, наполненные антикоррозийными ингибиторами, могут применяться для защиты металлических поверхностей от биологической и химической коррозии. Fix с соавт. продемонстрировали изящную методику создания антикоррозионных покрытий на основе геля, допированного галлуазитом, содержащим ингибитор коррозии. Было показано, что в местах механических повреждений алюминиевой пластинки нанотрубки обнажали концы или повреждались, в результате чего выделялся ингибитор коррозии, защищая металлическую поверхность (Fix et al., 2009).
При добавлении галлуазита в растворы полимеров формируются композиты с улучшенными свойствами. Композиты, содержащие галлуазит, могут отличаться более высокой скоростью кристаллизации (Ning et al., 2007), повышенной термической стабильностью (Du et al., 2006), повышенной упругостью и повышенной обратимой деформацией (Liu et al., 2008), улучшенной ударной вязкостью (Ye et al., 2007), увеличенной прочностью (Cavallaro et al., 2011; Deng et al., 2008).
Yin-Feng с соавт. присоединили к нанотрубкам галлуазита фрагменты антисмысловой РНК, которые могут связываться с мРНК генов, продукты которых ингибируют апоптоз клетки. В данных экспериментах нанотрубки проявили себя как эффективные носители для доставки терапевтических генов и могут служить системой доставки генов для генной терапии (Yin-Feng et al., 2011).
Учитывая тот факт, что галлуазит является наноматериалом природного происхождения, огромный потенциал его использования в биотехнологиях не вызывает сомнений. Однако предварительные данные о токсическом воздействии нанотрубок галлуазита на живые клетки является недостаточными и требуют дальнейших исследований.
Подготовка пищевого субстрата для нематод
Процедура загрузки нанотрубок представлена на схеме (рисунок 11). 500 мг галлуазита добавляли в 10 мл раствора бриллиантового зеленого в ацетоне (20 мг/мл), перемешивали и помещали в ультразвуковую баню на 30 минут (70 Вт), что позволяет равномерно диспергировать агрегаты трубок в растворе. Затем, помещали пробирку в вакуумную станцию на 30 минут, в результате чего воздух из просвета трубок замещался раствором антисептика. Инкубацию трубок под вакуумом повторяли 3 раза. Далее осаждали трубки центрифугированием при 5000g и промывали один раз 10 мл ацетона. На последнем этапе высушивали трубки в сушильном шкафу при 50 С. Галлуазит в концентрированном растворе Инкубация под вакуумом ооооооо- О; Высушивание Отмывка от избытков активного вещества
Свойство бензотриазола образовывать нерастворимый комплекс с ионами Си2+ было использовано для формирования тонкого пористого слоя, препятствующего высвобождению молекул бриллиантового зеленого из микропор на поверхности галлуазита, замедляя тем самым кинетику высвобождения активного вещества (Рисунок 12).
Механизм формирования комплекса бензотриазол-медь (БТА-Cu) на поверхности нанотрубок для предотвращения преждевременного высвобождения активного вещества. 1 — загрузка активного вещества при помощи вакуума 2 -высушенные трубки с активным веществом внутри 3 - обработка трубок раствором бензотриазола (БТА) 4 - обработка трубок раствором C11SO4 5 - сформированный БТА-Cu комплекс на поверхности трубок Для этого предварительно загруженные антисептиком нанотрубки инкубировались в растворе бензотриазола (БТА) в течение 10 секунд с последующим добавлением раствора CUSO4. Схематическое изображение процедуры инкапсуляции нанотрубок представлено на рисунке 13. Для контроля пористости покрытия варьировали концентрацию БТА и CuSCv
Для изучения кинетики высвобождения бриллиантового зеленого 50 мг сухого порошка нанотрубок, содержащих БЗ помещали в 1 мл дистиллированной воды и инкубировали при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. В течение первых 35 минут инкубации образцы собирали после 5, 10, 15, 25 и 35 минут. Для этого образец центрифугировали 2 минуты при llOOg, супернатант отбирали для последующего анализа и добавляли свежую порцию воды в пробирку, продолжали инкубацию до окончания следующего временного отрезка.
По истечении первых 35 минут эксперимента образцы отбирали каждый час. Общее время эксперимента составляло 6-8 часов. Для того, чтобы оценить количество загруженного вещества в трубках, после эксперимента трубки диспергировали в 10 мл воды и озвучивали на звуковой бане (70 Вт) в течение 30 минут (до тех пор пока весь бриллиантовый зеленый (БЗ) не высвободиться из трубок). Затем центрифугировали финальную суспензию при llOOg 10 минут и отбирали супернатант. Полученный образец принимали за 100%.
Для построения кинетического профиля высвобождения красителя из просвета нанотрубок полученные образцы анализировали при помощи спектроскопии в видимой области спектра, измеряя оптическую плотность бриллиантового зеленого при 625 нм. Используя калибровочную кривую, рассчитывали количество высвобожденного красителя в мг по каждому временному отрезку и суммировали значения. Полученное значение принимали за общее количество вещества, которое содержалось в трубках. Далее рассчитывали долю высвободившегося вещества в % от общего количества вещества за каждый промежуток времени. Полученные данные представляли в виде графика зависимости доли высвободившегося вещества от времени.
В основе термогравиметрического анализа (ТГА) лежит регистрация изменения массы образца в зависимости от температуры. Результатом анализа являются ТГ-кривые — зависимости массы навески (или изменения массы навески) от температуры или времени. В работе использовали термогравиметрический анализатор TGA Q50 (ТА Instruments, США), показанный на рисунке 14.
Антисептические свойства функциональных наноматериалов исследовали с использованием культуры грамположительной бактерии S. aureus. Стерильные препараты нанотрубок добавляли в триптон-соевый бульон (ТСБ), содержащий 106 КОЕ/мл S. aureus. Пробирки инкубировали в термошейкере при 37 С в течение 24 часов. Затем отбирали аликвоты клеток и центрифугировали оставшийся в пробирке объем. Супернатант удаляли и добавляли свежий ТСБ, продолжали инкубацию в течение следующих 24 часов. Замену питательной среды на новую и отбор аликвот для дальнейшего исследования проводили после 24, 48 и 72 часов инкубации с исследуемыми образцами. Отобранные аликвоты клеток промывали стерильным NaCl 0.9 %. и вносили 2.5 мкл флуоресцеин диацетата (10 мг/мл в ацетоне) затем измеряли интенсивность флуоресценции в черных непрозрачных планшетах с использованием флуоресцентного планшетного ридера FLx800 (Biotek, США) при 540 нм для флуоресцеин диацетата (возбуждение при 485 нм). Изначальное количество живых клеток в образцах рассчитывали по интенсивности флуоресценции с использованием калибровочной кривой.
Модификация клеточной поверхности микроорганизмов магнитными и серебряными наночастицами
Ряд микроорганизмов являются первым звеном в пищевой цепи и служат источником пищи для мелких животных. В связи с этим взаимодействие наноматериалов в окружающей среде не ограничивается взаимодействием только лишь с микроорганизмами. Так, например, свободноживущая почвенная нематода С. elegans питается почвенными бактериями. В лабораторных условиях в качестве питательного субстрата для поддержания культуры используют клетки E.coli. Логично было бы предположить, что наноматериалы, находящиеся на поверхности бактерий с легкостью проникают в организм нематод и неминуемо оказывают влияние на ряд их жизненных показателей.
В связи с этим, в последние десятилетия это животное стали активно использовать в токсикологических исследованиях. С использованием С. elegans ранее были исследованы токсичность ряда оксидных наночастиц (Ma et al., 2009; Roh et al., 2010; Khare et al., 2011; Ma et al., 2011), наночастиц благородных металлов, таких как платина (Kim et al., 2008; Kim et al., 2010), серебро (Roh et al., 2009; Yang et al., 2011; Lim et al., 2012), наночастиц меди (Gao et al., 2008). В данных работах наноматериалы добавляли в жидкие и твердые среды, на которых выращивались нематоды. Логичным этапом в исследовании токсичности наноматериалов было бы использование клеток микроорганизмов в качестве природного субстрата для доставки наноматериалов внутрь нематод с последующей оценкой их влияния на жизненные показатели.
В данной главе описывается разработанный нами метод оценки токсичности наноматериалов с использованием свободноживущей почвенной нематоды С. elegans и наномодифицированных клеток микроорганизмов.
При помощи микроскопических методов было показано, что пищевое поведение нематод не отличается в зависимости от качества предлагаемого пищевого субстрата. Клетки Е.соИ, покрытые магнитными и серебряными наночастицами черви поглощали также активно, как и немодифицированные клетки.
Инкубация нематод в среде, содержащей магнитные наночастицы, приводила к формированию слоя наночастиц на поверхности кутикулы нематод (Рисунок 38 А), что значительно снижает концентрацию доступных для проникновения внутрь частиц. У нематод, которые инкубировались в присутствии наномодифицированных микроорганизмов, наблюдали распределение наноматериалов в пищеварительной системе. Рисунок 37 демонстрирует типичную оптическую микрофотографию распределения магнитных наночастиц вдоль всей пищеварительной системы С. elegans, в то время как на поверхности кутикулы наночастиц не наблюдалось (Рисунок 38Б).
При помощи темнопольного микроскопа Cyto Viva были получены микрофотографии нематод в режиме темного поля, где также видны скопления РАН-МНЧ (Рисунок 39Б) и Ag НЧ (Рисунок 39В) вдоль пищеварительной трубки.
Наиболее детально распределение магнитных наночастиц внутри пищеварительного тракта позволили рассмотреть просвечивающие электронные микрофотографии (Рисунок 40). Рисунок демонстрирует поперечный срез тела нематод, которые инкубировались совместно с клетками is.co/г/РАН-МНЧ (Рисунок 40Г). Магнитно-модифицированные клетки бактерий обладают более толстой оптически плотной клеточной стенкой за счет иммобилизованных магнитных наночастиц на их поверхностях (Рисунок 40Б, Д отмечено стрелками) в то время как клетки с немодифицированной поверхностью обладают тонкой и частично разрушенной клеточной стенкой (Рисунок 40А, В). Как модифицированные, так и немодифицированные клетки взаимодействуют с микроворсинками кишечника нематод и подвергаются дальнейшему перевариванию в кишечной полости. Можно предположить, что наномодифицированные клетки будут перевариваться в меньшей степени из-за наличия дополнительного плотного слоя наночастиц на их поверхности.
Оптические микрофотографии немодифицированных клеток С. pyrenoidosa в пищеварительном тракте C.elegans. А - светлое поле; Б — режим флуоресценции. Автофлуоресценция хлорофилла Ь; В - изображение, совмещенное путем наложения флуоресцентного изображения на светлопольное. Стрелкой отмечена отдельная клетка водоросли, находящаяся за пределами тела нематоды
Покрытие клеток магнитными наночастицами проводили по стандартной методике. Первоначально, мы продемонстрировали, что нематоды способны использовать данные типы клеток в качестве пищевого субстрата (Рисунок 41 и 43А). Рисунок 42А демонстрирует процесс питания нематоды магнитно-модифицированными клетками водорослей. Детектирование водорослей в пищеварительном тракте нематод проводили при помощи оптической микроскопии в светлом поле и в режиме флуоресценции (Рисунок 42Б и В). Рисунок 41 демонстрирует контрольный образец нематод, которые питались нативными клетками водорослей. Из рисунка видно, что клетки, находящиеся в пищеварительном тракте, продолжают флуоресцировать, так же как и клетка за пределами тела нематоды (отмечена стрелкой). Этот факт значительно облегчил последующее детектирование наличия клеток наномодифицированных водорослей в пищеварительном тракте нематод (Рисунок 42В, клетки отмечены стрелками). Наличие магнитных наночастиц демонстрирует оптическая микрофотография в светлом поле (Рисунок 42 Б).
Рисунок 42. Оптические микрофотографии С. elegans, питавшейся клетками С. pyrenoidosa, покрытыми РАН-МНЧ. А - процесс питания нематоды магнитными клетками С. pyrenoidosa. Вставка демонстрирует увеличенную область головного отдела нематоды магнитные клетки С. pyrenoidosa отмечены стрелками. Б -микрофотография средней части тела нематоды, демонстрирующая присутствие магнетизированных клеток в пищеварительном тракте. Кластеры наночастиц отмечены окружностями. В - флуоресцентная микрофотография соответствующего участка тела нематоды, демонстрирующая наличие красной автофлуоресценции водорослей в кишечнике нематоды (клетки отмечены белыми стрелками). Шкала -20 мкм
Сходная картина наблюдалась и при выращивании нематод в присутствии клеток магнитных дрожжей. На рисунке 42 клетки дрожжей отмечены стрелками. Стоит отметить, что количество клеток дрожжей и водорослей внутри нематод несоизмеримо мало по сравнению с бактериальными клетками. Вероятно, это связано с тем, что более мелкие бактериальные клетки являются предпочтительным пищевым субстратом для нематоды С. elegans (Avery, Shtonda, 2003). Кроме того, по аналогии с коллоидными частицами общая площадь поверхности крупных клеток, таких как водоросли и дрожжи, значительно меньше, чем таковая у бактериальных клеток, что позволяет иммобилизовать большее количество наноматериалов на поверхность бактериальной клетки.
