Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
Структура почвенного метагенома и методы ее изучения 9
Введение 9
1. Источники почвенной ДНК 13
2. Пространственная организация почвенного метагенома 17
3. Биоразнообразие почвенных микробных сообществ как результат воздействия селективных географических и физико-химических факторов среды 22
4. Влияние засоления на почвенное микробное сообщество 26
5. Современные филогенетические и таксономические аспекты исследования биоразнообразия 32
Глава 2. Объекты и методы исследования 48
1. Отбор почвенных образцов 48
2. Приготовление препарата почвенной ДНК
2.1. Выделение ДНК из почвы 52
2.2. Очистка препарата ДНК 3. Проведение количественной ПЦР 54
4. Секвенирование нуклеотидных последовательностей 55
5. Обработка результатов секвенирования 56
6. Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонных библиотек 57
7. Использование статистических крнитериев для оценки достоверности различий средних и дисперсий 59
Глава 3. Результаты и обсуждение 61
1. Анализ численности и общих показателей биоразнообразия микробных сообществ 61
2. Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях природного почвенного засоления 65
3. Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях искусственного почвенного засоления 71
4. Сравнительный анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях природного и искусственного почвенного засоления 75
5. Разработка новых подходов для анализа структуры и динамики микробиома 77
5.1.Выявление экологических групп галофильных, галотолерантных и негалофиль ных микроорганизмов 78
5.2. Разработка и использование модели таксономического пространства (ТП) для reHal6SpPHK 81
Выводы 98
Заключение 99
Список литературы 102
- Пространственная организация почвенного метагенома
- Современные филогенетические и таксономические аспекты исследования биоразнообразия
- Обработка результатов секвенирования
- Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях искусственного почвенного засоления
Введение к работе
Актуальность работы.
Долгое время изучение почвенных микробных сообществ было основано на выделении культур микроорганизмов с последующим изучением их свойств. При этом прямой подсчет клеток микроорганизмов в почве показал, что их число примерно на порядок превышает оценки численности, полученные с использованием методов культивирования. Анализ почвенной ДНК подтвердил наличие в почве большого числа некультивируемых микроорганизмов, доля которых может составлять до 90% от состава сообщества. Доступ к изучению некультивируемых микроорганизмов появился только с внедрением в микробиологическую практику молекулярно-генетических подходов (Rondon et al., 1999). Уже сейчас становятся очевидными перспективы применения этих методов в почвенной микробиологии. В первую очередь, это возможность более полного исследования почвенного микробиома, в перспективе включающее изучение свойств не только культивируемых, но и некультивируемых микроорганизмов, определение состава и функций почвенных микробных ассоциаций, выяснение объема и функциональной нагрузки почвенного микробного сообщества и его генетического потенциала.
В начале своего развития исследования почвенного микробиома были ограничены отсутствием эффективных методик секвенирования (Wooley et al., 2010), но с появлением методов секвенирования нового поколения (производительность которых сейчас достигает 1000 Gb/запуск) ситуация изменилась и на первый план вышли проблемы, связанные с анализом и биологической интерпретацией метагеномных данных (Sboner et al., 2011). Наиболее распространенным является использование стандартных экологических методов оценки биоразнообразия, включающих два аспекта: редукционистский, связанный с анализом встречаемости и функциональной нагрузки отдельных таксонов в пробах и холистический, основанный на определении интегральных характеристик сообщества (например, показателей «richness» - видовое богатство и «eveness» - выровненность разнообразия) и сравнительном анализе микробиомов (с использованием разнообразных методов многомерной статистики, в частности, кластерного анализа). Применение стандартных экологических методик к анализу метагеномных данных породило ряд проблем как в редукционистском, так и в холистическом подходах. В первом случае, обилие видов микроорганизмов в пробах (количество видов в 1 грамме почвы может исчисляться несколькими тысячами) значительно затрудняет работу со «списками организмов». Особенно остро эта проблема встает при проведении крупномасштабных мониторинговых исследований и исследований по биогеографии микроорганизмов (Fierer, 2008), где требуется анализ списков, содержащих несколько тысяч и сотен тысяч видов. Одним из решений может стать систематизация данных по биоразнообразию, позволяющая связать появление в «списках» тех или иных микроорганизмов с действием определенного экологического фактора.
Еще одной проблемой метагеномного анализа является наличие в «списках» большого количества неидентифицируемых последовательностей, доля которых может достигать 60% от состава ампликонной библиотеки (Sul et al., 2011). Единственным инструментом для работы с неидентифицируемыми последовательностями является их объединение в ОТЕ (Операционные Таксономические Единицы - аналоги биологических видов - группы последовательностей 16S рРНК, объединенные по установленному критерию гомологии, как правило 97%). После этой процедуры возможно проведение сравнительного анализ микробиомов по содержанию в них тех или иных ОТЕ. Для этого используются интегральные методы оценки биоразнообразия, главными из которых являются PCoA (Principal Components Analysis, англ. Метод Главных Компонентов) и кластерный анализ. Наряду с очевидными достоинствами имеющихся инструментов для интегральной оценки биоразнообразия (Lozupone et al., 2011), они имеют один существенный недостаток, связанный с обязательным использованием процедуры выравнивания нуклеотидных последовательностей, требующей больших временных затрат. Выравнивание последовательностей должно проводиться каждый раз при смене состава анализируемых образцов. Более того, если амплифицируемые фрагменты находятся в разных участках гена 16S рРНК, то их выравнивание в принципе невозможно. Это ограничивает использование кластерного анализа в серии независимых экспериментов (особенно если речь идет о сотнях и тысячах экспериментальных образцов). Поэтому возникла необходимость в разработке нового системного подхода к исследованию микробиома, который: 1) независим от наличия в пробах неидентифицируемых последовательностей 2) может быть использован для анализа данных из независимых экспериментов и 3) пригоден для описания структуры и динамики микробиомов.
Разработка новых подходов должна начинаться с исследования простых модельных систем. В нашей работе в качестве такой системы были выбраны микробные сообщества, находящиеся под воздействием одного из наиболее мощных экологических факторов - фактора засоленности (Lozupone et al., 2007).
Цель исследования. Разработать новые методы для анализа данных по таксономическому разнообразию микробных сообществ, полученных с использованием метагеномных технологий, на примере анализа модельных систем природного и искусственного почвенного засоления. Задачи работы:
-
На основе анализа данных пиросеквенирования библиотек гена 16S рРНК изучить изменение таксономической структуры почвенного микробиома вдоль градиента засоленности в условиях природного почвенного засоления;
-
Изучить изменение таксономической структуры почвенного микробиома в условиях искусственного засоления;
-
Выявить группы микроорганизмов, являющиеся маркерами процессов природного и искусственного засоления;
-
Разработать математические методы для анализа данных высокопроизводительного секвенирования, позволяющие провести
ранжирование микроорганизмов в соответствии с реакцией на действие засоленности и дать интегральную оценку структуры и динамики микробных сообществ. Научная новизна.
Впервые на основе анализа данных высокопроизводительного секвениро- вания описано изменение таксономической структуры метагенома микробного сообщества в условиях природного и искусственного почвенного засоления и выявлены кандидаты на роль индикаторов засоления - бактерий из сем. Bacil- laceae (Firmicutes) и пор. Sphingobacteriales (Bacteroidetes). Впервые предложены новые методы для анализа данных высокопроизводительного секвенирова- ния: 1) метод ранжирования микроорганизмов в соответствии с реакцией на засоленность, позволяющий выявить экологические группы галофильных, гало- толерантных и негалофильных микроорганизмов на уровне рода 2) метод математического моделирования динамики микробиомов в таксономическом пространстве гена 16S рРНК с вычислением интегральных параметров, описывающих их структуру (центральная точка) и динамику (вектор смещения центральной точки), позволяющих установить факт и определить направление сукцессии микробного сообщества.
Научно-теоретическая и практическая значимость исследования. Предложенные новые методы могут быть использованы для анализа структуры и динамики почвенного микробиома. Они будут востребованы во многих областях практической микробиологии. В природоохранной сфере станет возможным проведение масштабных мониторинговых исследований по действию основных биогенных и антропогенных экологических факторов на структуру почвенных микробоценозов, что будет способствовать развитию программ, направленных на сохранение их природного биоразнообразия. В сельскохозяйственной практике исследование почвенного микробиома будет способствовать поиску новых потенциально плодородных земель, в криминалистике - формированию базы микробиологических маркеров, позволяющих установить регион происхождения почвенного образца. Методы, разрабатываемые в диссертации реализуются в ряде научных проектов: «Метагеномный анализ микробиома как многофункционального высокоинтегрированного биосферного «интерфейса» (Программа поддержки фундаментальных исследований по приоритетным направлениям Санкт-Петербургского государственного университета), «Основные факторы, влияющие на формирование структуры почвенного микробиома по данным высокопроизводительного секвенирова- ния» (РФФИ, 12-04-01371-а), «Разработка метода массового метагеномного скрининга почв сельскохозяйственного назначения в целях оптимизации их использования» (ГК № 16.512.11.2132). Апробация работы.
Материалы диссертации опубликованы в 12 научных работах (из которых 8 статей и 3 тезиса). По результатам работы были сделаны сообщения на конференциях: VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 19-22 марта 2013 г., Москва, Россия (устный доклад), VI Всероссийской конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», 24-28 сентября 2012 г., Саратов, Россия (первая премия за устный доклад), школа- конференция для аспирантов AB-RMS («Адаптация к изменению климата в регионе Балтийского моря: вклад исследований из области растительной и микробной биотехнологии») 12-17 июля 2010 г., Миккеле, Финляндия, 4-й съезд европейского микробиологического общества 26-30 июня 2011 г., Женева, Швейцария, 14-й международный симпозиум по экологии микроорганизмов 19 - 24 августа 2012 г., Копенгаген, Дания.
Объем и структура диссертации.
Пространственная организация почвенного метагенома
В составе почвенного метагенома мы можем выделить как минимум 5 различных компонентов. Первый компонент включает ДНК физиологически активных клеток микроорганизмов. С ним тесно связан второй компонент, который включает ДНК временно неактивных (покоящихся) микрооганизмов. Оставшиеся три компонента - ДНК, содержащаяся в мертвых клетках, микробная ДНК, находящаяся в вирусных частицах и внеклеточная ДНК (Levy-Booth et al., 2007; Pietramellara et al., 2009), по всей видимости, составляют значительную, если не основную часть выделяемых из среды молекул ДНК. Было показано, что в отдельных случаях доля внеклеточной ДНК в почвенном ДНК экстракте может достигать 60% (Agnelli et al, 2004).
В литературе практически отсутствуют данные о составе этих пяти основных пулов почвенной ДНК. Поэтому на данном этапе мы можем только догадываться о возможных способах интеграции почвенного метагенома и о связанных с ними особенностях функционирования почвенных микробных сообществ. Одной из причин неполноты знаний в этом вопросе является отсутствие методик дифференцированного выделения почвенной ДНК.
В отличие от других местообитаний микроорганизмов (например, водных местообитаний), полная и, в особенности, дифференциальная экстракция почвенных нуклеиновых кислот представляет большую трудность из-за сильной адгезии молекул ДНК и самих клеток микроорганизмов на различных компонентах почвенного матрикса (Nielsen et al., 2006; Saeki et al., 2010; Bakken et al., 2006). Поиск эффективных методик выделения ДНК занимает значительную часть в современной почвенной микробиологии, о чем свидетельствует большое число публикаций по данному вопросу (Btirgmann et al, 2001; Sagova-Mareckova et al., 2008; Martin-Laurent et al. 2001; Robe et al. 2003). Главная дилемма, с которой сталкиваются авторы работ по выделению почвенной ДНК, это неспособность «мягких» процедур обеспечить выделение достаточного количества адсорбированной ДНК и отсутствие специфичности совместно с высокой степенью деградации генетического материала при использовании «грубых» методов экстракции с разрушением также спор бактерий. В ходе проведения ряда последовательных экстракций ДНК из различных типов почв (Feinstein et al., 2009), удалось показать, что полученные экстракты сильно различались по составу и соотношению в них основных бактериальных фил. Так, первая (наиболее щадящая) процедура экстракции давала на выходе препарат ДНК, в котором доминировали такие филы как Acidobacteria, Gemmatimonadetes и Verrucomicrobia, в то время как при последующих более «полных» экстракциях препарат ДНК содержал последовательности, принадлежащие филам Proteobacteria и Actinobacteria (Feinstein et al., 2009). Таким образом, на данный момент невозможно полностью разделить основные пулы почвенной ДНК.
Заметных успехов удалось достигнуть только в области изучения внеклеточной почвенной ДНК. Интерес к исследованию внеклеточной ДНК в почве был в значительной степени вызван процессами распространения генетических конструкций ГМО в природных популяциях почвенных микроорганизмов. Другой интригующей проблемой, связанной с изучением внеклеточной ДНК является изучение так называемой реликтовой ДНК и связанных с ней биологических процессов, происходивших на ранних стадиях биологической эволюции (Saeki et al., 2010). И наконец, сравнительно недавно было показано, что внеклеточная ДНК является одним из основных компонентов, выделяемых бактериальными клетками при формировании биопленок (Bockelmann et al., 2007, Chiang et al., 2010). Формирование биопленок является очень характерным именно для почвенных микроорганизмов, связи с неравномерным распределением в почве питательных веществ и связанных с этим процессов активной адгезии к почвенным частицам, а также с потребностью в более эффективном разложении сложных органических субстратов и совместной адаптации к стрессам.
На данный момент проведен целый ряд исследований по адсорбции ДНК в почве (Saeki et al., 2010; Cai et al., 2006) и ее перемещению по почвенным капиллярам (Ascher et al., 2005; Ceccherini et al., 2007), времени жизни почвенной внеклеточной ДНК (Romanowsky et al., 1992), а также исследования генетического переноса генов (в основном генов генетически модифицированных микроорганизмов) между различными группами почвенной микробиоты (Paget et al., 1998; Wackemagel, 2006).
По результатам проведенных исследований стало известно, что ДНК, высвобождающаяся из клеток микроорганизмов в почву, достаточно продолжительное время (до нескольких десятков лет) сохраняет свою целостность (Wackernagel, 2006; Cai et al., 2006). Это происходит за счет стабилизации внеклеточной ДНК на различных компонентах почвенного матрикса, в том числе на гуминовых веществах (Saeki и Kunito 2010; Cai et al., 2006).
ДНК может выделяться в почву не только пассивно после гибели клеток, но и активно за счет секреции клетками микроорганизмов. Так, Нильсену с соавторами (Nielsen et al., 2007) удалось показать, что значительное количество бактериальных изолятов могут выделять ДНК в чистых культурах, это свойство оказалось характерным для типичных почвенных бактерий, таких как, например, Pseudomonas и Azotobacter. Также было показано, что обнаруживаемая секреция ДНК усиливается при совместном культивировании с другими бактериями или эукариотами (Nielsen et al., 2007). Эти экспериментально полученные данные свидетельствуют в пользу интегративной функции внеклеточной ДНК в межвидовых взаимоотношениях почвенных про- и эукариот.
Количество внеклеточной ДНК в почве может значительно варьировать в зависимости от почвенного горизонта и типа почвы и составляет в среднем от 0,03 до 2 мкг на грамм сухой почвы. Интересные результаты были получены Агнелли с соавторами (Agnelli et al., 2004) при анализе DGGE профилей из различных горизонтов лесной почвы. Оказалось, что в отличие от общей почвенной ДНК, количество которой стабильно снижалось по мере движения от верхних к нижним почвенным горизонтам, количество внеклеточной ДНК было наибольшим в гумусо-аккумулятивном (А2) почвенном горизонте (Agnelli et al, 2004). Такое локальное накопление внеклеточной ДНК в горизонте А2 может быть связано как с более интенсивным использованием внеклеточной ДНК микроорганизмами в горизонте А1, так и, что более вероятно, с вертикальной миграцией внеклеточной ДНК и ее способностью к связыванию с компонентами гумуса. Таким образом, аккумуляция гумуса тесно связана с накоплением внеклеточной ДНК, что делает гумусовый гори 16 зонт зоной интенсивного накопления не только специфических органических компонентов, но и основной массы генетического материала почвы.
Современные филогенетические и таксономические аспекты исследования биоразнообразия
Из литературных данных нам удалось найти только одну работу, основанную на представлении данных матрицы генетических дистанций в многомерном пространстве. В работе, процесс эволюции нуклеотидных последовательностей представлен в виде дихотомически делящихся векторов (Рис. 6, А), ветвление которых происходит в трехмерном пространстве для описания элементарного эволюционного события (разветвление предковой линии на две дочерние). Для описания последующих ветвлений дочерних последовательностей осуществляется переход в пятимерное, семимерное и.т.д. пространство (угол между векторами равен 90). Т.е размерность пространства напрямую определяется числом ветвлений предковой последовательности. Таким образом, конечные точки векторов являются ныне существующими видами и определяют специфическое направление, обусловленное событиями прошлого их эволюционной истории. Положение отдельных видов в MVS (данный анализ проводился для гена гемоглобина «а» различных видов млекопитающих) определялось с использованием векторного анализа (введения «поисковых» векторов для выявления групп близкородственных видов и определения позиций их конечных точек в соответствии с генетическими дистанциями соответствующих нуклеотидных последовательностей).
Представление процесса эволюции нуклеотидных последовательностей в многомерном векторном пространстве. Иллюстрации из статьи Kitazoe et al., 2001.
При этом с увеличением количества анализируемых видов увеличивается и точность их взаимного расположения в векторном пространстве. По результатам проведенного анализа авторам удалось наглядно продемонстрировать наличие зау-ропсидной и теропсидной линий в эволюции позвоночных (Рис. 6, Б) (Kitazoe et al., 2001). Как видно из приведенного обзора, проблема расположения последовательностей в метрическом пространстве в соответствии с данными матрицы генетических дистанций является весьма сложной, поскольку целевое пространство является многомерным.
В своем исследовании Дольник с соавторами попытались решить эту проблему, посредством создания эволюционного пространства (ЭП) - метрического пространства, в котором нуклеотидные последовательности 16S рРНК представлены в виде точек, геометрические расстояния между которыми соответствуют генетическим дистанциям между данными последовательностями. Доказать многомерность данного пространства можно с использованием геометрических фигур, называемых симплексами (симплекс = n-мерный тетраэдр = n-мерное обобщение треугольника, рис. 7).
При анализе матрицы генетических дистанций мы часто сталкиваемся с ситуацией равенства генетических дистанций между последовательностями. Например, если мы имеем дело с тремя нуклеотидными последовательностями, разница между любой парой из которых составляет 2 нуклеотида, мы можем расположить их на плоскости в виде равностороннего треугольника. Если к этим последовательностям добавить четвертую, расстояние от которой до оставшихся трех также равняется 2 нуклеотидам, то для сохранения расстояний между последовательностями потребуется переход в трехмерное пространство, так как соответствующая геометрическая фигура является тетраэдром. Если число таких последовательностей увеличится до пяти, то потребуется переход в четырехмерное пространство и.т.д. (Рис. 7).
Для определения минимальной размерности пространства гена 16S рРНК нами был проведен анализ 210 651 последовательностей данного гена доступных на сервере базы данных SILVA. Максимальное число последовательностей, имеющих равные попарные генетические дистанции, оказалось равным 14, что соответствует симплексу с 14-ю вершинами, или 13D мерному метрическому пространству. Всего было обнаружено 25 вариантов наборов из 14-ти равноудаленных последовательностей (Дольник с соавт., 2012) (Рис. 8).
На рисунке 8 видно, что последовательности, образующие вершины всех этих симплексов довольно равномерно распределены между основными бактериальными филами. Наиболее разнообразным в таксономическом отношении оказался набор последовательностей для симплекса № 6 (Рис. 8), этот симплекс в дальнейшем использовался нами для определения координат точек ЭП. Алгоритм определения координат для каждой точки (нуклеотидной последовательности) в ЭП основан на измерении расстояния между картируемой последовательностью 16S рРНК и вершинами симплекса (Дольник с соавт., 2012). В результате проделанной работы было построено тринадцатимерное ЭП, в котором были определены координаты для всех 210 651 последовательностей. Перед описанием результатов данного исследования необходимо описать теоретическую структуру эволюционного пространства. В рамках ЭП эволюция последовательностей 16S рРНК пред 43 ставляет собой процесс постепенного заполнения теоретического пространства «возможностей» (пространства, в котором наряду с ныне существующими нуклео-тидными последовательностями могут быть отображены исчезнувшие, а также еще не появившиеся в ходе эволюции варианты гена 16S рРНК).
Обработка результатов секвенирования
Интересным представляется тот факт, что наиболее засоленный участок солончака (образец ТІ) характеризуется высоким показателем индекса Шеннона, сравнимым с таковыми для незаселенных участков (Табл. 3), что указывает на развитие в данном местообитании сообщества климаксного типа. Вопреки распространенному мнению о том, что экстремальные местообитания характеризуются низкими уровнями биоразнообразия (Fierer, 2008), сейчас появляется все больше свидетельств (к числу которых принадлежит и данное исследование) о способности почвенных микроорганизмов к формированию в этих местообитаниях полноценных (сравнимых по биоразнообразию с неэкстремальными местообитаниями) сообществ. Высокий уровень биоразнообразия в данном случае может быть связан с образованием резистентных к экстремальным условиям ассоциаций в составе биопленок.
Колебания в показателях биоразнообразия в переходной зоне (Т2, Т2-3, ТЗ, Т4, Т5) можно объяснить сменой растительного покрова на данных участках — более разнообразные растительные ассоциации (наибольшее число видов растений в солончаке было обнаружено на участке ТЗ, Табл. 2, глава «Материалы и методы») обеспечивают повышение уровня разнообразия в микробных сообществах, ассоциированных, прежде всего, с областью ризосферы. Уровень биоразнообразия достигал максимальных значений в незасоленных почвах в связи с размножением нега-лофильных микроорганизмов и развитием полноценных богатых в видовом отношении растительных ассоциаций.
Для всех образцов, помимо вычисления общих показателей биоразнообразия, проводили также оценку численности трех основных групп микроорганизмов - бактерий, грибов и архей по результатам проведения реакции количественной ПНР (Рис. 15, Табл. 3).
В настоящей работе мы использовали данный метод только для сравнительной оценки численности микроорганизмов в различных образцах почвы. Однако по полученным данным можно сделать выводы и об абсолютной численности микро 64 организмов. Известно, что число рибосомных оперонов в геномах различных видов микроорганизмов может варьировать в широких пределах (Acinas et al., 2004).
В базе данных rrnDB на сегодняшний день средняя копийность рРНК оперо-на составляет 4.09 для бактерий и 1.76 для архей (Ganley et al., 2007). Для грибов копийность рРНК-оперона в геноме может варьировать в широких пределах, для дрожжей это примерно 150 копий на геном (Ganley et al., 2007; Garber et al., 1988; Tsuchiya et al., 2001). Таким образом, для грубой оценки можно принять копийность рРНК-оперона у грибов за 100, т.е. если бы вся грибная популяция состояла бы исключительно из дрожжей, то ее численность составляла бы 1/100 от численности РНК-оперонов. Аналогичным образом были пересчитаны данные о численности бактериального сообщества (на Е. coli) и архейного сообщества (Н. salinarum).
Обращает внимание повышенное содержание архей в образце ТІ, который является наиболее засоленным, и постепенное снижение этого количества в ряду ТІ — Т5 со снижением степени засоленности. Наличие значительного количества архей в экстремальных местообитаниях, отмечается в основном для водных местообитаний и донных отложений (Ventosa et al., 2008; Oren, 2002), для засоленных почв такая картина является скорее исключением (Walsh et al., 2005). Но, стоит отметить, что описанные нами исследования по структуре микробных сообществ засоленных почв (см. главу «Обзор литературы»), к сожалению, не были подкреплены данными количественной ГТЦР. Единственным исключением была работа Хол-листер с соавторами (Ноllister et al., 2010), в которой авторы детектировали повышение (на 8%) содержания архей в наиболее засоленной и обводненной части солончака по сравнению с незасоленными почвами края трансекты. Данные результаты в целом являются сходными с полученными нами. Поэтому археи, хоть и не превышают по численности бактерий в засоленных почвах, могут составлять значительную часть микробного сообщества этих местообитаний. В целом, картина распределения численности микроорганизмов по образцам довольно равномерна (Рис. 15).
В опыте по искусственному засолению существенных колебаний в численности микроорганизмов не наблюдалось.
При анализе таксономической структуры микробиома на уровне домена было обнаружено, что абсолютное большинство в сообществе составляют бактерии. При этом количество архей уменьшалось по мере продвижения от незасоленных участков солончака к засоленным. Так, в наиболее засоленном образце ТІ доля бактерий составила 99,5%, а архей всего 0,5%. Низкая численность архей может объясняться двумя причинами: с одной стороны, для почвы, высокое содержание архей было отмечено только для местообитаний с максимально возможным уровнем засоленности, таких, например, как берега соленых источников (Walsh et al., 2005), при этом для засоленных местообитаний со сравнительно невысокими концентрациями солей (1 - 5%) в литературе отмечалось абсолютное преобладание бактерий (Hollister et al, 2010; Ventosa et al., 2008). С другой стороны, низкая численность архей может быть связана с наличием эффекта избирательной амплификации в мультиматричной ПИР (Polzand et al., 1998; Ishii et al., 2001; Acinas et al., 2005), связанного с различным сродством выбранных нами праймеров к последовательностям бактерий и архей (с предпочтительной амплификацией бактериальных последовательностей). В пользу этого факта говорит то, что при проведении количественной ПЦР (в которой использовались специфичные для архей праймеры), было показано увеличение численности архей в наиболее засоленном образце.
В ходе таксономического анализа нуклеотидных последовательностей на уровне филы во всех пробах были выявлены представители 21 бактериальных фил: Armatimonadetes, Acidobacleria, Aclinobacleria, Bacleroidetes, CCMllb, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, SBR1093, SPAM, TM7, Thermi, Verrucomicrobia, WS3 и двух археотных фил: Crenarchaeota и Euryarchaeota. Помимо бактерий с установленным систематическим положением, все пробы содержали большое количество неидентифицируемых на уровне филы последовательностей, доля которых варьировала от 2,1% (образец Т5) до 16,1% (образец ТІ). Для архей неидентифицируемых последовательностей обнаружено не было (Рис. 16).
Большое количество неидентифицируемых последовательностей было выявлено не только на уровне филы, но и на уровне семейства (Рис. 17). Из рисунка видно, что доля данных последовательностей возрастает при движении от незаселенных участков к засоленным, достигая максимума в образце ТІ. Это свидетельствует о том, что именно эти последовательности являются главными экологическими маркерами засоленных местообитаний.
Изменения в составе микробного сообщества заключались в постепенной смене соотношения основных бактериальных фил. Так, для наиболее засоленного участка солончака характерно доминирование бактерий из фил Proteobacteria, Firmicutes, Bacleroidetes и в меньшей степени филы Gemmatimonadetes при относительно малой доли представителей филы Actinobacteria (Рис. 16). Результаты, по
Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях искусственного почвенного засоления
Как в случае природного, так и в случае искусственного почвенного засоления в микробном сообществе засоленной почвы возрастает доля бактерий из фил Firmicutes и Bacteroidetes. При этом увеличивается доля бактерий из одних и тех же порядков и семейств. Так, для филы Bacteroidetes было отмечено повышенное содержание в засоленных образцах бактерий из порядка Sphingobactehales с присутствием общего для процессов искусственного и естественного засоления семейства Balneolaceae. Для филы Firmicutes как в образце ТІ, так и в образце НК было отмечено увеличение доли бактерий из порядка Bacillales, и в частности семейства ВасШасеае (Рис. 17, 20). Стоит отметить, что биоразнообразие в филах Firmicutes и Bacteroidetes в условиях искусственного засоления было заметно снижено (по сути, ограничивалось лишь перечисленными семействами) по сравнению с наиболее засоленным участком солончака, где были также обнаружены такие семейства как Alicyclobacyllaceae, Saprospiraceae. Rhodothermaceae и др. В обоих процессах при увеличении уровня засоленности происходила закономерная смена типичных почвенных актинобактерий (Rubrobacteriaceae и Solirubrobacteriaceae) на другие группы актинобактерий. более приспособленные к условиям засоления (неидентифици-руемых на уровне семейства актинобактерий из класса Actinobacteria в случае природного засоления и актинобактерии из сем. Nocardioidaceae и Streptomycetaceae в случае искусственного засоления).
На данный момент при анализе микробных сообществ наиболее распространенным является использование стандартных экологических методов оценки биоразнообразия. В общем виде методы оценки биоразнообразия включают два аспекта: редукционистский, связанный с анализом встречаемости и функциональной нагрузки отдельных таксонов в пробах, и холистический, основанный на определении интегральных характеристик сообщества (например, показателей «richness» -видовое богатство и «eveness» - выровненность разнообразия) и сравнительном анализе микробиомов (с использованием разнообразных методов многомерной статистики, в частности, кластерного анализа).
Как было показано в нашем исследовании, применение стандартных экологических методик к анализу метагеномных данных вызывает ряд проблем как в редукционистском, так и в холистическом подходах. В первом случае, обилие видов микроорганизмов в пробах (количество видов в 1 г почвы может исчисляться несколькими тысячами) значительно затрудняет работу со «списками организмов». Особенно остро эта проблема встает при проведении крупномасштабных мониторинговых исследований и исследований по биогеографии микроорганизмов (Fierer, 2008), где требуется анализ списков, содержащих несколько тысяч и сотен тысяч видов. Одним из решений может стать систематизация данных по биоразнообразию, позволяющая связать появление в «списках» тех или иных микроорганизмов с действием определенного экологического фактора.
Еще одной проблемой метагеномного анализа является наличие в «списках» большого количества неидентифицируемых последовательностей, доля которых может достигать 60% от состава ампликонной библиотеки (Sul et al., 2011). В нашем исследовании было показано увеличение доли неидентифицируемых последовательностей в сообществе с ростом засоленности, что указывает на их экологическую значимость. Неидентифицируемые микроорганизмы могут быть включены в анализ только при использовании интегральных методов оценки биоразнообразия, главными из которых являются PCoA (Principal Components Analysis, англ. Метод Главных Компонентов) и кластерный анализ. Данные методы, оперируя с матрицами, содержащими данные по биоразнообразию микробиомов, позволяют быстро проводить их сравнительный анализ, а в ряде случае оценивать динамику микробиомов (по перемещению образцов из одних кластеров в другие). Недостатком кластерного анализа является лежащая в его основе процедура выравнивания нуклеотидных последовательностей, которая занимает много времени и, вместе с тем, должна проводиться заново каждый раз при смене состава анализируемых образцов. Это ограничивает использование кластерного анализа в серии независимых экспериментов (особенно если речь идет о сотнях и тысячах экспериментальных образцов).
Поэтому возникла необходимость в разработке нового системного подхода к исследованию микробиома, который: 1) независим от наличия в пробах неиденти-фицируемых последовательностей 2) может быть использован для анализа данных из независимых экспериментов и 3) пригоден для описания структуры и динамики микробиомов. В последующих разделах нами будет предпринята попытка решить обозначенные проблемы традиционного анализа с использованием новых методов оценки биоразнообразия.
Использование традиционного редукционистского подхода, связанного с оценкой представленности таксонов в пробах, уже на уровне семейств сталкивается с определенными трудностями в описании биоразнообразия (количество не-идентифицируемых семейств во всех образцах достигало 137). Очевидно, что при увеличении числа образцов, а также при рассмотрении структуры микробиома на микробиологически более значимом уровне рода, сравнительный анализ таблиц представленности микроорганизмов в пробах становится неразрешимой задачей. В нашей работе впервые был предложен метод для упорядочивания данных таблицы представленности таксонов (родов микроорганизмов), посредством их ранжирования в соответствии с действием заданного экологического фактора.
По данным таблицы представленности были построены графики показывающие динамику численности отдельных ОТЕ (прошедших процедуру идентификации до уровня рода) во всех образцах. Оказалось, что закономерность в изменении представленности родов микроорганизмов в пробах не является монотонной (Рис. 23, а).
Поэтому, для выявления микроорганизмов, демонстрирующих тенденцию к увеличению/уменьшению численности с ростом засоленности, была проведена аппроксимация полученных графиков с использованием линейного уравнения вида у = ах + Ь, где у - доля микроорганизма в сообществе, х - засоленность почвы (значение электропроводности) (Рис. 22). В результате, все микроорганизмы были ранжированы по коэффициенту «а» и разделены на три группы, численность которых растет с увеличением засоленности (а 0, галофильные микроорганизмы), падает (а 0, негалофильные микроорганизмы) или остается постоянной (а = 0, галотоле-рантные микроорганизмы) (Рис. 23).
