Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 10
2.1. Биологическая очистка воды 10
2.2. Аэробная очистка сточных вод 13
2.3. Анаэробная очистка сточных вод 15
2.4. Метаногенез 16
2.5. Биопленки 20
2.6. Удаление азота из сточных вод в процессе анаэробного окисления аммония нитритом (анаммокс) 24
2.6.1. Характеристика анаммокс-бактёрий 26
2.6.1.1. Филогения и отличительные особенности анаммокс-бактёрий 26
2.6.1.2. Биохимия процесса анаммокс 30
2.6.1.3. Физиологические характеристики роста анаммокс-бактёрий 32
2.6.1.4. Места обитания анаммокс-бактёрий 33
2.6.2. Биотехнологические аспекты применения процесса анаммокс 34
2.6.2.1. Посевной материал для реактора, осуществляющего процесс анаммокс 35
2.6.2.2. Типы реакторов, используемые для процесса анаммокс 37
2.6.2.3. Иммобилизация активной биомассы в анаммокс-реакторах 39
2.6.3. Основные технологические системы удаления азота из сточных
вод на основе процесса анаммокс 42
2.6.3.1. Процесс с частичной нитрификацией SHARON-ANAMMOX 43
2.6.3.2. Процесс CANON 47
2.6.3.3. Процесс DEAMOX 50
2.6.4. Применение процесса анаммокс для очистки сточных вод с высоким содержанием аммония 52
2.6.4.1. Лабораторные исследования 52
2.6.4.2. Примеры реализации процесса анаммокс в полномасштабных (промышленных) очистных сооружениях 56
2.6.4.3. Цели и задачи работы 58
3. Материалы и методы 60
3.1. Объекты исследования 60
3.2. Использованные среды 62
3.3. Краткосрочные опыты 64
3.4. Долгосрочные опыты 66
3.5. Химические анализы 67
3.6. Электронная микроскопия 68
3.7. Молекулярно-биологические методы 69
3.7.1 Анализ последовательностей генов 16S рРНК 69
3.7.1.1. Выделение ДНК 69
3.7.1.2. Амплификация фрагментов генов 71
3.7.1.3. Клонирование 72
3.7.2. Флюоресцентная гибридизация in situ (анализ FISH) 74
4. Результаты и обсуждение 76
4.1. Образование и окисление метана, и образование молекулярного
азота в системах очистки сточных вод с интенсивной аэрацией 76
4.1.1. Морфологическое разнообразие микроорганизмов на ершовых обрастаниях 76
4.1.2. Относительная численность аэробных и анаэробных микроорганизмов в прикрепленном активном иле 78
4.1.3. Анаэробная деградация органических веществ с образованием метана во взвешенном и прикрепленном активном иле 78
4.1.3.1. Деградация органических веществ активного ила с образованием метана без добавления субстрата 79
4.1.3.2. Деградация летучих жирных кислот (ЛЖК) 81
4.1.4. Окисление метана в микробных биопленках и во взвешенном иле 84
4.1.5. Удаление азота микробной популяцией иммобилизованного
активного ила 86
4.2. Удаление азота в результате процессов денитрификации и анаммокс в системе очистки сточных вод с физико-химической предочисткой и микроаэрофильными условиями на первой ступени биологической очистки 89
4.2.1. Процессы денитрификации и анаммокс в стационарных накопительных реакторах 92
4.2.1.1. Прикрепленные илы из денитрификаторов 1-ой и 2-ой ступени (Д-1 и Д-2) станции №6 92
4.2.1.2. Активный ил станции №3 98
4.2.2. Исследование влияния факторов внешней среды на скорость даления азота 102
4.2.2.1. Влияние температуры на скорость удаления азота 102
4.2.2.2. Влияние начальной кислотности среды на скорость процесса анаммокс 103
4.2.3. Исследование процессов образования молекулярного азота и накопления анаммокс-бактерий в проточном гибридном реакторе 104
4.2.3.1. Влияние нагрузки по азоту и увеличения скорости протока на скорость процесса анаммокс и нарост анаммокс-бактерий 105
4.2.3.2. Изменение концентрации азотных субстратов и рН в проточном реакторе по высоте колонки 114
4.2.4. Идентификация анаммокс-бактерий иммобилизованного активного ила из лабораторного проточного гибридного биореактора 117
. Заключение 122
6. Выводы 126
7. Список литературы
- Анаэробная очистка сточных вод
- Посевной материал для реактора, осуществляющего процесс анаммокс
- Примеры реализации процесса анаммокс в полномасштабных (промышленных) очистных сооружениях
- Относительная численность аэробных и анаэробных микроорганизмов в прикрепленном активном иле
Введение к работе
Актуальность работы. Одной из актуальнейших проблем современности является проблема чистой воды, которая неразрывно связана с проблемой качественной очистки сточных вод и предотвращения загрязнения источников чистой пресной воды. Наибольший интерес и перспективу имеют естественные и самые дешевые методы биологической очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях, или в их комбинации.
В централизованной очистке хозяйственно-бытовых сточных вод осуществляется аэробная очистка с применением процесса активированного ила, которая наряду с бесспорными достоинствами имеет и ряд существенных недостатков, а именно высокие затраты на аэрацию и утилизацию больших количеств избыточного ила (Ножевникова, 2004). Не менее серьезная проблема состоит в удалении соединений азота, т.к. большинство очистных сооружений изначально проектировалось без расчета на их удаление (Jetten et al, 2002; Николаев и др., 2008). Сброс недостаточно очищенных от соединений азота сточных вод является причиной эвтрофикации водоемов. Присутствие аммиака в водоеме оказывает сильное токсическое влияние на рыб, наличие нитритов в питьевой воде вызывает онкологические заболевания, нитратов — метгемоглобинемию у детей.
В настоящее время азотсодержащие соединения удаляются в специальном блоке доочистки воды методом биологической нитри-денитрификации, однако он достаточно дорог, так как требует значительных затрат на аэрацию и добавление источника органических веществ, необходимых для роста денитрификаторов (Dapena-Mora et al., 2004; Николаев и др., 2008). В конце 80-х годов прошлого века был открыт процесс анаэробного окисления аммония нитритом (анаммокс-процесс) (Broda, 1977), и через 20 лет описана первая анаммокс-бактерия Cand. Brocadia anammoxidans (Strous et al., 1999). В наши дни анаммокс-процесс считается наиболее перспективным, экономически выгодным и эффективным способом удаления аммония из сточных вод, т.к. позволяет исключить стадию гетеротрофной денитрификации и значительно уменьшить стоимость аэробной нитрификации (Jetten et al, 2002; Schmidt et al, 2003; Egli et al., 2003; Zhang et al., 2008; Kartal et al., 2010). Являясь крайне востребованным при очистке высококонцентрированных сточных вод, применению процесса анаммокс при очистке сточных вод с низкими концентрациями азотных загрязнений ранее не уделялось должного внимания. Однако, по мере развития новых технологий очистки анаммокс-процесс может вносить более значимый вклад в удаление азота при очистке сточных вод с низкими концентрациями азотных загрязнений, состав которых отличается от оптимальных для развития сообщества анаммокс-бактерий. Таким образом, исследование процесса анаммокс приобретает новый аспект.
В настоящее время большое внимание уделяется разработке и развитию новых, а также усовершенствованию существующих методов биологической очистки сточных вод, в том числе хозяйственно-бытовых сточных вод,
характеризующихся низкими концентрациями загрязнений. Среди них использование анаэробных и аэробных процессов в одном (Irwine et al., 1989; Subbaramaiah et al., 2010) или разных биореакторах (Goncalves and Avanjo, 1999; Garuti et al., 1992), применение рецикла очищаемой воды, изменение режима аэрации и др. для более полного удаления биогенных элементов (Мишуков Б.Г., 2004а), а также применение иммобилизации микроорганизмов активного ила на различных носителях (Yan and Тау, 1997; Zita and Hermansson, 1997; Сироткин, 2007). Иммобилизация микроорганизмов на твердом носителе вследствие развития биопленок позволяет значительно увеличить плотность и биоразнообразие активных микроорганизмов в очистных сооружениях, благодаря чему увеличивается скорость и глубина очистки воды. Увеличение продолжительности пребывания микроорганизмов в реакционной среде имеет немаловажное значение с учетом затрат на утилизацию больших количеств биомассы активного ила. В системах аэробной очистки с прикрепленными микроорганизмами устанавливается равновесие между процессами прироста биопленки и ее вымывания, в связи с чем отпадает необходимость в рециркуляции биомассы, принципиально необходимой при очистке сточных вод в традиционных аэротенках, работающих на свободноплавающей биомассе (Сироткин, 2007).
Перечисленные выше основные преимущества систем аэробной очистки с иммобилизацией микроорганизмов активного ила, перед традиционными аэротенками со свободноплавающей биомассой, в большой степени связаны с важной особенностью строения биопленки - образованию анаэробного слоя вследствие ограниченного доступа кислорода в ее внутренние зоны (Тау et al., 2002; Yu et al., 2002; Плакунов, 2008). Даже в условиях аэрации во внутренних слоях биопленок возникают анаэробные микрозоны, где могут осуществляться анаэробные микробные процессы, в частности денитрификация (М. Henze et al., 2008). До настоящего времени до конца не раскрыты процессы, протекающие в анаэробных слоях биоплёнки, а также их влияние на эффективность функционирования сооружений аэробной очистки сточных вод. Исследование метаногенеза, а также анаэробного окисления аммония и денитрификации -процессов, участвующих в удалении основных загрязняющих веществ хоз-бытовых сточных вод, а именно соединений углерода и азота, представляет большой интерес для биотехнологии аэробной очистки сточных вод с участием иммобилизованных биоценозов. Результаты этих исследований могут иметь важное практическое значение при проектировании новых и реконструировании существующих очистных станций, в частности, для уменьшения образования избыточного ила, а также упрощения и удешевления процесса удаления биогенного азота.
Цели и задачи работы. Целью работы было исследовать анаэробные процессы образования метана и молекулярного азота в биопленках иммобилизованного активного ила в системах аэробной очистки сточных вод, получить доказательства осуществления процесса анаэробного окисления аммония нитритом и развития анаммокс -бактерий в полномасштабных сооружениях и
разработать предложения по оптимизации процессов удаления азота. В задачи работы входило:
-
исследовать разнообразие и относительную численность аэробных и анаэробных микроорганизмов в прикрепленном активном иле;
-
исследовать анаэробную деградацию органических веществ с образованием метана во взвешенном и прикрепленном активном иле из полномасштабных станций очистки сточных вод;
-
исследовать окисление метана в микробных биопленках и во взвешенном иле;
-
исследовать процессы денитрификации и анаммокс в периодических стационарных накопительных реакторах и при проточном культивировании;
-
получить биомассу прикрепленного и свободноплавающего активного ила, обогащенного анаммокс-бактериями;
-
с использованием культуральных, микроскопических, молекулярно-биологических и филогенетических методов охарактеризовать анаммокс -бактерии в хлопьях и биопленках активного ила.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено исследование анаэробных процессов (метаногенез и анаммокс) в полномасштабных системах аэробной очистки бытовых сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов. Выявлено, что в условиях активной аэрации в биопленках иммобилизованного на ершовом носителе активного ила функционирует метаногенное микробное сообщество, которое осуществляет анаэробную деградацию органических соединений до метана и углекислоты. Показано микробное окисление образующегося метана и реализация метанового цикла при очистке сточной воды, причем образование метана происходит преимущественно в прикрепленном, а окисление в свободноплавающем иле. Установлено, что высокое содержание анаэробных микроорганизмов в активном иле обеспечивает низкий прирост микробной биомассы избыточного ила. Получены доказательства наличия процесса анаммокс при очистке бытовых сточных вод в комбинированной системе с физико-химической предобработкой и биологической очисткой. Впервые показан существенный вклад анаммокс-процесса в удаление азота при очистке сточных вод с низкими концентрациями загрязнений. Получен патент на комплектно-блочную модульную очистную установку с эффективным удалением азота с помощью иммобилизованного аэробно-анаэробного микробного сообщества, включающего анаммокс-бактерии. Выданы рекомендации для оптимизации работы канализационных очистных сооружений КОС ЭКОС.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 9 международных симпозиумах и конференциях: V-ая и VI-ая Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (2009, 2010); III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld 2009); Конференция «Инновационные технологии и оборудование для очистки сточных вод и обработки осадка» (2010); VI Московский международный
конгресе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2011); IX Международная специализированная выставка «Мир биотехнологии - 2011»; BIT's 1st World Congress of Environmental Biotechnology - 2011; Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний»; Конференция «Энергосбережение и энергоэффективность на предприятиях водопроводно-канализационного хозяйства» (2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ (2 опубликованных статьи и 1 статья в печати, 1 патент, 9 тезисов).
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН. Филогенетические исследования проведены в ЦКП "Контроль биобезопасности ГМО, пищевого сырья, продуктов и кормов» ФЦП Роснауки на базе Центра "Биоинженерия" РАН.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, .... глав, общих выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на .... странице машинописного текста, содержит .... рисунка, .... таблицы и ....
приложения. Библиография включает наименования, из которых .... на
иностранных языках.
Анаэробная очистка сточных вод
Аэробная очистка сточных вод - это процесс разрушения органических веществ микроорганизмами в присутствии кислорода воздуха, суммарная реакция которой может быть описана следующей формулой: СбН]20б + 02 — 6С02 + 6Н20 + микробная биомасса + теплота (2.1)
Очистные сооружения аэробной очистки можно разделить на два основных типа: 1) сооружения, в которых очистка происходит в условиях, близких к естественным; 2) сооружения, в которых очистка происходит в искусственно созданных условиях. К первому типу относятся сооружения, в которых происходит фильтрование очищаемых сточных вод через почву (поля орошения и ПОЛЯ фильтрации) и сооружения, представляющие собой водоемы (окислительные пруды и каналы) с проточной водой. В таких сооружениях дыхание микроорганизмов происходит за счет непосредственного поглощения кислорода из воздуха, и плотность активной биомассы в них довольна низка, поэтому эти сооружения не отличаются высокой скоростью очистки. В сооружениях второго типа (аэротенки, биофильтры, аэрофильтры) микроорганизмы дышат кислородом главным образом за счет его диффундирования через поверхность воды (реаэрация) или за счет механической аэрации (Голубовская, 1978). В биофильтрах сточная вода фильтруется через загрузочный материал, покрытой микробной биопленкой. В зависимости от режима работы, выбора загрузочного материала и других технологических параметров, существуют различные конструктивные решения биофильтров (Гудков, 2002).
В аэротенках централизованных очистных сооружений используется широко распространенная в мире технология активированного ила. Высокая эффективность и скорость очистки благодаря принудительной интенсивной аэрации и поддержания высокой плотности микробной популяции позволяют окислять органические загрязнения вплоть до их полного удаления. Активный ил является сложной антропогенной экосистемой, которая создается в ограниченном пространстве аэротенков в условиях изобилия кислорода и довольно высокой нагрузки по органическим загрязнителям. В нем присутствуют все основные физиологические группы микроорганизмов, обеспечивающие разложение углерод-, азот-, фосфор-, серосодержащих веществ и других соединений. В процессах деградации загрязняющих веществ в аэротенках основная роль принадлежит гетеротрофным флокулообразующим бактериям. Флоккулы образуют множество клеток микроорганизмов, объединенных биополимерным гелем в хорошо защищенное и организованное структурно-функциональное целое - хлопья активного ила. 90-97% активного ила объединены во флоккулы (биопленки). Их функциональное состояние, активность и адаптированность к экологическим условиям аэротенков определяют устойчивость и эффективность биохимического окисления загрязняющих веществ, присутствующих в сточных водах (Жмур, 2003). При затрудненной аэрации или избыточном поступлении в аэротенк органических загрязнений наблюдается смена биоценоза активного ила. Так, уже при длительности анаэробных условий более 15 минут подавляется жизнедеятельность аэробных форм и происходит значительное увеличение количества факультативных анаэробов, сопровождаемое всплыванием хлопьев активного ила и массовым образованием пены (Сироткин и др., 2007). Поэтому знание оптимальных экологических факторов (условия аэрации, Т, рН, солености и т.д.) и сукцессионных процессов в активном иле позволяет оперативно воздействовать на изменения в процессе очистки сточных вод и, следовательно, управлять этим процессом.
Анаэробная очистка сточных вод В настоящее время наряду с совершенствованием аэробной биологической очистки интенсивно развивается технология анаэробной очистки, которая базируется на анаэробном разложении органического вещества с образованием метана и диоксида углерода: С6Н]206 —» ЗСН4 + ЗС02 + микробная биомасса + теплота (2.2) Она применяется в основном для первичной обработки высококонцентрированных сточных вод, с последующей очисткой и доочисткой сточных вод в аэробных условиях. Более того, для стоков с ХПК свыше 2000 мг/л анаэробная обработка является единственно приемлемым методом очистки, позволяющим удалить до 90% загрязнений (Lettinga et al., 1983; Ножевникова, 2004). Анаэробное сбраживание перспективно еще и тем, что позволяет достичь более благоприятного соотношения C/N для последующей аэробной доочистки, получить энергетическое сырье, поддержать достаточную температуру последующего аэробного процесса в зимний период (Лоренц, 1972). Развитие систем анаэробной очистки происходило от примитивных смесителей, анаэробных контактных аппаратов к анаэробным фильтрам и современным UASB, EGSB и гибридным реакторам. Технология анаэробной обработки может быть реализована в реакторах с взвешенно-седиментирующей и с прикрепленной биомассой (Калюжный и др., 1991; Катраева, 2011). Так как анаэробное микробное сообщество развивается очень медленно, необходимо максимальное удержание активной биомассы в реакторе независимо от скорости протока. В анаэробных биофильтрах высокая плотность активной биомассы достигается путем иммобилизации микроорганизмов на поверхности различных загрузочных пористых материалов (Данилович и Монгайт, 1989). Очищаемая вода может подаваться в них как снизу, так и сверху. Однако недостатком такой конструкции считается относительно быстрое забивание пористого материала (Ножевникова, 2004). Поддержание в аппаратах высокой дозы активной биомассы наиболее успешно достигнуто в UASB, EGSB реакторах, использующих сферические биопленки - так называемый гранулированный активный ил. Именно эти аппараты получили в последние годы наибольшее распространение в мире. Формирование агрегатов биомассы является результатом микробиологических, химических и физических процессов, происходящих на границе раздела жидкой и твердой фаз (Lettinga et al, 1980; Hulshoff Pol, 1989; Alphenaar, 1994). Гранулированный ил имеет высокую активность, достаточно высокую прочность гранул и хорошие седиментационные свойства (Калюжный и др., 1991). По этой причине концентрация ила в активной зоне аппарата может достигать 50-80 Kr/MJ, из-за чего возможно достижение высоких объёмных нагрузок. Однако гранулированный ил образуется не на всех сточных водах, кроме того, для его формирования и роста должны соблюдаться такие условия, как, например, удаление взвешенных веществ, ограничения, связанные со временем пребывания сточной воды в аппарате и т.д. (Калюжный и др., 1991). При возникновении неблагоприятных условий, например при резком изменении состава сточных вод и режима протока, гранулы ила часто распадаются, что может привести даже к необратимой остановке анаэробного реактора (Калюжный и др., 1991; Connaughton et al., 2006). Анаэробный метод применяется для очистки самых разнообразных концентрированных сточных вод и, в первую очередь (в % от общего количества установок анаэробной очистки на примере Германии), для целлюлозно-бумажной промышленности (24%), производства сахара (19%) и пивоваренных заводов (13%) (Meyer, 2004). Температурный режим анаэробной очистки в большинстве случаев мезофильный (30-37С) и термофильный (55-60С), однако в последнее время уделяется большое внимание анаэробной обработке при пониженных температурах (10-20С) (Ножевникова, 2004), вплоть до рекордно низких (4-10С) (Ножевникова и др., 1999; Kalyuzhnyi et al., 2000; Kotsyurbenko et al., 2001; Simankova et al., 2003). Одним из важнейших преимуществ анаэробной очистки является получение ценного горючего биогаза - продукта метаногенеза.
Посевной материал для реактора, осуществляющего процесс анаммокс
Активность процессов денитрификации и анаммокс и накопление анаммокс-бактерий исследовали при периодическом и непрерывном культивировании в анаэробных условиях в атмосфере аргона.
Стационарное культивирование с периодической сменой среды проводили в стеклянных реакторах объемом 1-3 л. Сосуды с пробой и добавленной средой тщательно, в течение 5-10 мин продували аргоном, закупоривали резиновыми пробками с двумя выводами для отбора проб газа из верхней части и жидкости из средней части реактора. После исчерпания субстратов, не реже 1 раза в неделю, меняли среду или добавляли соли нитрита и аммония в соответствующих концентрациях. Регулярно, 2-3 раза в неделю, определяли рН, состав газовой фазы, концентрации нитрит- и нитрат-ионов, и иона аммония. Каждые 3-4 недели определяли ХПК и ЛЖК. Культивирование производили первые два месяца при 20, следующие два месяца при 25 и затем при 30С.
При непрерывном культивировании проводили накопление анаммокс-бактерий и исследование условий их активного роста. На рис. 3.4 представлена схема лабораторного проточного гибридного реактора с восходящим потоком среды (UASB-реактора) и ершовой загрузкой для иммобилизации анаммокс-бактерий. Реактор представляет собой колонку из органического стекла высотой 90 см с рабочим объемом 1.5 литра. В верхней части колонки имеется гидрозатвор и отбойники для биомассы и для образующегося газа, который проходит через компенсаторный сосуд и поступает на газовый счетчик. Свежая среда подавалась в нижнюю часть колонки с помощью перистальтического насоса со скоростью от 1 л/сутки в начале эксперимента с постепенным увеличением до 6 л/сутки. Подача среды производилась соответствующими порциями 16 раз в сутки. Для обеспечения анаэробных условий сосуд со свежей средой был соединен с подушкой с аргоном. Установка была помещена в термостатную комнату с температурой 29-31 С. Рис. 3.4. Схема лабораторного проточного гибридного реактора, объем 2.5 л: 1 -Сосуд со средой, 2 - Перистальтический насос, 3 - UASB реактор с волокнистой загрузкой «Ерш» в рабочем объеме, гидрозатвором и отбойниками для биомассы и образующегося газа (азота) в верхней части реактора, 4 - Сборник для стока отработанной среды, 5 - Газокомпенсатор, 6 - Газовый счетчик.
Для контроля над процессом из нижнего и верхнего пробоотборников на рабочей части колонки регулярно отбирали пробы, в которых определяли рН, ХПК, концентрации нитрита и аммония и по разнице рассчитывали количество потребленных субстратов. Учет образующегося азота производили с помощью газового счетчика.
Анализ газов. Содержание кислорода, азота, метана и водорода определяли на газо-жидкостном хроматографе Кристалл 5000.1 (ЗАО ХРОМАТЕК г. Йошкар-Ола) с системой из 2-х параллельно соединенных колонок с выходом на детектор по теплопроводности и пламенно-ионизационный детектор через метанатор (Т=350С), газ-носитель - гелий. Определение газов проводили также на хроматографе CHROM-5 (Чехословакия) с катарометром и колонкой, заполненной молекулярными ситами 5А, газ-носитель аргон.
Анализ летучих жирных кислот (ЛЖК). Для определения ЛЖК использовали надосадочную жидкость после центрифугирования микробной суспензии из флаконов и реакторов в течение 10 минут при 10000 об/мин. Хроматографический анализ ЛЖК проводили на ВЭЖХ «Стайер».
ХПК определяли бихроматным методом (Орлов и Гришина, 1981). Ход определения: к 1.6 мл пробы добавляли 2.4 мл бихроматной смеси, перемешивали и выдерживали в сушильном шкафу 20 минут при температуре 140С. Затем охлаждали в воде и колориметрировали при ОП 590 нм.
Нитрат определяли колориметрически (Bhaudari and Simlot, 1986). К 0.1 мл пробы без N02 добавляли 0.2 мл 2% салициловой кислоты в H2S04, 3.7 мл 10% NaOH и измеряли оптическую плотность при 410 нм на фотометре КФК-3.
Ионы нитрита и аммония определяли по стандартной методике (Лурье, 1971).
Нитрит определяли колориметрически. К 0.5 мл пробы (разбавленной в 50 раз) добавляли 0,5 мл раствора сульфаниловой кислоты (0.1% раствор в 20% НС1), 0.5 мл раствора нафтилэтилендиамина (0.12% в воде) и измеряли оптическую плотность при 546 нм на фотометре КФК-3.
Аммоний определяли колориметрически. К 0.5 мл пробы (разбавленной в 50 раз) добавляли 0.5 мл 50% раствора виннокислого NaK, 0.5 мл раствора Несслера и измеряли оптическую плотность при 415 нм на фотометре КФК-3.
Микроскопирование. В работе использовали световой микроскоп Olimpus СХ 41 (Германия) с фазовым контрастом, эпифлуоресцентный микроскоп Zeiss Axioplan 2 (Германия).
Для приготовления ультратонких срезов клеток активный ил фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом, приготовленном на 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.0) в течение 1 ч при 4С. Затем материал трижды отмывали тем же буфером и дополнительно фиксировали 1%-ным раствором Os04 в том же буфере в течение ночи при 4С. Далее материал докрашивали 3% раствором уранил-ацетата в 30% этаноле (Kellenberg et al., 1958). После обезвоживания в возрастающих концентрациях этилового спирта и ацетона материал заключали в смесь смол эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготовляли на ультрамикротоме LKB-4800, контрастировали по методу Рейнольдса (Reynolds, 1963) водным уранил-ацетатом и цитратом свинца, и исследовали в электронном микроскопе фирмы «JEOL» (Япония) марки JEM 100С.
Первая методика основана на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли (Birnboim and Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США). 500 мкл активного ила центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин. Супернатант отбрасывали, полученный осадок трижды промывали в 1 мл мин. среды М-9, содержащей соли MgCl2 и MgS04. После третьей промывки осадок суспендировали в 125 мкл буфера I (50 мМ трис-HCl рН 8.0; 5 мМ ЭДТА; 50 мкг/мл панкреатической РНКазы) до получения гомогенной суспензии. К полученной суспензии добавляли 155 мкл лизирующего буфера II (0.2 М NaOH, 1% раствор додецилсульфата натрия, рН 12.0). Полученную смесь инкубировали 10 мин при 65С и добавляли 185 мкл нейтрализующего буфера III (2.5 М раствор ацетата калия, рН 4.5). После тщательного перемешивания на вортексе смесь центрифугировали при 14000 об/мин в течение 3 мин. Отбирали надосадочную жидкость, содержащую ДНК, и добавляли к ней 200 мкл сорбирующей смолы «Wizard MaxiPreps DNA Purification Rezin» (Promega, США). Смесь тщательно пипетировали для максимальной иммобилизации ДНК на смолу и наносили на микроколонку (Promega, США). Для очистки препарата от белков и полисахаридов микроколонку промывали 2 мл промывочного раствора (ЮОмМ NaCl; 10 мМ трис-HCl, рН 8.0; 2.5 мМ ЭДТА; 70% этиловый спирт), затем центрифугировали при 14000 об/мин в течение 3 мин. Далее микроколонку переносили в новую микроцентрифужную пробирку, добавляли 50 мкл деионизированной воды и инкубировали 3 мин при 65С. Центрифугированием микроколонки при 14000 об/мин в течение 1 мин переводили ДНК в раствор. Отбрасывали колонку. Для избваления от остатков смолы раствор с ДНК центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Очищенную ДНК хранили при -18С.
Вторая методика основана на выделении ДНК с PVP-90 (поливинилпирролидон). В целом, этот метод напоминает вышеописанный, но имеет свои особенности, связанные, в частности, с использованием специального буфера состава: 30 мМ трис-НС1, 10 мМ ЭДТА рН 8, 0.1 М NaCl, 1% PVP, 2% 808(додецилсульфат натрия) (далее - буфер с PVP).
Примерно 100 мкл суспензии биопленок растирали с помощью механического пестика. Добавив 400 мкл буфера с PVP, инкубировали при 37С и периодическом перемешивании в течение 40 мин, затем центрифугировали при 4С и 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбирали в отдельную пробирку. К оставшемуся осадку добавляли 200 мкл буфера с PVP и инкубировали при 37С и периодическом перемешивании в течение 5 мин, затем центрифугировали 10 мин при 4С и 1000 об/мин. Супернатант снова отбирали в отдельную пробирку. К оставшемуся осадку добавляли 200 мкл буфера с PVP и центрифугировали при 4С и 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбирали и объединяли с двумя ранее полученными супернатантами в одну пробирку, которую центрифугировали при 4С и 1500 об/мин в течение 10 мин. Отбирали супернатант и центрифугировали при 4С при 14000 об/мин в течение 8 мин для осаждения бактериальных клеток.
Примеры реализации процесса анаммокс в полномасштабных (промышленных) очистных сооружениях
Для понимания процесса распределения концентраций азотных субстратов и кислотности по высоте колонки несколько раз были проведены соответствующие измерения до и после подачи свежей среды насосом в реактор.
На 265 сутки культивирования провели измерения рН и концентраций нитритного и аммонийного азота по высоте колонки непосредственно после подачи порции свежей среды. Из данных табл. 4.5 следует, что концентрация нитритного и аммонийного азота в верхней части колонки даже в момент подачи среды не превышало 30 - 40 мг/л, что в 3 - 4 раза меньше, чем в нижней части. Это указывает на то, что по высоте реактора могли создаваться элективные условия для развития анаммокс-бактерий с разными потребностями к концентрации субстратов в среде. В верхней и нижней частях реактора, возможно, развивались и накапливались разные штаммы или виды анаммокс-бактерий. Данные по распределению субстрата по высоте колонки непосредственно перед подачей очередной порции исходной среды приведены в табл. 4.6. Очевидно, что практически весь подаваемый азот потреблялся в нижней части колонки, а прикрепленные на ерше микроорганизмы в серединной и верхней части колонки находились в условиях субстратного голодания, и, как следствие, активность их была ниже, чем в нижней части реактора. Низкая активность анаммокс-бактерий в верхней части колонки подтверждается и тем, что рН среды в ней оставалось на одном уровне.
На рисунках 4.34 и 4.35 представлены результаты по изучению влияния активности анаммокс-бактерий на увеличение щелочности среды в реакторе. Опыты с биомассой из стационарных реакторов по определению оптимальных условий для развития анаммокс-бактерий, показали, что они хорошо развиваются в достаточно широком диапазоне рН от 7 до 8 (рис. 4.24). При этом к концу опыта во всех его вариантах наблюдалось подщелочение среды. В проточном реакторе с увеличением скорости использования азота, а следовательно и скорости роста анаммокс-бактерий, наблюдалось увеличение рН в реакторе, причем увеличение рН было особенно заметно с увеличением скорости потребления азота от 0 до 400-500 мг N/л в сутки. В верхней части реактора и на выходе из реактора величина рН была около 8.5. При этом на волокнах ершей наблюдалось развитие анаммокс-бактерий. Возможно, в частях реактора, где различаются условия по концентрации субстратов и рН, развиваются разные штаммы или виды анаммокс-бактерий.
Идентификация анаммокс-бактерии иммобилизованного активного ила из лабораторного проточного гибридного биореактора После 9 месяцев проточного культивирования из нижней части реактора были отобраны пробы иммобилизованного на ершах и дисперсного ила красно-буроватого цвета для проведения электронно-микроскопического анализа ультратонких срезов. Результаты анализа показали, что анаммокс-бактерии в условиях проточного реактора существуют в виде микроколоний, окруженных плотной оболочкой, и погружены в гликокаликс (рис. 4.36а). Строение их клеток типично для анаммокс-бактерии: большую часть клетки занимает анаммоксосома, которая ограничена 2-мя клеточными мембранами. Представленная на рис. 4.366 клетка анаммокс-бактерии окружена ореолом с более светлым оттенком, по сравнению с окружающим клетку гликокаликсом. Это могло быть вызвано образованием вокруг клетки пузырька молекулярного азота, либо, что более вероятно, светлый ореол является артефактом использованного метода анализа.
Выделение ДНК из клеток анаммокс-бактерий является довольно нетривильной задачей, которая сопряжена с рядом трудностей. Во-первых, анаммокс-бактерий всегда существуют в виде сарцинообразных микроколоний с весьма ригидной внешней оболочкой, затрудняющей выделение ДНК. Во-вторых, в самой клетке анаммокс-бактерий нуклеоид находится в рибоплазме, ограниченной не одной клеточной мембраной, как в случае с большинством других бактерий, а двумя, которые, к тому же. усилены особыми молекулами гопаноидов и ладдеральных липидов (Jetten et al., 2009).
Помимо этого, проблемы при выделении ДНК связаны с анаммоксосомой -особым клеточным компартментом анаммокс-бактерий, где и происходит анаммокс-реакция. Известно, что интермедиатами этой реакции являются вещества, весьма экзотичные для метаболизма живых существ, при этом являющиеся токсичными для клеток - в первую очередь, это гидразин. В анаммоксосоме гидразин хорошо изолирован от чувствительных к нему клеточных структур, но стандартные методы выделения ДНК опасны тем, что оболочка анаммоксосомы легко повреждается, гидразин выходит наружу и повреждает ДНК.
Согласно литературным данным, для выделения ДНК анаммокс-бактерий зачастую применяются наборы для выделения ДНК из почвенных образцов, такие как
По результатам спектрофотометрического анализа, концентрация ДНК, полученной с помощью первого метода, составила 51.8 мкг/мл, с помощью второго метода - 2.6 мкг/мл. Поэтому для дальнейшей работы было решено использовать модифицированный метод выделения ДНК Бирнбойма-Доли, как обеспечивающий более высокий выход ДНК.
В результате амплификации фрагментов генов и клонирования продуктов амплификации было получено и проанализировано 89 клонов с последовательностями, полученными в результате ПЦР с праймером Pla 46F (две библиотеки), и 46 клонов - с праймером 1 IF. Анализ первой группы клонов (полученных в результате ПЦР с праймером Pla 46F) показал, что все клоны можно было условно разделить на 3 группы. В первой группе, включавшей в себя 31 клон, олигонуклеотидные последовательности имели 93% сходство с последовательностями некультивируемых бактерий, родственных Chloroflexi (FJ517057.1). Вторая группа включала 7 клонов с 82% сходством с некультивируемыми планктомицетами (FJ516830.1). 48 клонов попадали в третью группу и имели 95% сходство с Candidatus Jettenia asiatica (DQ301513.1). Два оставшихся клона имели 94% сходство с Candidatus Brocadia fulgida (EU478693.1).
На основе полученных данных с помощью программы Mega 5.0 было построено филогенетическое дерево, на котором отражено положение полученных клонов относительно представителей порядка Planctomycetales (Рис. 4.37).
Результаты анализа клонов, имеющих олигонуклеотидные последовательности, полученные с помощью праймера 1 IF, оказались неудовлетворительными, т.к. клонов, имеющих последовательности, сходные с последовательностями анаммокс-бактерий, не обнаружилось. Поэтому данные по этим клонам в настоящей работе не были использованы.
Относительная численность аэробных и анаэробных микроорганизмов в прикрепленном активном иле
С помощью биотехнологических, микробиологических, молекулярных и электронно-микроскопических методов проведено исследование анаэробных процессов (метаногенез и анаммокс), протекающих в системах аэробной очистки бытовых сточных вод с иммобилизацией биомассы активного ила.
Показано, что даже в биопленках, развивающихся в условиях активной аэрации, анаэробные микроорганизмы могут составлять значительную часть прикрепленных микроорганизмов. Вследствие увеличения роли анаэробных микроорганизмов, образующих гораздо меньше микробной биомассы по сравнению с аэробными микроорганизмами, наблюдается существенное уменьшение продукции избыточного ила на станциях аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микробной биомассы. Во взвешенном и в иммобилизованном иле присутствуют все ключевые группы анаэробных микроорганизмов, способных разлагать продукты кислотного брожения - важных предшественников метана. В активном иле функционирует полный метановый цикл: метан может одновременно образовываться в анаэробной зоне биопленки и окисляться во внешнем аэробном слое, а также свободноплавающим илом.
Показано, что удаление азота в системах аэробной очистки бытовых сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов происходит в сопряженных процессах нитрификации, денитрификации и анаэробного окисления аммония (анаммокс). При культивировании свежих проб прикрепленного ила в селективной для анаммокс-бактерий среде наблюдается удаление аммонийного азота, что свидетельствует о протекании анаммокс-процесса.
Отмечено, что во взвешенном иле аэробного биореактора условия для развития анаммокс-бактерий относительно неблагоприятные. Вследствие постоянного протока и рецикла водно-иловой массы дисперсный осадок подвергается резкой смене условий среды, таких как аэрация, состав и концентрация соединений азота, окислительно-восстановительный потенциал и др. Для чрезвычайно медленно растущих микроорганизмов смена условий среды имеет отрицательное воздействие. Большая часть аммонийного азота, содержащегося в сточной воде и необходимого для функционирования анаммокс-бактерий, окисляется нитрифицирующими бактериями, которые находятся как в свободноплавающем иле, так и в поверхностных слоях биопленок прикрепленного на ершах ила. Таким образом, в активном иле аэробного биореактора удаление азота происходит преимущественно за счет процессов нитри- и денитрификации, однако даже в условиях активной аэрации в нем присутствуют анаммокс-бактерии, которые вносят определенный вклад в общее удаление азота.
Показано, что введение ряда приемов, а именно (1) физико-химической предобработки и (2) рецикла воды из аэробного биореактора (аэротенка) в микроаэрофильный денитрификатор, в технологическую схему аэробной очистки с (3) иммобилизацией микроорганизмов на станциях очистки ЭКОС позволяет существенно увеличить роль процесса анаммокс в удалении загрязнений азота. В ходе физико-химической предобработки коагулянтом до половины органических загрязнений изымается из очищаемой воды непосредственно перед биологической очисткой, создавая тем самым дефицит доноров электрона для гетеротрофных денитрификаторов, а следовательно экологическую нишу для развития автотрофных анаммокс-бактерии. Окисленные формы азота, благодаря рециклу очищаемой воды из аэробного биореактора в денитрификатор, выделенного в отдельный блок с микроаэрофильным режимом, удаляются в сопряженных процессах денитрификации и анаммокс (деамокс), причем вклад последнего может составлять до трети от общего удаленного азота.
Показано, что процесс удаления азота за счет анаммокс-процесса протекал в интервале начального рН от 6 до 9 с оптимумом при рН от 7 до 8, а также в интервале температур от 10 до 40С с широким оптимумом при 25-35С. На основании данных о скорости потребления аммонийного азота было измерено время удвоения анаммокс-бактерии в проточном реакторе, которое составило около 1 месяца. Невысокая скорость роста анаммокс-бактерии указывает на необходимость повышения нагрузки по азоту путем увеличения скорости протока. Методом проточного культивирования получена биомасса, значительную часть активной микробной популяции которой представляли анаммокс-бактерии, что было подтверждено in situ гибридизацией со специфичным зондом Атх368.
Результаты исследований, проводимых с лабораторными стационарными и проточным реактором, использовались для выработки рекомендаций по оптимизации работы станций очистки сточных вод ЭКОС. В частности, было рекомендовано:
1. Для обеспечения роста и накопления анаммокс-бактерий следует увеличить концентрацию нитрита и уменьшить концентрацию нитрата, поступающих в денитрификатор. Для процесса денитрификации нитрит также является предпочтительным субстратом. Для этого следует несколько уменьшить интенсивность аэрации в аэротенке и снизить до минимума, необходимого для предотвращения образования осадка, аэрацию в денитрификаторе. Это приводит также к экономии энергии на аэрацию.
2. Для обеспечения оптимальных условий роста анаммокс-бактерий и денитрифицирующих бактерий следует избегать избыточного добавления бикарбоната, которое может приводить к подщелачиванию среды выше величины рН 8.0, т.к. при рН выше 8.5 активность анаммокс-бактерий снижается.
3. Для удержания в реакторе медленно растущих анаммокс-бактерий и других членов микробного сообщества биопленок следует избегать промывки ершей или проводить ее в максимально щадящем режиме, чтобы не повреждать внутреннюю структуру биопленок.
4. При пуске новых очистных установок модули очистки следует частично инокулировать ершовыми наполнителями из действующих установок с уже сформировавшимся устойчивыми микробными сообществами, этим можно существенно уменьшить время запуска.
В результате на станциях ЭКОС были уменьшены интенсивность аэрации и подача бикарбоната, что привело к стабилизации процесса очистки и снижению затрат на аэрацию. Мониторинг биомассы прикрепленного ила в течение двух лет эксплуатации станции очистки сточных вод ЭКОС показал увеличение активности анаммокс-процесса in situ.
