Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Разнообразие и классификация хламидии 12
1.1. Общая характеристика представителей семейства Chlamydiaceae 12
1.2. Систематика хламидии 14
1.2.1. Развитие классификации 14
1.2.2. Современная классификация и таксономия представителей семейства Chlamydiaceae и их роль в развитии заболеваний 16
Глава 2. Современные методы выявления и типирования хламидии 22
2.1, Немолекулярные методы 22
2.1.1. Морфологические методы 23
2.1.2. Культивирование 23
2.1.3. Иммунологические методы 24
2.2. Молекулярно-генетические методы 28
2.2.1. Выбор генетических локусов для выявления представителей семейства Chlamydiaceae 30
2.2.2. Молекулярно-генетические методы, используемые для дифференциации видов Chlamydiaceae 35
Глава 3. Материалы и методы исследования 45
3.1. Характеристика штаммов ..45
3.2. Модельные и клинические образцы, использованные для оптимизации ПЦР и выявления хламидии 45
3.3. Выделение ДНК для ПЦР 47
3.3.1. Быстрое выделение ДНК с использованием Chelex-100 „47
3.3.2. Выделение ДНК с использованием протеиназы К 47
3.3.3. Выделение ДНК с помощью сорбционного метода 47
3.4. ПЦР-амплификация фрагмента генаотирЛ 48
3.5. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей амплификационных фрагментов отрА различных видов Chlamydiaceae...49
3.6. Получение гетерогенного внутреннего стандарта ПЦР 51
3.7. Электрофоретическое разделение амплификационных фрагментов отрА в присутствии бисбензимида-ПЭГ 53
3.8. ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I и анализ кривых плавления 53
3.9. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени с использованием зондов TaqMan-типа (5 -экзонуклеазный метод) 54
3.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 55
Глава 4. Результаты и обсуждение 57
4.1. ПЦР-амплификация и анализ фрагмента последовательности от различных видов хламидий 57
4.1.1. Выбор праймеров и оптимизация ПЦР 57
4.1.2. Клонирование амплификационных фрагментов отрА и характеристика их нуклеотидных последовательностей 59
4.2. Разработка и получение внутреннего стандарта ПЦР 62
4.3. Дифференциация представителей Chlamydiaceae путем электрофоретического разделения в геле с добавлением бисбензимида-ПЭГ .65
4.4. Выявление и типирование представителей семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления с SYBR Green I 72
4.5. Идентификация Chlamydia spp., Chlamydophilapneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов с помощью мультиплексной TaqMan ПЦР в режиме реального времени 75
4.6. Анализ чувствительности и специфичности разработанных методов при исследовании клинических образцов 80
Заключение 85
Выводы 90
Практические рекомендации 91
Литература 93
- Современная классификация и таксономия представителей семейства Chlamydiaceae и их роль в развитии заболеваний
- Выбор генетических локусов для выявления представителей семейства Chlamydiaceae
- Клонирование амплификационных фрагментов отрА и характеристика их нуклеотидных последовательностей
- Выявление и типирование представителей семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления с SYBR Green I
Введение к работе
Микроорганизмы семейства Chlamydiaceae являются облигатными внутриклеточными паразитами и вызывают ряд заболеваний человека и животных, известных под общим названием «хламидиозы». Для многих хламидий характерна высокая видоспецифичность, однако некоторые виды Chlamydiaceae имеют широкий круг естественных хозяев, включающий представителей нескольких классов позвоночных животных. Наиболее распространенные хламидийные инфекции человека, вызываемые Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR) носят антропонозный характер. Другие виды хламидий являются причиной зоонозных заболеваний [99, 111]. Хламидиозы характеризуются разнообразием клинических симптомов, могут протекать латентно или сопровождаться тяжелыми поражениями различных органов и систем. Характер и степень выраженности заболевания определяются принадлежностью возбудителя к определенному виду, биовару или серовару, поскольку многие штаммы хламидий проявляют тканеспецифичность, а также особенностями организма хозяина [29, 31, 66, 73, 107].
С trachomatis, открытая раньше других хламидий, в настоящее время рассматривается как самый распространенный бактериальный возбудитель заболеваний, передающихся половым путем. По данным ВОЗ, количество инфекций, вызываемых С. trachomatis во всем мире, ежегодно составляет около 90 млн. случаев [84, 170]. При этом почти у 75% женщин и 50% мужчин урогенитальный хламидиоз протекает бессимптомно, что значительно усложняет эпидемиологический надзор за ним [2, 48]. В то же время данное заболевание является частой причиной бесплодия, невынашивания беременности и может сопровождаться различными экстрагенитальными поражениями [6, 204]. Помимо инфекций, передающихся половым путем, С. trachomatis вызывает эндемичную трахому (хронический кератоконъюнктивит) - заболевание, особенно широко
представленное в развивающихся странах Азии, Африки, Южной Америки и являющееся одной из наиболее частых причин потери зрения [3, 105].
С. pneumoniae известна в основном как возбудитель заболеваний респираторного тракта, на долю которого приходится от 10 до 20% пневмоний и 5%-15% случаев бронхитов и синуситов [11, 89]. Кроме того, многие исследования, проведенные в последнее время, свидетельствуют о вероятной взаимосвязи между хронической инфекцией, вызванной С. pneumoniae, и развитием некоторых неинфекционных заболеваний, например, атеросклероза [10, 67], бронхиальной астмы [121] и некоторых заболеваний центральной нервной системы [26, 220].
Значительно большую группу представляют виды семейства
Chlamydiaceae, патогенные для животных [5]. Хламидийные инфекции
наносят существенный экономический ущерб различным отраслям
животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, аборты, рождение
мертвого или нежизнеспособного приплода [7]. Так, ежегодные потери от
хламидиозов в сфере животноводства в Великобритании составляют 25 млн.
евро [23]. Некоторые виды возбудителей хламидиозов домашних и
сельскохозяйственных животных, например, Chlamydophila psittaci,
Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis, представляют угрозу
спорадических заболеваний людей, особенно лиц, профессионально занятых в сельском хозяйстве [99, 111]. Возможные пути передачи и опасность для человека других видов хламидий, вызывающих инфекции животных, до сих пор недостаточно изучены из-за отсутствия эпидемиологических данных. В связи с этим программа «Хламидиозы животных и опасность зоонозных заболеваний» Европейского сотрудничества в области научных и технических исследований (COST) уделяет первостепенное внимание разработке эффективных методов выявления хламидий [23].
Несмотря на разнообразие существующих диагностических методов, проблема идентификации представителей семейства Chlamydiaceae остается чрезвычайно актуальной. Культуральный метод, ранее рассматриваемый как
«золотой стандарт», представляет собой трудоемкий и длительный процесс, требующий использования нескольких клеточных линий для поддержания роста различных видов, и доступный лишь немногим лабораториям [120, 204]. Серологические методы, вследствие перекрестной реактивности основных антигенных детерминант хламидий, а также особенностей формирования иммунного ответа, недостаточно специфичны [85, 141, 154].
В последние годы интенсивно разрабатываются молекулярно-генетические методы обнаружения и типирования хламидий на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Значение этих методов существенно возросло в связи с накоплением данных о биологическом разнообразии представителей семейства Chlamydiaceae и фундаментальными изменениями их классификации, в основу которой положены принципы современной геносистематики [71, 73, 74, 210]. ПЦР широко используется для выявления отдельных видов хламидий и, прежде всего, С. trachomatis. В то же время, известные в настоящее время универсальные методы типирования хламидий с использованием ПЦР являются недостаточно чувствительными для их прямого обнаружения в клиническом материале или требуют использования трудоемких процедур анализа продуктов ПЦР [100, 165, 218]. Ни в одном из описанных в настоящее время методов ПЦР для универсального обнаружения представителей семейства Chlamydiaceae не предусмотрена возможность использования внутреннего стандарта, который позволяет выявлять ингибирование реакции.
Таким образом, широкий спектр заболеваний, вызываемых представителями семейства Chlamydiaceae, особенности течения хламидиозов человека и животных с часто сходной, но не всегда типичной клинической картиной, а также сложность идентификации хламидий с помощью стандартных подходов, обуславливают необходимость разработки универсальных методов обнаружения и типирования возбудителей данной группы.
Современная классификация и таксономия представителей семейства Chlamydiaceae и их роль в развитии заболеваний
Род Chlamydia до недавнего времени включал все известные виды хламиди й. В соответствии с измененной классификацией виды Chlamydia pneumoniae\ Chlamydia psittaci и Chlamydia pecorum выделены в отдельный род Chlamydophila. Типовым представителем рода Chlamydia по прежнему является С. trachomatis. Два новых вида С. muridarum и С. 5«и, вошедших в род Chlamydia, проявляют большее генетическое ( 97 % гомологии по последовательности 16S и 23 S рРНК генов) и фенотипическое сходство с С. trachomatis по сравнению с другими представителями семейства Chlamydiaceae. Большинство штаммов Chlamydia обладают сходными по структуре внехромосомными элементами. Важнейшей фенотипической особенностью представителей этого рода является способность накапливать гликоген в РТ, который легко выявляется при окрашивании включений йодом [83]. Разные штаммы Chlamydia способны образовывать различные по морфологии включения, а также отличаются по уровню природной чувствительности к сульфадиазину и тетрациклину [168]. Представителей рода Chlamydia легко идентифицировать и отличить от других видов при анализе последовательностей генов рРНК или спейсерного участка 16S-23S рРНК [71]. Изученные в настоящее время геномы Chlamydia spp. имеют размер около 1,0 - 1,1 тпн и содержат 2 копии рибосомного оперона, которые могут быть полностью идентичны, или отличаться единичными нуклеотидными заменами [14, 20, 68]. Типовым видом для данного рода является С. trachomatis.
Согласно новой классификации, вид С. trachomatis объединяет штаммы, патогенные прежде всего для человека. Различные штаммы С. trachomatis вызывают трахому, урогенитальные заболевания, некоторые формы артрита, конъюнктивит и пневмонию у новорожденных [3, 9, 220]. Восемнадцать сероваров С. trachomatis объединены в два биовара: трахома (серовары: А - К, Ва, Da и 1а) и венерическая лимфогранулема (LGV серовары: LI, L2, L2a и L3) [28, 143]. Четкое деление биоваров в пределах вида основано на различиях в характере роста микроорганизмов в культуре клеток или при заражении лабораторных животных, а также патогенности штаммов. Тем не менее, определенные молекулярно-генетические особенности, на основании которых можно было бы разделить биовар трахомы и биовар лимфогранулемы, до настоящего времени не выявлены [77]. Для С. trachomatis характерна высокая внутривидовая консервативность генов 16S рРНК - уровень их дивергенции не превышает 0,65 % у множества исследованных штаммов. Различия в структуре отдельных участков МОМР, как важнейшей антигенной детерминанты, наиболее часто используются для дифференциации сероваров [28]. Важной характеристикой С. trachomatis является наличие экстрахромосомных генетических элементов. Криптические плазмиды (рСТ), выделенные у отдельных штаммов С. trachomatis, проявляют исключительную консервативность последовательностей. Следует, однако отметить сообщения о существовании бесплазмидных штаммов, относящихся к разным сероварам [16, 17, 137, 138]. Chlamydia muridarum (от лат. сем. Muridae), ранее рассматриваемый как третий биовар С. trachomatis (МоРп - mouse pneumonitis), является возбудителем заболеваний грызунов семейства Muridae. Два штамма этого вида были выделены у мышей (МоРп) и хомяков (SFPD) [79, 147]. Анализ последовательностей отрЛ, а также способности связывания МоРп и SFPD со специфическими антителами к МОМР С. trachomatis свидетельствует о сходстве антигенной структуры этих видов. Штамм МоРп содержит плазмиду рМоРп. Экспериментально было показано, что штаммы МоРп и SFPD продуцируют гликоген [143]. Chlamydia suis (от лат. род. Sus) впервые была выделена у Sus scrofa (кабан или дикая свинья). Представители этого вида животных в настоящее время являются единственным природным резервуаром С. suis, что свидетельствует об его исключительной видоспецифичности [179, 197, 221]. Различные штаммы С. suis вызывают конъюнктивит, энтерит и пневмонию у животных. Внутривидовые различия в последовательности генов 16S рРНК составляют менее 1,1%, однако для разных штаммов С. suis характерна большая вариабельность нуклеотидных последовательностей отрА по сравнению с другими видами Chlamydia. У некоторых штаммов выявлена повышенная резистентность к сульфадиазину и тетрациклину [21, 173, 179], Род Chlamydophila составляют описанные еще до 1993 г. виды C.psittaci, С.pneumoniae и С.ресогит, а также Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae и Chlamydophilafelis, которые были выделены в самостоятельные виды из C.psittaci [73]. Выделение вышеназванных видов в отдельный род обусловлено значительными генетическими и фенотипическими различиями между Chlamydophila и Chlamydia. Геномы представителей рода Chlamydophila больше геномов Chlamydia spp. примерно на 100-200 пн, и содержат только один рибосомный оперон [82, 182]. Характерной особенностью представителей рода Chlamydophila является их неспособность продуцировать гликоген. В то же время, все представители этого рода проявляют сходство в структуре различных генов, включая гены рибосомного оперона (идентичность в последовательности генов 16S рРНК и 23S рРНК составляет более 95%) и белков наружной мембраны (ртрЛ, отр2) [37, 71]. Типовой представитель рода -Chlamydophilapsittaci [73].
Chlamydophila ресогит (прежнее название — Chlamydia ресогит) является исключительно возбудителем заболеваний животных [81]. Несколько штаммов С. ресогит были выделены у сумчатых (коала), жвачных млекопитающих (коров, овец, коз) и свиней. У коал этот возбудитель вызывает бесплодие, заболевания мочевыводящей и репродуктивной системы. У других видов животных, инфицирование С.ресогит может приводить к абортам, развитию конъюнктивита, энцефаломиелита, пневмонии и полиартрита [22, 114]. Штаммы С.ресогит характеризуются высокой внутривидовой консервативностью рибосомных генов (различия в последовательности 16S рРНК составляют менее 0,6%). У двух штаммов обнаружены плазмиды [22]. В экспериментах на мышах продемонстрирована неинвазивность штаммов С. ресогит [171, 172].
Выбор генетических локусов для выявления представителей семейства Chlamydiaceae
Выбор локуса для генодиагностики возбудителей инфекционных заболеваний определяется множеством факторов, среди которых наибольшее значение имеют: наличие данных о нуклеотидной последовательности локуса, ее специфичности и изменчивости у различных штаммов, а также копийность искомой последовательности в геноме возбудителя. Для универсального выявления и дифференциации микроорганизмов, относящихся к определенной таксономической группе, важнейшим условием является наличие у всех представителей таксона искомого локуса, который содержит в своей структуре как высоко консервативные, так и отличительные участки последовательности.
В настоящее время опубликованы данные о полной нуклеотидной последовательности геномов С. trachomatis серовара D [191], С. muridamm [166], трех штаммов С. pneumoniae [112, 166, 186] и штамма GPIC С. caviae [167], практически завершена расшифровка геномов C.felis и С. abortus [75]. Однако, лишь для небольшого числа локусов накоплена информация о вариабельности нуклеотидной последовательности у различных штаммов. К числу наиболее изученных относятся гены 16S, 23 S рРНК, расположенная между ними спейсерная последовательность (16S-23S), гены основных белков наружной мембраны (отрА и отр2), а также криптическая плазмида С. trachomatis. Именно эти последовательности чаще всего используются в качестве мишеней для выявления хламидий. Идентификация других ДНК-мишеней, например, генов полиморфных мембранных белков (ртр), описана в единичных публикациях [124, 146].
Хламидийные плазмиды были впервые описаны М. Lovett и соавт. в 1980 г. у С. trachomatis и штамма, ранее относившегося к C.psittaci [128]. Впоследствии были получены данные о полной нуклеотидной последовательности плазмид С. trachomatis сероваров В [188], L2 [52, 95], L1 [202] и D [51]. Согласно уточненным данным М. Comanducci и соавт. [52], а также N. Thomas и I. Clarke [202], плазмиды всех штаммов С. trachomatis имеют размер около 7,5 тпн,, содержат 8 открытых рамок считывания, предположительно кодирующих белки с молекулярной массой 11 кДа, и характеризуются высокой степенью консервативности нуклеотидной последовательности ( 98%). Плазмиды других видов Chlamydiaceae имеют сходную организацию, но проявляют сравнительно низкий уровень гомологии по данным гибридизации и анализа последовательностей: 80% -между штаммами С. trachomatis L1 и С. muridarum МоРп; 69% - между С. psittaci А1 и С. pneumoniae Equine, и всего 60% - между представителями родов Chlamydia и Chlamydophila [203]. Копийность плазмиды С. trachomatis доставляет 7-10 копий/геном [200]. Таким образом, использование в качестве мишени плазмидных локусов, в частности, в большинстве коммерческих молекулярно-диагностических систем, применяемых в настоящее время для выявления С. trachomatis, позволяет добиться исключительной чувствительности метода. Вместе с тем, отсутствие плазмид у многих видов хламидий, а также у отдельных изолятов С. trachomatis (Табл. 1) исключает возможность применения плазмидных последовательностей в качестве универсальных мишеней для обнаружения Chlamydiaceae.
Геномы Chlamydia spp. и Chlamydophila spp. содержат по две и одной копии рибосомньгх генов, соответственно. В целом, гены рРНК различных видов Chlamydiaceae характеризуются высокой консервативностью: различия в полной нуклеотидной последовательности не превышают 7% для 16S и 9% для 23S рРНК (Табл. 4).
Амплификация и анализ генов 16S [37, 73, 163], 23S [71, 74] и 16S-23S спейсерной последовательности [129, 132] широко используются для дифференциального детектирования хламидий, поскольку именно различия в структуре рибосомньгх генов положены в основу современной геносистематики микроорганизмов. В то же время, универсальность рибосомных генов у всех прокариот может являться причиной неспецифического детектирования, например в результате перекрестного выявления ДНК микоплазм [72].
Наличие выраженной вторичной структуры рибосомных генов зачастую снижает чувствительность обнаружения, что является дополнительным ограничением для их выбора в качестве мишеней [130]. Выявление и анализ генов, кодирующих основные структурные компоненты клеточной стенки, например, МОМР и 60-кДа богатый цистеином белок, которые являются специфичными для Chlamydiaceae и не имеют гомологов у других микроорганизмов, представляется в связи с этим наиболее перспективным.
Клонирование амплификационных фрагментов отрА и характеристика их нуклеотидных последовательностей
Согласно проведенному нами анализу, различия в последовательностях исследуемого фрагмента составляют от 24,6 до 30% между видами Chlamydia и Chlamydophila. При этом, различия между видами внутри рода Chlamydia не превышают 6,1%. Для С. trachomatis характерна наибольшая вариабельность последовательности между отдельными штаммами - до 1,7%. Штаммы биовара венерической лимфогранулемы (серовары L1 и L2) являются полностью идентичными и проявляют 98,3-99,1% гомологии со штаммами биовара трахомы. Штаммы С. muridarum SFPD и MoPn также являются идентичными по последовательности анализируемого участка, но отличаются от С. trachomatis и С. suis в среднем на 5,6 и 4,1%, соответственно. В свою очередь различия между С. suis и штаммами С. trachomatis составляют от 3,3% (биовар «трахома») до 4,5% (биовар «лимфогранулема»). Установленная нами нуклеотидная последовательность С. suis S45 полностью совпадает с короткими (127-157 пн) 3 -концевыми последовательностями анализируемого участка у штаммов S45, Н5, R19, pm220, PCLH296, pmdl340, pmsh47 и рт197 (GenBank № AF269274, AF269275, AF269270, AJ005616, AJ004880, AJ004879, AJ004878, AJ004877), описанными ранее.
Межвидовые различия в пределах рода Chlamydophila выражены в большей степени - до 20,6% между С. cavia и С. ресогит. Следует однако отметить, что все штаммы C.psittaci и С. abortus проявляют 100% идентичность по нуклеотидной последовательности 5 -концевого фрагмента отрА, вследствие чего не могут быть дифференцированы на основании анализа исследуемого участка генома. Два других вида - С. felis и С. cavia, ранее входившие в группу Chlamydia psittaci, проявляют, соответственно, 97,6 и 98% гомологии со штаммами, относящимися к C.psittaci согласно новой классификации. С. pneumoniae отличается от видов данной группы приблизительно на 15,5%. Выделенные у человека штаммы С. pneumoniae чрезвычайно сходны по последовательности амплифицируемого участка (99,6-100%) и отличаются от биовара Koala делецией и заменой одного нуклеотида в некодирующей области (0,8% различий). Согласно результатам проведенного нами секвенирования, штаммы С.ресогит формируют генетически наиболее удаленную группу, в среднем отличаясь по последовательности фрагмента отрА от С. pneumoniae и 4 видов, выделенных из C.psittaci, на 17,5 и 19,7% соответственно. Вариабельность данной последовательности у 4 исследованных штаммов составила от 0,4 до 1,6%. При этом установлено полное совпадение коротких (131 пн) 3 -концевых фрагментов последовательности описанных ранее (GenBank № AF269280, AF269279) и полученных для штаммов L71 и 1710S. Два других исследованных штамма: 66р130 и LW613, последовательности которых были исследованы впервые, отличаются делецией одного нуклеотида и наиболее близки по структуре 3 -концевого фрагмента изоляту Р787 (GenBank № Z18756).
В целом, результаты филогенетического анализа, проведенного на основании сравнения последовательностей 5 -концевого участка отрА, хорошо коррелируют с данными К. Everett и соавт. [73] по сравнению последовательностей генов 16S и 23 S рРНК, положенными в основу современной систематики хламидий. Выбранный фрагмент генома, фланкированный участками связывания праймеров СМ1 и СМ2, отличается высокой внутривидовой консервативностью (98,3-100% гомологии для каждого вида). В то же время, выраженные различия в его структуре между видами позволяют рассматривать его в качестве перспективной мишени для детектирования и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.
Внутренний стандарт (ВС), применяемый для контроля ингибирования ПЦР, представляет собой синтетическую полинуклеотидную последовательность, которая амплифицируется с помощью выбранных праймеров подобно ДНК-мишени, но отличается от нее по протяженности и/или внутренней последовательности, используемой для ее распознавания. В настоящее время рекомендуется введение ВС во все ПЦР тест-системы, применяемые для обнаружения ДНК различных возбудителей непосредственно в клиническом материале [159]. При использовании ВС, результат ПЦР оценивается как положительный в случае, если наблюдается амплификация ДНК-мишени независимо от детектирования ВС. Амплификация ВС, но не целевой ДНК, характеризует истинно отрицательный результат ПЦР, тогда как отсутствие амплификации ВС и целевой ДНК свидетельствует об ингибировании реакции. На основании компьютерного анализа нуклеотидной последовательности фага X (GenBank № J02459) нами выбран сегмент ДНК между нуклеотидными позициями 32460 и 32760 для создания на его основе гетерогенного ВС. Выбранный сегмент был искусственно фланкирован сайтами связывания праймеров СМ1 и СМ2 путем ПЦР-амплификации X ДНК с помощью гибридных праймеров, содержащих 3 -концевые А специфические последовательности и участки, гомологичные СМ1 и СМ2 на 5 концах. Полученный таким образом ВС удовлетворяет следующим заданным критериям: 1) обладает большей молекулярной массой (341 пн) по сравнению с амплификационными фрагментами отрА различных видов хламидий (245-259 пн), что позволяет разделять их с помощью гель электрофореза; 2) характеризуется несколько большей G/C-насыщенностью (50,4%) и температурой плавления (88С) по сравнению с ПЦР-фрагментами отрА (42,8-46,3% и 82,6-86,1 С), благодаря чему может быть дифференцирован при анализе кривых плавления продуктов ПЦР; 3) не содержит прямых или инвертированных повторяющихся последовательностей, препятствующих амплификации.
Выявление и типирование представителей семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления с SYBR Green I
Параллельно с разработкой метода электрофоретического анализа амплификационных фрагментов отрА нами была исследована возможность выявления и типирования представителей семейства Chlamydiaceae с помощью методов ПЦР в режиме реального времени. Введение в состав ПЦР-смеси интеркалирующего флуоресцентного красителя - SYBR Green I и модификация температурного режима реакции позволили разработать протокол одновременной амплификации и анализа продуктов ПЦР в формате закрытой пробирки.
В ходе оптимизации ПЦР было показано, что добавление интеркалирующего красителя в минимальных концентрациях требует увеличения числа амплификационных циклов по сравнению со стандартным протоколом для обеспечения чувствительного ( 10 копий) детектирования ДНК-мишени. При этом амплификация без горячего старта приводит к накоплению на поздних циклах неспецифических низкомолекулярных продуктов, характеризующихся низкой температурой плавления. В связи с этим для обеспечения специфического и чувствительного детектирования ДНК хламидий был использован режим ПЦР с горячим стартом (Hot-Start PCR) и регистрация флуоресценции SYBR Green І в последовательных циклах ПЦР при температуре максимально близкой к температуре плавления амплификационных фрагментов отрА (82С).
Чувствительность и специфичность окончательного варианта амплификации с SYBR Green I были идентичны таковым для стандартного метода ПЦР с электрофоретическим детектировании ем продуктов. Отсутствие неспецифических продуктов амплификации ДНК человека и неродственных микроорганизмов, а также соответствие ПЦР-фрагментов отрА и ВС ожидаемой молекулярной массе подтверждено результатами их анализа с помощью гель-электрофореза. Сравнение значений пороговых циклов (Ct) свидетельствует о приблизительно одинаковой эффективности амплификации клонированных фрагментов отрА всех 9 видов хламидий с помощью праймеров СМ1 и СМ2 при равной стартовой концентрации плазмид. На рисунке 10 представлены нормализованные кривые изменения флуоресценции SYBR Green І в последовательных циклах ПЦР.
Поскольку увеличение флуоресценции может быть связано с амплификацией не только хламидийной ДНК, но и ВС, постамплификационный анализ кривых плавления ПЦР продуктов является необходимым для правильной оценки результатов. Различия в температурах плавления ВС и ПЦР-фрагментов отрА различных видов Chlamydiaceae (88С против 82,6-86,1 С) позволяют проводить их дифференциацию. При этом кривые плавления хламидийных ампликонов характеризуются наличием двух пиков, отражающих двухэтапную диссоциацию цепей ДНК в участках с разной А/Т-насыщенностью, а их принадлежность к определенной группе может быть установлена путем сравнения пиков плавления: 84,1 С и 86,1 С - для С. trachomatis, С. suis, С. muridarum; 82,6С и 85,1 С - для С.pneumoniae, С.рєсогит; 84,4С и 85,5С (неразделенные или частично разделенные пики) — С. psittaci, С. abortus, C.felis и С. caviae (Рис. 11).Анализ кривых плавления амплификационных фрагментов отрА не является способом видовой идентификации хламидий, поскольку некоторые виды характеризуются сходными или неразличимыми профилями плавления. К их числу относятся виды Chlamydia (Рис. 11Б), С. pneumoniae и С ресогит (Рис. 11В), а также виды, ранее входившие в группу Chlamydia psittaci (Рис. 11 Г). Тем не менее, данный подход позволяет дифференцировать основные группы патогенных для человека хламидий: 1) С. trachomatis, 2) С. pneumoniae и 3) возбудителей зоонозных инфекций (С psittaci, С. abortus, С. felis). Метод ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I обладает достаточной чувствительностью и специфичностью для прямого обнаружения различных видов хламидий в образцах клинического материала, полученного от человека и животных. Благодаря детектированию в формате закрытых пробирок и отсутствию необходимости постамплификационных манипуляций с продуктами ПЦР, этот подход позволяет существенно сократить продолжительность и трудоемкость исследований, практически исключает риск появления ложноположительных результатов вследствие контаминации продуктами ПЦР. Кроме того, при наличии соответствующего оборудования данный метод является более экономичным по сравнению с традиционным электрофоретическим анализом продуктов ПЦР.
С целью дифференциального обнаружения представителей семейства Chlamydiaceae, включая все патогенные для человека виды, разработан альтернативный метод ПЦР в режиме реального времени на основе технологии мультиплексной TaqMan ПЦР или 5 -экзонуклеазный метод. Предложенный подход предполагает возможность универсальной амплификации фрагмента гена отрЛ, фланкированного участками связывания праймеров СМ1-СМ2, и селективного выявления в одной пробирке Chlamydia spp., С pneumoniae, возбудителей зоонозных инфекций (C.psittaci, С abortus, C.felis) и ВС с помощью зондов, содержащих различные флуоресцентные метки.
Анализ большого числа известных к началу исследования нуклеотидных последовательностей отрА позволил выбрать участки связывания зондов в районе первого консервативного домена ompAt обладающие 100% идентичностью и, одновременно, специфичностью для каждой группы выявляемых видов (Рис. 12).
