Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Методы идентификации микроорганизмов 9
1.1. Идентификация микроорганизмов, основанная на фенотипических методах 9
1.2. Идентификация микроорганизмов, основанная на генотипических методах 12
1.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК 12
1.2.2. ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизация 12
1.2.3. Секвенирование белков и нуклеиновых кислот 13
1.2.4. Использование ДНК-зондов для обнаружения бактерий и изучения состава микробных популяций 18
1.2.5. Краткая характеристика бактериального генома 21
1.2.6. Использование ПЦР со специфичными праймерами для обнаружения и идентификации бактерий 22
1.2.7. ДНК-фингерпринтинг 27
ГЛАВА 2. Характеристика отдельных групп бактерий 3S
2.1 Фитопатогенные бактерии родаXanthomonas 38
2.1.2. Генетические взаимоотношения внутри видаX campestris 41
2.2. Бактерии группы Bacillus cereus 46
2.2.1. Энтомопатогенные бактерии вида Bacillus thuringiensis 47
2.2.2. Методы идентификации и классификации бактерий вида Bacillus thuringiensis 49
2.2.3. Методы, используемые для идентификации cry генов 51
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 53
3.1. Объекты исследования 53
3.2. Выделение препаратов ДНК из биомассы 57
3.3. ПЦР со специфическими праймерами к cryl, сгуЗ и сгу4 генам 57
3.4. ПЦР с KRP и KRPN праймерами 59
3.5. ПЦР с использованием праймеров к различным повторяющимся элементам 60
3.6. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе 60
3.7. Филогенетический анализ 61
3.8. Клонирование ПЦР-фрагментов 61
3.8.1. Приготовление компетентных клеток 61
3.8.2. Лигирование 62
3.8.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК 64
3.8.4. Выделение плазмидной ДНК 64
3.8.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК 64
3.9. Секвенирование плазмид со вставкой 64
3.9.1. Мечение праймеров 64
3.9.2. Постановка реакции секвенирования 65
3.10. SCAR-ПЦР анализ 66
ГЛАВА 4. Подбор олигонуклеотидных праймеров для проведения DIR-ПЦР .. 67
ГЛАВА 5. Оптимизация условий проведения DIR-ПЦР 68
5.1. Оптимизация условий DIR-ПЦР для бактерий родов Xanthomonas и Bacillus 70
ГЛАВА 6. Изучение генетических взаимоотношений между изолятами Xanthomonas campestris pv. campestris 78
6.1. Сиквенсный анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и межгенной области 16S-23SpPHK 78
6.2. Получение видо- и штаммо-специфичных фингерпринтов на ДНК Xanthomonas, выделенных в различных географических ареалах 82
6.3. Фенетический анализ полученных геномных фингерпринтов 87
6.4. Сравнение эффективности DIR-ПЦР и гер-ПЦР при изучении генетического
полиморфизма штаммов Xanthomonas 90
6.5. Разработка и тестирование SCAR праймеров для Xanthomonas campestris 93
ГЛАВА 7. Изучение внутривидового разнообразия энтомопатогенных бактерий вида Bacillus thuringiensis 98
7.1 ПЦР-анализ с использованием праймеров, специфичных к cryl, cry 3 и cry 4 генам 99
7.2. Секвенирование и рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов, соответствующих cry генам 101
7.3. Сиквенсный анализ 5'-концевых областей 16S и 23S рРНК и межгенной области 16S-23SpPHK 104
7.4. Изучение энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis методом DIR-ПЦР 105
7.5. ПЦР-анализ энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis с применением праймерных систем к мобильным элементам, межгенным повторам и к терминаторным последовательностям 110
7.6. Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов энтомопатогенных бактерий вида В. thuringiensis 112
7.7. Разработка и тестирование SCAR праймеров для В. thuringiensis, патогенных в отношении насекомых отряда Lepidoptera 117
ГЛАВА 8. Выявление геномных различий диссоциантов штаммов Bacillus cereus и Bacillus subtilis 122
8.1. Проверка видовой чистоты диссоциантов В. cereus 125
8.1.1. Сиквенсный анализ 5'-вариабельной области гена 16S рРНК 125
8.1.2. Проверка диссоциантов В. cereus на наличие cry генов 125
8.2. ПЦР-анализ диссоциантов В. cereus с использованием праймеров к мобильным элементам 126
8.3. Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов диссоциантов В. cereus и В. subtilis 131
ГЛАВА 9. Анализ таксономической надежности и разрешающей способности DIR- ПЦР в сравнении с другими методами ДНК-фингерпринтинга на примере видов Bacillus thuringiensis и Xanthomonas campestris 136
9.1. Анализ штаммов родаXanthomonas 137
9.2. Анализ штаммов ват Bacillus thuringiensis 142
Выводы 147
Список литературы 148
Приложения 164
- Идентификация микроорганизмов, основанная на фенотипических методах
- Генетические взаимоотношения внутри видаX campestris
- Оптимизация условий DIR-ПЦР для бактерий родов Xanthomonas и Bacillus
- Изучение энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis методом DIR-ПЦР
Введение к работе
В настоящее время для описания и идентификации прокариотических организмов применяется совокупность фенотипических, генотипических и филогенетических подходов. К фенотипическим традиционно относят признаки отдельных бактерий, определяемые с помощью физических и биохимических методов (спектр общих белков, состав жирных кислот, антигенные характеристики и т.д.). Генотипические признаки в узком смысле сводятся к изо-ферментным паттернам, последовательностям ДНК определенных генов и сайт-специфичным ПЦР-фрагментам. В широком смысле к ним относятся также и ДНК-фингерпринты.
Успехи, достигнутые в последние годы в определении новых видов и идентификации штаммов микроорганизмов, связаны, прежде всего, с развитием молекулярно-биологических методов. Секвенирование нуклеиновых кислот и белков, а также методы геномного фингер-принтинга дают возможность сравнивать не только гены или их отдельные участки, но и полные геномы бактерий. Данные методы широко используются для идентификации различных прокариот и обнаружения их в образцах окружающей среды.
Однако при всем многообразии современных молекулярных методов остаются проблемы, которые до сих пор еще не решены. Например, большое значение имеет идентификация штаммов близкородственных бактерий в клинической диагностике, особенно в тех случаях, когда необходимо определить этиологию возбудителя, либо идентифицировать конкретные штаммы патогенов, отчего может зависеть характер дальнейшего лечения. Аналогичные проблемы возникают в промышленности, когда требуется установить штамм-продуцент, либо при его патентовании. Использование таких методов, как картирование генома, анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК или межгенной области 16S-23S рРНК, как правило, не дает положительных результатов в подобных исследованиях. Поэтому существует необходимость разработки новых методов идентификации близкородственных прокариот.
Применяемые методы ПЦР-диагностики (специфичный ПЦР) основаны на подробном изучении молекулярной структуры отдельных генов, что требует больших финансовых и временных затрат. Разработка методов генотипирования, которые основаны на интегральных способах характеристики генома и не требуют полного знания его молекулярной организации (сиквенса), позволит успешно решить данную проблему в более короткие сроки и с большей эффективностью.
Предлагаемый метод DIR-ПЦР, относящийся к группе методов генотипирования (ДНК-дактилоскопии), может использоваться как для изучения микроэволюции бактерий, так и для быстрой разработки систем праймеров, позволяющих проводить диагностику бактерий в разных таксономических подразделениях.
Более высокая, по сравнению с другими методами генотипического анализа, специфичность DIR-ПЦР, позволяет оценить степень родства микроорганизмов даже на низших (вплоть до штаммового) таксономических уровнях, что весьма существенно для изучения видообразования и других проблем микроэволюции. Кроме того, по мере наполнения банка данных геномных фингерпринтов на базе DIR-ПЦР станет возможной более быстрая идентификация микроорганизмов, чем при частичном секвенировании 16S рРНК, к тому же стоимость такого анализа будет существенно дешевле.
Целью данной работы бьша проверка применимости нового метода ПЦР-фингерпринтинга DIR-ПЦР (diverged inverted repeats) для дифференциации микроорганизмов на самых низших таксономических уровнях: видовом и штаммовом. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
Проверка предложенных праймерных систем на ДНК бактерий различных таксономических групп с целью выявления систем, пригодных для получения наиболее информативных спектров DIR-ПЦР.
Оптимизация условий проведения реакции для получения специфичных и воспроизводимых ПЦР-спектров бактерий разных таксономических групп.
Исследование возможности применения предлагаемого метода DIR-ПЦР для изучения филогенетических взаимоотношений внутри групп близких штаммов патовара Xanthomonas campestris и энтомопатогенных бактерий вида Bacillus thuringiensis.
Применение метода DIR-ПЦР для выявления геномных различий диссоциантов штаммов Bacillus cereus и Bacillus subtilis.
Сравнение степени надежности и разрешающей способности метода DIR-ПЦР с другими методами ПЦР-фингерпринтинга.
Идентификация микроорганизмов, основанная на фенотипических методах
С усовершенствованием молекулярно-биологических технологий появилась возможность определять последовательности биополимеров - белков и нуклеиновых кислот. Это дало возможность сравнивать не только гены или их отдельные участки, но и в некоторых случаях полные геномы бактерий. Данные методы стали использовать в филогенетических исследованиях, при идентификации бактерий и при изучении природных сообществ.
Исторически первым объектом для секвенирования стали белки. Изучение структурно-функциональных особенностей различных типов белков ферредоксинов позволило сделать заключения об эволюционной взаимосвязи между хлоропластами водорослей, высших растений и цианобактериями, а также между фототрофными и аэробными нефототрофными бактериями. В эволюционном аспекте исследовалась также структура пластоцианинов. Результаты свидетельствовали о тесной эволюционной связи цианобактерий и фототрофных эукариот или их хлоропластов (Турова, 1983).
Еще одной молекулой, которая интенсивно использовалась для филогенетических исследований стал цитохром с. Однако, сравнение цитохромов сг системы фотосинтеза пурпурных фототрофных бактерий и дыхательных цитохромов С550 аэробных бактерий указывало на тесное филогенетическое родство этих микроорганизмов, что противоречило традиционным представлениям (Булыгина, 1991). Так что, использование белков в качестве молекулярных хронометров ограничено. Это объясняется тем, что для исследований необходимы молекулы, функционально постоянные среди различных групп бактерий. Но ни молекулы, функционально постоянные среди различных групп бактерий. Но ни один из используемых классов белков не имеет универсального распространения среди прокариот и эукариот, а объединение данных по аминокислотным последовательностям различных классов белков может привести к ошибочным заключениям (Турова, 1983).
Поэтому в дальнейшем для филогенетических исследований стали использовать ри-босомные РНК. Они универсально распространены, являются функционально постоянными молекулами, достаточно консервативны для того, чтобы установить дальние эволюционные взаимосвязи и, кроме того, рРНК достаточно просто выделять для исследования.
Одной из первых рибосомных РНК, которую использовали для изучения эволюционных отношений между микроорганизмами и для их идентификации, стала 5S рРНК. На основе сравнения нуклеотидных последовательностей этой небольшой молекулы (120 нуклеотидов) проводились исследования эволюционных взаимоотношений среди таких больших групп организмов как зеленые растения и грибы, а также среди многочисленных групп микроорганизмов (Булыгина, 1991). Кроме того, с его помощью изучали состав микробных популяций (Stahl etal., 1985). Данный метод позволял исследовать небольшие микробные сообщества, включающие не более полутора десятков бактерий. Однако, он не нашёл широкого распространения из-за малой информативности этой молекулы при её относительно высоком консерватизме.
Другой метод идентификации микроорганизмов, получивший в настоящее время наиболее широкое распространение, основан на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рРНК. Ген 16S рРНК имеет ряд преимуществ по сравнению с 5S рРНК: его длина составляет примерно 1500 нуклеотидов, он состоит как из консервативных, так и вариабельных доменов и присутствует в клетках всех прокариотических микроорганизмов. Кроме того, по решению Международного Комитета по Систематике микроорганизмов, нуклеотидная последовательность 16S рРНК должна быть определена для всех вновь описываемых видов бактерий, поэтому база данных для этой молекулы достаточно обширна и постоянно пополняется (Wayne etal., 1987). Анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК позволяет с высокой степенью достоверности определять как филогенетическое положение микроорганизмов, так и надёжно идентифицировать их на родовом, а иногда и на видовом уровнях. Причем, для проведения идентификации достаточно определить 500-600 нуклеотидов 5 -концевой области, что значительно ускоряет такой анализ.
На основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК группой ученых под руководством Везе (Woese, 1987) была предложена схема эволюции прокариот, которая дос таточно сильно отличалась от принятой ранее (Holt etal., 1994). Построение схемы основано на использовании коэффициента ассоциации SAB» который измеряет сходство последовательностей 16S рРНК при попарном сравнении. Основной отличительной особенностью рассматриваемой эволюционной схемы является наличие трех главных линий, исходящих от общего предка, что отражает разделение организмов на три царства: эубактерии, архебакте-рии,эукариоты.
Наиболее хорошо охарактеризовано царство прокариот, объединяющее истинные бактерии или эубактерии. Это царство разделено далее на десять основных групп: пурпурные бактерии, которые подразделяются на 4 подкласса: а, Р, у, 5; Грамположительные бактерии, среди которых выделяют виды с высоким Г-Ц составом, низким Г-Ц составом, фотосинтетиков и виды с клеточной стенкой Грамотрицательного типа; цианобактерии и хлоропласты; спирохеты и лептоспиры; зеленые серные бактерии; зеленые несерные бактерии; бактероиды, флавобактерин и родственные им организмы; хламидии; планктомицеты; группа не образующих спор Грамположительных бактерий типа Micrococcus radiodurans и близкие к нему виды.
К представителям второго царства (архебактерий) относятся метанообразующие бактерии, экстремальные галофилы и термофилы. Третье царство представлено эукариотическими организмами.
Следует, однако, заметить, что в последнее время использование молекул 16S РНК для построения филогенетической системы микроорганизмов подвергается критике. Считается, что данная молекула законсервирована, то есть находится под действием стабилизирующего отбора и при этом является нейтрально эволюционирующей молекулой, потому что только при этом условии она может быть семантидой. Действительно, как у про-, так и у эу-кариот рРНК является мозаикой законсервированных сегментов и таких, которые могут эволюционировать нейтрально. Но эукариоты имеют выраженный "гипервариабельный" домен (эволюционирующий нейтрально), у прокариот его аналога нет. Таким образом, пркариоти-ческие рРНК более консервативны, и, следовательно, их сравнение с эукариотическими не показывает истинного таксономического расстояния между различными группами (царствами) организмов (Головлев, 1998).
Генетические взаимоотношения внутри видаX campestris
Серологическое тестирование штаммов двух патоваров X campestris: X. campestris pv. campestris и X. campestris pv. armoracea, вызывающих сосудистый бактериоз и листовую пятнистость соответственно, проведенное Alvarez А.М. с соавторами, разделило их на три серологических группы: SI, S2, S3 (Alvarez etal., 1994). ШтаммыX. campestris pv. campestris, вызывающие на капустных типичные симптомы сосудистого бактериоза вошли в группы S1 и S2, в то время как штаммы X. campestris pv. campestris, вызывающие симптомы ожега листьев (сочетает признаки и сосудистого бактериоза и листовой пятнистости) вошли в третью группу S3. Также по данным Alvarez А.М. к первой группе относятся изоляты X. campestris pv. armoracea. RFLP анализ указанных выше штаммов также подтвердил генетическую гетерогенность обоих патоваров. Штаммы X campestris pv. campestris разделились на 3 отдельных гашютипа: СІ, С2, СЗ более близких между собой, чем со штаммами X. campestris pv. armoracea, которые образовали отдельную группу (Alvarez etal., 1994). Что касается СІ, С2, СЗ гаплотипов, то они соответствуют SI, S2, S3 серотипам. Таким образом, для практических целей, например, быстрой идентификации больших количеств изолятов в полевых экспериментах или при тестировании зараженности семян, серологический метод служит хорошим диагностическим инструментом. Но в случае точной идентификации требуется дополнительный анализ: проведение тестов на патогенность, либо использование молекулярно-генетических подходов.
Один из таких подходов заключается в конструировании олигонуклеотидных прайме-ров к последовательностям консервативных генов, таких как гены 16S/23S рРНК и hrp гены. Патогенность ксантомонад определяется относительно небольшой частью генома, включающей кластер генов сверхчувствительности {hrp) и гены патогенности/авирулентности (pth/avr). Hrp гены были найдены благодаря способности бактерий вызывать реакцию сверхчувствительности на растении. Большинство hrp-генов организованы в большие генные кластеры — до 10 генов общей длиной до 40 тыс.п.о. (Hirano etal., 1999). Белки, кодируемые этими генами создают пиль-канал для транспорта продуктов avr-генов в растительную клетку, при этом активность самих ovr-генов зависит от успешного функционирования Агр-генов (Rossier et.al., 2000).
Гены авирулентности (avr) и аллельные им гены патогенносте (pth) были обнаружены во многих штаммах ксантомонад, авирулентных для растений, несущих различные гены устойчивости. То, что пара соответствующих друг другу генов авирулентности в фитопатоген-ном микроорганизме и устойчивости (R) в растении определяют узнавание растением фито-патогена, было впервые показано Флором почти пятьдесят лет назад (Flor, 1971). Единичные мутации описанных специализированных генов способны привести к изменению специализации фитопатогена или симптомов болезни, что затрудняет диагностику патогена и опрде-ление его видовой принадлежности.
В качестве примера использования hrp-тенов для определения и идентификации фи-топатогенных ксантомонад можно привести работы, посвященные созданию специфических олигонуклеотидных праймеров к различным регионам hrp генного кластера X campestris pv. vesicatoria (Rui et.al., 1994). Разработанные праймеры были протестированы на ДНК 28 пато-варов X. campestris, на родственных видах ксантомонад, а также на фитопатогенных бактериях других родов: Acidovorax, Agrobacterium, Clavibacter, Erwinia, Pseudomonas и Xylella. Анализ фрагментов ДНК, амплифицированных со специфическими Лф-праймерами, свидетельствует о том, что данный подход может быть полезен для идентификации фитопатогенных штаммов X. campestris и видов Xanthomonas. В силу консервативности последовательности генов hrp среди патоваров и видов Xanthomonas и отсутствию генов hrp среди непатогенных бактерий, данный метод мог бы быть использован не только для идентификации уже известных патоваров, но и для определения вновь выделенных патогенов.
При всех достоинствах описанного метода следует, однако, заметить, что не все виды бактерий могут быть охарактеризованы сравнением отдельных участков генома. В таких случаях наибольшей разрешающей способностью обладают методы геномного фингерприн-тинга. В предыдущем разделе было рассказано об использовании метода гер-ПЦР для определения таксономического разнообразия и филогенетической структуры бактериальных популяций на примере бактерий рода Xanthomonas. На основе данных о распределении семейств повторяющихся элементов в геномах различных микроорганизмов (Versalovic et.al., 1991; de Bruijn, 1992) было сделано предположение, что каждая эволюционно специализированная линия или патовар патогена характеризуются уникальным распределением повторяющихся элементов в геноме. Геномные фингерпринты, полученные с помощью олигонуклеотидных праймеров, соответствующих REP-, ERIC-, ВОХ-элементам, на различных изоля тах Xanthomonas, показали, что данный метод является полезным для дифференциации пато-варов и видов Xanthomonas (Louws etal., 1994). А высокая корреляция между различными ПЦР-методами и ДНК-ДНК гибридизацией позволяет предположить, что геномный фингер-принтинг действительно отражает таксономические связи между организмами (Rademaker etal., 2000). Однако определенные участки генома могут иметь меньше или вообще не иметь копий гер-элементов (Louws etal.,. 1994) по сравнению с другими и поэтому не могут быть охарактеризованы данным методом.
Оптимизация условий DIR-ПЦР для бактерий родов Xanthomonas и Bacillus
По результатам DIR-ПЦР было определено около 60 полиморфных маркеров для 51 штамма проанализированных бактерий. Для количественной оценки полиморфизма и определения уровня дивергенции между штаммами X. campestris полученные данные были представлены в виде матрицы бинарных состояний, в которой наличие или отсутствие в ПЦР-фингерпринтах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояние 1 и 0 соответственно. Имеющимся в спектрах минорным полосам со слабой интенсивностью также приписывалось состояние 0. На основе этой матрицы, методом близжайшего связывания (NJ) была построена дендрограмма отражающая степень различий между исследуемыми штаммами (рис. 18).
Из приведенной дендрограммы видно, что изученные штаммы распадаются на 4 кластера. Генетические расстояние между группами были близки к генетическим расстояниям между разными видами ксантомонад, и не превышали 0.9.
Первый кластер образовали штаммы из разных географических ареалов, большинство которых также относились к 1 серотипу и 1 гаплотипу по данным д-р Альварез (Alvarez etal., 1994). Этот кластер в свою очередь разделился на две подгруппы. В подгруппу А вошли все английские изоляты (за исключением UK2, который вошел во второй кластер), германский изолят D4 и часть штаммов японского происхождения (J66, J45a, J20a). Подгруппу В образовали в американские изоляты (2D520, PHW117, PHW231, 147), три российских (RU3, RU4, RU5) а также германский (D1) и венгерский (HI 1) изоляты. Японские изоляты, вошедшие в I кластер, были получены из растений, выращенных из импортированных в эту страну семян, которые были заражены сосудистым бактериозом.
Второй кластер был сформирован штаммами из разных географических ареалов: Англии, России, Германии, Венгрии и Канады, сюда же был включен типовой штамм X. campestris pv. campestris NCPPB 528т.
Третий кластер образовали японские изоляты из префектур Гуфу и Цумагой (Gufu, Tsumagoy): J15b, J15a, J19b, J19a. Японские изоляты, попавшие в этот кластер, представляли эндемичную местную популяцию в противоположность штаммам, вошедшим в первый (J20a, J45a, J66) и во второй кластеры (J41a).
Четвертый кластер составили типовые штаммы X campestris pv. raphani NCPPB 1946т, X. campestris pv. armoraciae NCPPB 347T, X. campestris pv. armoraciae Xa5 и японский изолят X campestris pv. campestris J 18a. Патовары armoraciae и raphani являются наиболее близкими к патовару campestris по биохимическим, морфологическим, иммунологическим и генетическим признакам (Vauterin et al., 1995; Alvarez et al. 1994; Игнатов и др. 1998), поэтому присутствие изолят&Х. campestris pv. campestris в данном кластере вполне объяснимо.
Отдельно группировались типовые штаммы других видов Xanthomonas: X. axonopodis pv. malvacearum NCPPB633T, X axonopodis (campestris) pv. phaseoli var. fuscans HRI924a, X. oryzae pv. oryzae NCPPB3002T,X oryzae pv. oryzicola NCPPB 1585T, vesicatoria pv. vesicaoria NCPPB4227.
Распределение большинства исследованных штаммов X campestris pv. campestris no кластерам согласуется с разделением этих штаммов на серотипы, идентифицированные по антигенным свойствам экзополисахаридов (Alvarez et.al., 1994; Игнатов и др., 1998) и гапло-типы, определенные ранее RFLP анализом (Alvarez et.al., 1994). Приведенная дендрограмма показала, что все изучаемые штаммы X campestris pv. campestris разделяются на основе ДНК-фингерпринтов. Если на филогенетических деревья, построенных по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей 16S рРНК генов и 16S-23S ITS, все семь проанализированных близкородственных штамма из разных географических мест (PHW117, HRI1279b, Dl, RU1, RU2, J41a, UK1) располагались в одном кластере и были неотделимы друг от друга, то дендрограмма по суммарным данным ПЦР-фингерпринтинга показала, что все эти штаммы относятся к разным кластерам (PHW117, D1 - подгруппа В первого кластера; UK1 - подгруппа А первого кластера; HRI1279b, RU1, RU2, J41a - второй кластер) и являются генетически разнородными.
Таким образом, полученные нами результаты показывают, что в популяции X campestris pv. campestris существует высокий полиморфизм штаммов. Тот факт, что штаммы Xanthomonas, выделенные из капустных очень разнородны, может иметь два объяснения. Во-первых, патогенность ксантомонад по отношению к растениям семейства крестоцветных могла возникнуть в процессе конвергентной эволюции, и X. campestris может являться поли-филетическим (сборным) видом, так же как и X. vesicatoria, X. vitians и X. vasculorum (Vauterin etal., 1995; Louws etal., 1994). Во-вторых, географические группы X. campestris могли эволюционировать от одной и той же предковой популяции по пути адаптации к определенным климатическим условиям (Игнатов и др., 1998).
В последние годы было разработано множество вариаций методики полимеразной цепной реакции со случайными праймерами, впервые предложенной Welsh с коллегами (Welsh et al., 1990) и Williams с коллегами (Williams et al., 1990). Общепринятым стандартом ПЦР-генотипирования на внутривидовом уровне является rep-PCR с праймерами, гомологичными повторам в регуляторных межгенных областях (BOX, REP, ERIC) кодирующих участков генома.
Из всех изученных методом DIR-ПЦР близких штаммов ксантомонад для данного анализа были выбраны 14 штаммов, представляющих разные геномовиды. На ДНК этих бактерий были получены ПЦР-фингерпринты с использованием BOX и (GC)4 праймеров (рис. 19).
Как видно из приведенных паттернов, видоспецифичность и разрешающая способность ПЦР-фингерпринтов данных штаммов значительно ниже, чем в случае спектров по DIR праймерам. Некоторые из штаммов и даже видов ксантомонад на основе этих результатов неотличимы друг от друга. Например, близкие виды X oryzae pv. oryzae NCPPB30021 и X. oryzae pv. oryzicola NCPPB1585T no BOX и GC-фингерпринтам идентичны, в то время как с KRP2-KRP8 и KRPN2 праймерами (рис. 15 а и Ь) у этих бактерий обнаруживаются высокоспецифичные фингерпринты, по которым их легко идентифицировать. Аналогичная ситуация наблюдается в случае с японскими изолятами X. campestris pv. campestris J15b и J41a. С KRPN2 праймером эти два штамма дают индивидуальные спектры, различающиеся набором характерных для каждого из штаммов ГЩР-фрагментов (рис. 17), а по паттернам с BOX и (GC)4 праймерами они отличаются наличием у одного из штаммов полосы слабой интенсивности (рис. 19 Ь). Штаммы A! campestris pv. campestris 8417 (лабораторный штамм от д-ра М. Диксона, инст. Джона Иннеса)и NCPPB1711 (Канада) были по BOX и (GC)4 паттернам наи-более близки к типовому штамму X vesicatoria pv. vesicatoria NCPPB422 . Более того, различия между X oryzae pv. oryzae NCPPB30021, X oryzae pv. oryzicola NCPPB1585T и X. axono-podis pv. phaseoli var.Juscans 924a сводились к минорным фрагментам разной интенсивности.
Изучение энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis методом DIR-ПЦР
Для изучения межштаммовых различий В. thuringiensis вначале были использованы ставшие уже классическими подходы: у всех исследуемых микроорганизмов были определены нуклеотидные последовательности гипервариабельной области 5 -конца 16S рРНК, спейсерной области 16S-23S рРНК и 5 -конца 23S рРНК. Для сравнения были использованы аналогичные участки генов 16S рРНК В. anthracis штамм Sterne, В cereus штаммы АТСС 14579т и NCTC 11143, В. thuringiensis штаммы NCIMB 9134ти S32, В. thuringiensis sbsp. galleria и sbsp. israelensis, представленные в базе данных GenBank. Для сравнения спейсеров и 23 S рРНК были выбраны следующие штаммы из GenBank: В. anthracis штамм Sterne, В. cereus штаммы АТСС 14579т и АТСС 25621, В. thuringiensis штаммы NCIMB 9134х и NCTC 4042.
Результаты анализа 5 -конца 16S рРНК, представленные в приложении 2, выявили гетерогенность данной области среди штаммов В. thuringiensis. У семи из 13 исследованных штаммов: В. thuringiensis sbsp. galleria СВ01/Т4, В. thuringiensis sbsp. dendrolimus T04A001, В. thuringiensis sbsp. colmeri B6068, B. thuringiensis sbsp. kurstaki B6066, B. thuringiensis sbsp. ostriniae CB05, B. thuringiensis sbsp. morrisoni B6069, B. thuringiensis sbsp. tenebrionis B5081 обнаружились замены трех нуклеотидов, приводящие 5 -концевую область 16S рРНК этих штаммов к практически полной идентичности с последовательностями В. anthracis и В. cereus (приложение 2). Поскольку такие замены обнаружены у большого количества исследованных нами штаммов, то это не позволяет делать предположения о случайности таких замен или приписывать эти замены ошибкам Taq-полимеразы в ходе амплификации.
Заметим, что нуклеотидная последовательность 5 -вариабельной области гена 16S рРНК В. thuringiensis sbsp. galleria из базы данных GenBank отличалась от определенных нами последовательностей штаммов В. thuringiensis sbsp. galleria СВ01/Т4 и В-696 именно по указанным выше позициям (приложение 2).
У штамма В. thuringiensis sbsp. israelensis В6064, который, как и штамм В. thuringiensis sbsp. israelensis из GenBank имеет последовательность 16S рРНК, характерную для В. thuringiensis, наблюдалась только единичная замена G на А, но идентичная одной из указанных выше, что также указывает на маловероятность ошибки.
Аналогичным образом были также исследованы спейсерная область 16S - 23 S рРНК и прилегающий 5 -конец 23S рРНК (приложение 3 а, Ь). В спейсерной области наблюдались три идентичные нуклеотидные замены у штаммов В. thuringiensis sbsp. kurstaki В6066 и В.
1thuringiensis sbsp. dendrolimus T04A001, отличающие эти штаммы как от других штаммов В. thuringiensis, так и от В. anthracis и В. cereus. Единичные замены у штаммов В. thuringiensis sbsp. sotto В6026, В. thuringiensis sbsp. ostriniae CB05 и В. thuringiensis sbsp. israelensis B6064 можно скорее всего отнести к фактору случайности. Никаких других отличий в этой достаточно вариабельной области не выявлено.
В 5 -концевой области 23 S рРНК также выявлены по две нуклеотидных замены у пяти штаммов: В. thuringiensis sbsp. colmeri В6068, В. thuringiensis sbsp. galleria CB01/T4, В. thuringiensis sbsp. kurstaki B6066, B. thuringiensis sbsp. dendrolimus T04A001 и В. thuringiensis sbsp. ostriniae CB05. Как и в случае с 16S рРНК эти замены делают нуклеотидные последовательности перечисленных выше штаммов и последовательности В. anthracis с типовым штаммом В. cereus полностью идентичными в данной области. Следует отметить, что такие замены наблюдались у одних и тех же штаммов (группа 2), за исключением В. thuringiensis sbsp. morrisoni В6069, В. thuringiensis sbsp. tenebrionis B5081 и В. thuringiensis sbsp. israelensis B6064. У последних никаких нуклеотидных замен не было выявлено и эта область полностью идентична типовому штамму В. thuringiensis DSM 2046 в противоположность второму представленному в GenBank штамму В. thuringiensis NCTC 4042, чья последовательность, так же, как и последовательность второй группы исследуемых нами штаммов идентична В. anthracis
Как известно из литературных данных бактерии вида В. thuringiensis практически не разделяются фенотипически и достаточно сложно их разделить генотипически. Примером тому может служить проведенный нами анализ вариабельных 5 -концевых областей генов 16S и 23 S рРНК, а также спейсерной области 16S - 23 S рРНК. Все исследуемые штаммы В: thuringiensis разделились на две группы. Штаммы первой группы имеют последовательности генов 16S рРНК практически идентичные последовательностям В. anthracis и В. cereus, соответственно вторая группа штаммов примыкает к В. thuringiensis. Аналогичное разбиение, но с небольшими вариациями наблюдается и по 23 S рРНК. Внутри групп штаммы по последовательностям гипервариабельных участков рибосомных генов идентичны. Таким образом разделить их между собой данным методом практически невозможно.
Для выявления различий между столь близкими штаммами, был протестирован ряд KRP праймеров с целью отобрать те, которые для каждого из изучаемых штаммов давали бы специфичные ДНК-фингерпринты. Выбранные пары праймеров (KRP2-KRP10, KRP8 KRP10, KRPN2-KRPN10) были использованы для анализа штаммов В. thuringiensis с помощью метода DIR-ПЦР. Полученные спектры представлены на рисунках 22 a, b и 23.
Как видно из рисунка 22 a, b каждый из 13 штаммов имеет уникальный набор ПЦР-фрагментов. Причем имеются общие ПЦР-фрагменты, характерные для всех штаммов (например, фрагмент около 500 п.н. на рисунке 22 Ь) и индивидуальные минорные полосы, позволяющие разделять эти штаммы между собой.
Из анализа спектров видно, что штаммы, имеющие cryl гены, разбиваются на 2 группы по наличию общих полос в фингерпринтах. Первую группу составляют В. thuringiensis sbsp. thuringiensis ТО 1001, Я thuringiensis sbsp. toumanoffi B6021, В. thuringiensis sbsp. berliner 1715, B. thuringiensis sbsp. sotto B6026 и В. thuringiensis sbsp. cameroun B6775. Вторую группу образуют В. thuringiensis sbsp. galleria CB01/T4, В. thuringiensis sbsp. dendrolimus T04A001, B. thuringiensis sbsp. colmeri B6068 и В. thuringiensis sbsp. kurstaki B6066. Следует отметить, что такое разбиение соответствует группам по типу нуклеотидных последовательности 5 -концевой области гена 16S рРНК: первую группу, выделенную по ДНК-фингерпринтам, составляют те штаммы, у которых 5 -концевая область 16S рРНК полностью идентична последовательности 16S рРНК других В. thuringiensis, в том числе и штаммов из GenBank (приложение 2). Штаммы, у которых наблюдалась идентичность нуклеотидных последовательностей 16S рРНК с таковыми у В. anthracis и В. cereust по данным DIR-PCR вошли во вторую и третью группы.
