Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 - Обзор литературы 10
1.1 - Люминесцирующие бактерии: систематика, экология, молекулярно-генетическая характеристика 10
1.2 - Прикладные аспекты использования бактериальной биолюминесценции 25
Глава 2 - Материалы и методы исследований 41
2.1- Используемые биолюминесцентные системы 41
2.1.1 — Природный и рекомбинантный люминесцирующие бактериальные биосенсоры 41
2.1.2 - Ферментная система генерации свечения 43
2.2 - Исследованные минеральные воды 44
2.2.1 - Общая характеристика минеральных вод 44
2.2.2 - Методы исследования ионного состава минеральных вод 49
2.3 -Методы биолюминесцентного биотестирования 51
2.3.1 — Биотестирование с использованием бактериального биосенсора «Микробиосенсор В-17 677f» 52
2.3.2 - Биотестирование с использованием бактериального биосенсора «Эколюм-9» 54
2.3.3 - Исследование с использованием комплекта реактивов для биолюминесцентного анализа (КРАБ) 55
2.3.4 - Регистрация биолюминесценции используемых бактериальных биосенсоров и ферментной системы генерации свечения 56
2.3.5 - Обработка, оценка и оформление результатов 57
2.4 - Дополнительные методы исследования 60
2.5 - Методы статистической обработки результатов и математического моделирования 65
Глава 3 - Исследование биотоксичности бутилированных минеральных вод с использованием традиционных методов биолюминесцентного анализа 67
Глава 4 - Экспериментальное изучение влияния основных, входящих в состав минеральных вод, катионов и анионов на уровень свечения люминесцирующих микроорганизмов и ферментной системы генерации свечения 75
4.1 - Исследование эффектов катионов К+, Na+, Mg2+ или Са2+ на бактериальную биолюминесценцию in vivo и in vitro 76
4.2 - Изучение влияния галогенидов, сульфатов, гидрокарбонатов и карбонатов на биолюминесценцию in vitro и in vivo 89
Глава 5 - Разработка подходов к адаптации биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности минеральных вод 103
5.1 - Идентификация причин, определяющих эффекты минеральных вод в отношении люминесцирующих бактериальных биосенсоров 104
5.2 - Адаптация биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности минеральных вод 109
Заключение 128
Выводы 133
Список использованной литературы 135
- Прикладные аспекты использования бактериальной биолюминесценции
- Общая характеристика минеральных вод
- Изучение влияния галогенидов, сульфатов, гидрокарбонатов и карбонатов на биолюминесценцию in vitro и in vivo
- Адаптация биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности минеральных вод
Введение к работе
Актуальность темы
Бактериальные люминесцирующие биосенсоры в настоящее время стали одним из распространенных инструментов оценки качества питьевых, поверхностных, грунтовых и сточных вод (Данилов и др., 2007; Belkin, 2003). В основу их практического использования положен анализ активности люминесцентной системы, находящейся на пересечении основных энергетических потоков микробной клетки и потому интегрально отвечающей на всю совокупность присутствующих в среде поллютантов (Кудряшова и др., 2002, Nunes-Halldorson, 2003).
В отличие от методов химического анализа, ориентированных на количественную оценку присутствия в исследуемых водах отдельных веществ с последующим сравнением выявляемых концентраций с нормативными значениями - предельно допустимыми концентрациями (ПДК), биолюминесцентный анализ не позволяет оценить природу загрязнения, но дает возможность получить комплексное представление о степени его биологической опасности, характеризуемой понятием «биотоксичность» (Пшеничнов и др., 2005; Kaiser et al, 1991). При этом наряду с относительной дешевизной, быстродействием и высокой чувствительностью, важным достоинством микробных люминесцирующих биосенсоров является хорошая корреляция получаемых результатов с реальной степенью опасности для здоровья человека (Kaiser, 1998) , а также возможность оценки веществ и соединений, для которых методы выявления и значения ПДК пока не разработаны (Strachan et al, 2001).
Одним из перспективных направлений расширения сферы биолюминесцентного анализа является его использование для оценки качества питьевых минеральных вод, традиционно используемых в качестве компонента лечебно-профилактического питания. А в настоящее время получающих все большее распространение в качестве альтернативы централизованному водоснабжению. Однако, накапливающиеся данные о возможном влиянии на бактериальную биолюминесценцию не только токсических, но и нормальных компонентов минеральных вод -растворенных газов, катионов (Витухновская и др., 2001; O'Shea et al, 2005) и анионов (Боядин и др., 2001, Newman et al., 1996), делают прямой перенос существующих технологий биотестирования на подобные объекты неочевидным.
Таким образом, приведенные выше данные определили актуальность изучения возможностей и ограничений биолюминесцентного анализа при проведении биотестирования минеральных вод, а также разработки модернизированной технологии его проведения, адаптированной к особенностям исследуемых объектов.
Цель настоящего исследования - исследование влияния компонентного состава минеральных вод на люминесцирующие микроорганизмы и разработка на этой основе адаптированной технологии оценки качества минеральных вод с использованием бактериальных люминесцирующих биосенсоров.
Основные задачи исследования
Изучить возможности и ограничения биолюминесцентного анализа при проведении биотестирования питьевых минеральных вод.
Определить основные присутствующие в составе питьевых минеральных вод факторы, способные оказать влияние на уровень свечения бактериальных биосенсоров.
Разработать адаптированный метод биолюминесцентного биотестирования минеральных вод, позволяющий исключить влияние их нормального компонентного состава на результаты исследования.
Научная новизна исследования
Установлена невозможность использования традиционных подходов к проведению биолюминесцентного анализа для оценки качества (биотоксичности) минеральных вод. В качестве основной причины подобной ситуации идентифицирован газовый и солевой компонентный состав минеральных вод, способный оказать на уровень свечения бактериальных биосенсоров выраженное ингибирующее действие, имитирующее эффект химических поллютантов.
При изучении эффекта основных солей, входящих в состав минеральных вод, продемонстрированы особенности реагирования бактериальных биосенсоров в присутствии различных катионов и анионов. При этом для катионов показан двухфазный (индукция/ингибирование) дозозависимый эффект, в рамках которого по способности к подавлению свечения они формировали ряд Са2+ > Na+ > Mg2+ > К+. Установлено, что абсолютные значения концентраций солей, вызывающих стимуляцию или ингибирование свечения, зависят от экологических особенностей используемых люминесцирующих микроорганизмов и оказываются выше для природного морского штамма Photobacterium phosphoreum («Микробиосенсор В-17 677f») по сравнению с рекомбинантным штаммом Escherichia coli с клонированным /мх-опероном Photobacterium leiognathi («Эколюм-9»). На этом фоне эффекты анионов, также оказывающих на интенсивность бактериальной биолюминесценции разнонаправленные дозозависимые эффекты, определяются их химической природой и реализовываются через взаимодействие с ферментной системой генерации свечения (галогениды), влияние на растворимость солей (сульфаты) или изменение уровня рН среды (карбонаты и гидрокарбонаты).
Построена математическая модель, описывающая зависимость результатов биолюминесцентного анализа минеральных вод от их компонентного состава, которая после устранения мультиколлинеарности приобретала вид Б ЛИ = 3.82 -0.02[Мин] - 0.37рН, где БЛИ - значения регистрируемого биолюминесцентного индекса, Мин - уровень общей минерализации в г/л, а рН в отн.ед.
Выводы:
При соответствии санитарным нормам минеральные воды оказывают на уровень свечения люминесцирующих бактериальных биосенсоров выраженное ингибирующее воздействие, имитирующее эффект химических поллютантов и возрастающее в ряду «слабоминерализованные воды —> среднеминерализованные воды —> сильноминерализованные воды».
Для основных входящих в состав минеральных вод катионов продемонстрирован двухфазный дозозависимый эффект на интенсивность бактериальной биолюминесценции, заключающийся в ее стимуляции в присутствии малых и ингибиции в присутствии высоких концентраций. По способности к подавлению свечения, характеризуемой величиной ЕС5о, катионы формируют ряд Са2+ > Na+ > Mg2+ > К+. Абсолютные значения ЕС50 зависят от экологических особенностей люминесцирующих бактерий и оказываются выше для природного морского микроорганизма Photobacterium phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» по сравнению с рекомбинантным штаммом Escherichia coli «Эколюм-9», несущим гены свечения Photobacterium leiognathi.
Эффект основных входящих в состав минеральных вод анионов зависит от их химической природы: у галогенидов связан с молекулярной массой и изменяется в ряду СГ —> Вг" —> Г, у сульфатов реализуется через влияние на уровень диссоциации солей, у карбонатов и гидрокарбонатов определяется сдвигом рН среды в зону высоких (щелочных) значений.
В качестве основных механизмов влияния ионов на уровень бактериальной люминесценции идентифицированы прямое воздействие на активность ферментной системы генерации свечения, а также на процессы трансмембранного переноса катионов.
Разработана математическая модель, описывающая зависимость результатов биолюминесцентного биотестирования минеральных вод от их компонентного состава, в соответствии с которой основными причинами, способными оказать искажающее влияние на результаты исследования, являются высокий уровень минерализации и высокие (щелочные) значения рН.
Для устранения эффекта минерализации предложено дифференцированное (зависящее от исходного содержания солей) внесение в анализируемые пробы дополнительных количеств NaCl до конечной концентрации 30 г/л, реализуемое при использовании «Микробиосенсора В-17 677f» и позволяющее достичь восстановления свечения в случае тестирования слабо- и среднеминерализованных вод.
Контролируемый сдвиг значений рН исследуемых минеральных вод до значений = 7.5 является наиболее универсальным действием, позволяющем восстановить интенсивность свечения люминесцентных биосенсоров при сохранении их чувствительности к действию истинных химических поллютантов.
стандартизацию процедуры биотестирования, а также нивелирует солевой эффект, способный оказать дополнительное воздействие на уровень рН.
Предложенный алгоритм биотестирования минеральных вод поддерживается разработанной нами компьютерной программой «Прогнозирование результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод с использованием бактериального биосенсора «Эколюм».
При этом значение последней заключается в том, что она: 1) позволяет прогнозировать значения биолюминесцентного индекса в зависимости от индивидуального солевого состава и рН исследуемых вод; 2) в случае прогноза выраженного влияния нормального компонентного состава минеральной воды на результат ее биолюминесцентного биотестирования выдавать рекомендации по проведению пробоподготовки, позволяющей снизить эффект подобного воздействия; 3) осуществляет расчет ожидаемых после проведения пробоподготовки значений биолюминесцентного индекса.
Кроме того, в эту программу интегрированы методические рекомендации «Методика экспрессного определения токсичности питьевых минеральных бутилированных вод с помощью люминесцентных бактериальных биосенсоров» (утверждены 27.08.2007г. ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области»). Данные методические рекомендации содержат подробное описание адаптированной технологии биолюминесцентного анализа минеральных вод и предназначены для использования специалистами ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» и ТУ Роспотребнадзора, при решении вопросов оценки качества продуктов питания с целью выявления их потенциальной опасности для здоровья человека, а также в Программах производственного контроля на предприятиях-изготовителях, осуществляющих внутренний контроль качества питьевых минеральных вод.
Практическая значимость работы
Полученные результаты позволили обосновать подходы к проведению
биотестирования минеральных вод с использованием люминесцирующих
микроорганизмов, исключающие влияние их нормального компонентного состава на
результаты исследования. Предложенная пробоподготовка включает
последовательную дегазацию, дифференцированную (зависящую от исходного солевого состава) минерализацию и нормализацию рН исследуемых вод, что позволяет восстановить уровень свечения бактериальных биосенсоров с сохранением их чувствительности к действию химических поллютантов. Приоритет подобного подхода закреплен «Способом определения биотоксичности питьевых минеральных вод» (положительное решение формальной экспертизы ФИПС по заявке на изобретение № 32007129999/13 от 06.08.2007г.).
На данной основе разработаны и внедрены методические рекомендации «Методика экспрессного определения токсичности питьевых бутилированных минеральных вод с помощью люминесцентных бактериальных биосенсоров» (утверждены 27.08.2007 г.), предназначенные для использования специалистами ФГУЗ «Центра гигиены и эпидемиологии» и ТУ Роспотребнадзора, решающими вопросы оценки качества продуктов питания с целью выявления их потенциальной опасности для здоровья человека.
Реализация предложенного алгоритма результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод заключена в компьютерной программе «Прогнозирование результатов биолюминесцентного тестирования питьевых минеральных вод с использованием бактериального биосенсора «Эколюм» (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2008611380 от 19.03.2008 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
Установлена невозможность использования традиционного варианта биолюминесцентного анализа для оценки качества минеральных вод, определяемая выраженным влиянием их нормального компонентного состава на уровень свечения бактериальных биосенсоров.
В качестве основных факторов, оказывающих негативное влияние на результаты биолюминесцентного биотестирования, идентифицированы газовый и солевой компонентный состав исследуемых минеральных вод, а также определяемый этим уровень минерализации и рН.
Разработана адаптированная процедура проведения биолюминесцентного биотестирования минеральных вод, позволяющая восстановить интенсивность свечения бактериальных биосенсоров с сохранением их чувствительности к истинным химическим поллютантам.
Связь с научными программами и собственный вклад автора
Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200407020 «Использование природных и генно-инженерных люминесцирующих бактерий для тестирования абиотических сред и биологических жидкостей», а также при поддержке гранта РГНФ № 07-06-81603 а/У «Оценка качества питьевых минеральных вод методом биолюминесцентного анализа».
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы
Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на IV Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2006), II Международной научно-практической конференции «Биоэлементы» (Оренбург, 2007), Всероссийской электронной конференции «Информационно-вычислительные технологии в науке» (Москва, 2007), Международной научной конференции «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), 11-ой международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), Региональной научной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 2007).
Основные результаты проведенных исследований опубликованы в 13 печатных работах, в числе которых 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата биологических наук.
Структура и объем диссертации
Прикладные аспекты использования бактериальной биолюминесценции
Биолюминесценция - свечение, возникающее в результате биохимических реакций в живых организмах, достаточно широко представленное на разных уровнях организации живой материи [13].
Среди представителей царства животных {Animalia) биолюминесценция наиболее часто регистрируется у беспозвоночных, среди которых известными примерами являются медузы {Aequorea victoria), светлячки {Photinus pyralis), а также личиночные формы некоторых насекомых {Phrixothrix hiatus). В царстве растений (Plantae) данное свойство зафиксировано у большой группы мелких морских обитателей динофлагеллят {Pyrocystis fusiformis). Наконец в царстве грибов {Fungi) способность к биолюминесценции проявляют Armillaria mellea, Мусепа chlorophos, Panellus stipticus и др. На этом фоне заметное место занимают и люминесцирующие бактерии, в том числе вступающие в симбиотические взаимодействия с глубоководными рыбами и кальмарами и принимающие участие в формировании их специализированных «световых» органов.
При этом по современным представлениям способность к биолюминесценции регистрируется у представителей четырех бактериальных родов: Photobacterium, Vibrio, Shewanella и Photorhabdus.
В пробах морской воды люминесцирующие микроорганизмы находятся во взвешенном (неприкрепленном к поверхностям) состоянии, что как раз и позволяет оценивать их как «свободно живущие» формы. Наибольшие количества люминесцирующих микроорганизмов характерны для прибрежных вод, где их содержание может варьировать от 103 до 6 Ч 10 клеток в 1 литре, составляя до 50 % от всех обнаруживаемых микроорганизмов [14], особенно в летнее-осенний период. [15]. При этом следует сказать, что наиболее типичным для них является пребывание в нелюминесцирующем состоянии (уровень свечения каждой клетки в 100 раз ниже, чем в лабораторной культуре). При этом в качестве основной причины этой ситуации называется низкая плотность бактериальной популяции.
Для ряда видов морских люминесцирующих бактерии характерны симбиотические взаимодействия с рыбами и кальмарами.
Для представителей «наземного» рода Phothorhabdus показаны паразитические взаимоотношения с личинками насекомых, при этом люминесцирующие бактерии обладают способностью к образованию чрезвычайно активного инсектицидного (убивающего насекомых) токсина.
В морских экосистемах люминесцирующие бактерии обнаруживаются в виде свободно живущих форм, обитающих на поверхности живых организмов и мертвых органических субстратах сапрофитов, присутствующих в пищеварительном тракте комменсалов, симбионтов специальных «световых органов» рыб и кальмаров, а также паразитов — возбудителей различных инфекционных заболеваний морских позвоночных и беспозвоночных. При этом представители большинства видов обычно обнаруживаются более чем в одной экологической нише, что позволяет говорить об известной степени их убиквитарности.
Одними из первых бактериальных изолятов, выращенных на искусственных питательных средах и демонстрирующих на них способность к самостоятельному свечению, были микроорганизмы, обозначенные их первооткрывателем F.Cohn как Micrococcus phosphoreum [16]. Устоявшимся названием для данных микроорганизмов стало Photobacterium phosphoreum. Данные микроорганизмы характеризуются достаточно низким температурным оптимумом, что делает его наиболее частым изолятом в глубинных водах, а также в водах северных широт [17], а также в зимнее время года.
Люминесцирующие микроорганизмы Photobacterium phosphoreum [18] также присутствуют и на поверхностях различных морских обитателей, особенно рыб и ракообразных. При этом их количество обычно превышает таковое, которое может быть получено при посеве окружающей морской воды [14]. Другим, еще более обычным явлением является присутствие люминесцирующих бактерий P.phosphoreum в пищеварительном тракте рыб [19], принимающие участие в процессе полостного пищеварения [20]. Так, P.phosphoreum является симбионтом сразу шести семейств глубоководных рыб: Opisthoproctidae, Chlorophthalmidae, Macrouridae, Steindachneriidae, Moridae и Trachichthyidae [21]. При этом исследование P.phosphoreum из глубоководных рыб свидетельствовало об их существенной эволюционной обособленности от «классических» - «свободно живущих» представителей вида P.phosphoreum [22].
В конце 60-х - начале 70-х годов XX века был описан вид Photobacterium leiognathi, получившего свое название по причине обнаружения в световых органах рыб семейства Leiognathidae [23]. Также микроорганизмы P.leiognathi обнаруживаются в световых органах кальмаров семейства Loliginidae [24].
К настоящему времени в составе рода Photobacterium насчитывается 14 обособленных видов, представленных широким спектром как свободноживущих форм, так и патогенов или симбионтов различных морских обитателей. Однако, несмотря на столь высокое и все увеличивающееся многообразие фотобактерий их основными люминесцирующими видами остаются P.phosphoreum и P. leiognathi.
Общая характеристика минеральных вод
В качестве одного из люминесцирующих биосенсоров была использована тест-система на основе природного морского микроорганизма Photobacterium phosphoreum, выпускаемая Институтом биофизики СО РАН [161] под коммерческим названием «Микробиосенсор В-17 677f».
Использованные при создании названного биосенсора светящиеся морские бактерии Photobacterium phosphoreum принадлежат к домену Bacteria, отделу ВХИ Proteobacteria, классу — III Gammaproteobacteria, порядку — XI Vibrionales, семейству — Vibrionaceae, роду — Photobacterium.
P.phosphoreum - грамотрицательные подвижные палочки, для роста и свечения которых достаточно незначительных концентраций кислорода. По типу питания Рphosphoreum относится к хемоорганогетеротрофам. Для обеспечения их углеродом и энергией, необходимы органические вещества (аминокислоты, сахара, глицерин, органические кислоты). Оптимальным субстратом для «быстрых» люцифераз P.phosphoreum является додеканаль с 14 углеводородными атомами. Оптимальные значения температуры составляют + 20-35 С [162]. Как и все морские микроорганизмы P.phosphoreum являются галофилами. Для их роста и развития в среде необходимо наличие ионов натрия (3 % раствор NaCl). P.phosphoreum - это убиквитарный микроорганизм, т.к. средой обитания для них является морская вода, а также желудочно-кишечный тракт глубоководных рыб. P.phosphoreum не относится к патогенным микроорганизмам, что делает безопасным его применение при выполнении лабораторных технологий. Биосенсор под коммерческим названием «Микробиосенсор В-17 677f» представляет собой лиофилизированный штамм P.phosphoreum в экспотенциальной фазе роста. При хранении в холодильнике при температуре - 15 С он может использоваться в течение года.
Вторым использованным люминесцирующим биосенсором являлась тест-система под коммерческим названием «Эколюм-9», выпускаемый в МГУ им. М.В.Ломоносова [137].
Данный биосенсор создан на основе микроорганизмов Escherichia coli, принадлежащие к домену Bacteria, отделу ВХИ Proteobacteria, классу - III Gammaproteobacteria, порядку - XI Vibrionales, семейству — Enterobacteriaceae, роду — Escherichia.
Большинство представителей данного вида являются комменсалами, т.е. представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и других млекопитающих. По своей морфологии E.coli - мелкие грамотрицательные палочки длинной 2-3 мкм, шириной 0.5 - 0.7 мкм с закругленными концами, в мазках располагаются беспорядочно, не образуют спор, некоторые штаммы имеют микрокапсулу, перитрихии, кроме жгутиков, иногда обнаруживаются пили. E.coli являются факультативными анаэробами. Бактерии хорошо растут на простых питательных средах, таких как мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ). Рост наблюдается при температуре от 10 до 46 С, но оптимальной является температура в 37 С, что согласуется с температурным пределом функционирования люциферазы светящихся бактерий (40 С) [83].
Явление люминесценции у природных изолятов E.coli не регистрируется. Однако с использованием методов молекулярной генетики стала возможна разработка люминесцирующих штаммов E.coli, несущих плазмиду с генами люминесцентной системы природных люминесцирующих микроорганизмов. В частности, в основу биосенсора «Эколюм-9» положен рекомбинантный штамм E.coli К12 TGI, содержащий гибридную плазмиду pUC19 с клонированными /mrCDABE генами P.leiognathi 54D10. Он представляет собой лиофилизированную биомассу данных морских микроорганизмов с исходным содержанием бактериальных клеток около 10 КОЕ/мл.
Для воспроизведения люминесцентной реакции in vitro использовали «Комплект реактивов для биолюминесцентного анализа» (КРАБ), выпускаемый Институтом биофизики СО РАН, г.Красноярск.
Используемый набор КРАБ включает смесь лиофильно высушенных ферментов - люцифераз и НАЕ)Н:РМ1\[-оксидоредуктаз. Данные ферменты изолированы из рекомбинантного штамма Escherichia coli с клонированными ІихАВ генами морской светящейся бактерии Photobacterium leiognathi. В последующем люцифераза и КАБН:БМК-оксидоредуктаз очищаются методами ионообменной и аффинной хроматографии.
Анализ с использованием ферментной системы генерации свечения «Комплекта реактивов для биолюминесцентного анализа» основан на измерении интенсивности свечения, которое является следствием двух сопряженных реакций, первую из которых катализирует фермент оксидоредуктаза, а вторую - люцифераза: FMN + NAD(F)H + Н+ - NAD(F)+ + FMN Н2 (2.1) FMN Н2 + RCHO + 02 - FMN + RCOOFI + Н20+ hv (2.2) В качестве субстратов для реакции свечения использовали миристиновый (Си) альдегид (Merck, ФРГ), флавинмононуклеотид (Sigma, США) и восстановленный никотинамиддинуклеотид.
Изучение влияния галогенидов, сульфатов, гидрокарбонатов и карбонатов на биолюминесценцию in vitro и in vivo
Некоторой особенностью исследования влияния NaHC03, КНСО3, Ш2СОз и К2СОз на люминесценцию P.phosphoreum «Микробиосенсор В-17 677f» являлось то, что данные соли разбавляли не дистиллированной водой, а 3 % раствором NaCl, необходимым для регуляции рН-гомеостаза морских люминесцирующих микроорганизмов. Исследование влияния хлоркарбонилцианидфенилгидразона (ХКФ).
Навеску ХКФ массой 4 мг разводили в дистиллированной воде до концентрации 200 мкМ. В кювету с люминесцирующими микроорганизмами, нагруженными солями NaCl, КС1, MgCb и СаСЬ в концентрациях 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 и 1 М, вносили по 50 мкМ ХКФ. Разведение солей проводили по вышеописанной методике. Люминесцентную активность клеток оценивали в течение 30 мин с 5-минутными интервалами.
Исследование влияния токсикантов. В качестве токсикантов использовали бензол в концентрациях 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 г/л и соль тяжелого металла Сг6+ (К2СГ2О7) в концентрациях 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 мг/л. Растворы токсикантов с используемыми концентрациями получали, разводя исходные растворы по вышеописанному методу и формуле: С„с, VI1CX = Си V2, (2.7) где Сисх, Скон - исходная и конечная концентрация раствора, V1ICX, VK01I - исходный и конечный объем раствора.
Измерение значений рН в приготовленных солевых растворах и дегазированных минеральных водах проводили с использованием анализатора жидкости Эксперт- 001 (ООО «Эконикс-эксперт», Москва). При этом измерение величины рН производили потенциометрическим методом при помощи ионоселективных электродов. Метод заключался в измерении разности потенциалов измерительного электрода и электрода сравнения в растворе. Одновременно проводилось измерение температуры с помощью температурного датчика для стандартизации получаемых результатов. При этом измерение рН с термокомпенсацией позволяло предварительно не калибровать по буферным растворам. Достаточно было только ввести в память анализатора паспортные значения координат рН и потенциала изопотенциальной точки измерительного электрода и теоретическую величину наклона электродной функции. Перед проведением измерения обязательно проверяли уровень электролита в электроде и убеждались в отсутствии воздушных пузырей. Электрод хранили в З М растворе хлорида калия, перед началом исследования его промывали дистиллированной водой и промокали фильтровальной бумагой.
В чистую стеклянную посуду наливали часть анализируемого раствора так, чтобы рабочая мембрана электрода была полностью погружена в раствор, и проводили исследование значений рН. Раствор, в котором проводили определение значений рН, в дальнейших исследованиях не использовали.
Измерение массовых концентраций NADH проводилось с использованием спектрофлюориметра «Флюорат-02 Панорама» (НПФ «Люмекс», Россия), сопряженного с внешним компьютером, снабженным соответствующим программным обеспечением для проведения автоматизированных спектрально-временных измерений.
Измерения проводились во флюориметрическом режиме работы с использованием кварцевых кювет толщиной 1 см в диапазоне 420 - 600 нм с шагом 1 нм. Выбор данного диапазона объяснялся тем, что максимумы полос люминесценции имеют спектральный сдвиг относительно полос их возбуждения в сторону больших длин волн (стоков возбуждения) [173].
Для определения оптимальной величины мы проводили серию экспериментов по облучению раствора NADH различной длиной волны 340 -420 нм с шагом 10 нм (Рисунок 2.6). Чувствительность ФЭУ выставлялась минимальной. На основании этого выбрали оптимальную величину длины возбуждения - 400 нм.
Для проведения измерений с максимальным отношением сигнал/шум подбирался временной интервал (измерительный строб) и только в течение него происходило накопление информации об интенсивности сигнала с ФЭУ.
Адаптация биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности минеральных вод
При изучении люминесценции рекомбинантного штамма E.coli с клонированными /wxCDABE генами P.leiognathi («Эколюм-9») было установлено, что при помещении в дистиллированную воду он демонстрировал уровень свечения, более чем в 100 раз превышающий фоновый. Данный факт соответствует представлениям об этом микроорганизме как о негалофильном (пресноводном) и, тем самым, подтверждает целесообразность использования дистиллированной воды в качестве контрольной среды при осуществлении процедуры биотестирования на «Эколюм-9» [126,169].
В свою очередь ступенчатое насыщение среды хлоридами К+, Na+, Mg + или Са2+ вновь сопровождалось прогрессирующим увеличением уровня свечения (Рисунок 4.1Б). При этом наибольший стимулирующий эффект был зафиксирован в присутствии хлорида К+ (оптимальная концентрация 0.14 ± 0.05 М; относительная интенсивность свечения 2.64 ± 0.16), а наименьшим в присутствии хлорида Са2+ (0.05 ± 0.01 М; относительная интенсивность свечения 1.25 ±0.10).
С нашей точки зрения причины подобного стимулирующего эффекта в наибольшей степени могут быть объяснены позитивным влиянием осмолярности среды на биолюминесценцию [159], что опосредуется происходящим при этом избирательном накоплением внутриклеточного К ,
не только играющего одну из ведущих ролей в процессе осморегуляции, но и одновременно ведущего к повышению в клетках содержания длинноцепочечных альдегидов [155]. Именно эта особенность может определять продемонстрированный нами наибольший стимулирующий эффект К , в то время как при объяснении количественных различий в эффектах прочих катионов невозможно исключить и вовлеченность процессов трансмембранного переноса, связанного с энергетикой цитоплазматической мембраны [160].
После достижения оптимума биолюминесценции рекомбинантного штамма E.coli дальнейшее увеличение концентрации Са2+, Na+, Mg2+ или К+ вновь приводило к ингибированию свечения, характеризуемому величиной ЕС50 при значениях 0.33 ± 0.06 для Са2+, 0.49 ± 0.02 для Na+, 0.67 ± 0.09 для Mg и 0.80 ± 0.05 М для К (Таблица 4.1). При этом обращает на себя внимание тот факт, что если по относительной силе токсического эффекта изученные катионы формировали ряды подобия Са2+ Na+ Mg2+ К+, то абсолютные значения их концентраций, вызывающих снижение интенсивности свечения рекомбинантного штамма E.coli до 50 % от контрольных значений, оказывались ниже, чем аналогичные величины, определенные с использованием P.phosphoreum.
Еще одной особенностью люминесцентного отклика E.coli («Эколюм-9») в отличие от данных, полученных с использованием P.phosphoreum («Микробиосенсор В-17 677f»), являлась следующая зависимость: чем меньше концентрация катиона, при которой регистрируется оптимум биолюминесценции рекомбинантного биосенсора, тем меньше достигаемые абсолютные значения свечения и тем при меньшей концентрации регистрируется его ингибирование, характеризуемое значениями ЕС5о В целом же полученные результаты полностью согласуются с представлениями о возможном токсическом эффекте использованных одно-и двухвалентных катионов, ранее охарактеризованном на примере ряда биологических моделей, в том числе биолюминесцентной тест-системы «Microtox» [11,179].
Для выяснения природы выявленных эффектов хлоридов Са2+, Na+, Mg2+ или К+ на люминесцентную активность используемых биосенсоров in vivo нами были проведены исследования in vitro по влиянию изученных катионов на ферментную систему генерации свечения, представленную выделенными из рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов люциферазой и ЫАО(Р)Н:РМК-оксидоредуктазой P. leiognathi.
Полученные результаты позволили констатировать, что основным эффектом воздействия хлоридов К+ и Na+ на ферментную систему генерации свечения являлось развивающееся во времени (Рисунок 4.2А,Б) подавление интенсивности биолюминесценции до уровня 5 % от исходного при использовании 1 М растворов данных солей. При этом достоверные различия в эффектах К+ и Na+ отсутствовали, что свидетельствует в пользу их неспецифического эффекта на параметры ферментативной реакции, предположительно определяемого изменением ионной силы раствора.
На этом фоне кинетика биолюминесценции ферментной системы в 94- 94 присутствии хлоридов Mg и Са имела принципиально иной характер, уже не описываемый простыми линейными зависимостями. Так использование первой из названных солей, первоначально также вызывающей подавление биолюминесценции (Рисунок 4.2В), начиная с 5-ой минуты, вело к восстановлению интенсивности свечения в широком диапазоне концентраций с относительным максимумом при 0.025 М. С другой стороны, 9 \ для Са сходный эффект мог быть продемонстрирован только при 0.01 М, а все иные концентрации данного катиона вызывали быстрое и интенсивное подавление свечения (Рисунок 4.2Г).
