Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современное состояние загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами 12
1.1. Основные загрязнители окружающей среды нефтью 12
1.2. Состав и свойства нефтяных углеводородов 15
1.3. Микробиологическая деструкция нефти 20
1.4. Факторы, влияющие на активность деструкции нефти микроорганизмами 32
Глава II. Применение иммобилизованных клеток микроорганизмов и перспективы их использования для очистки сточных вод от нефтяных загрязнений 41
2.1. Принципы иммобилизации клеток микроорганизмов 41
2.2. Методы иммобилизации 49
2.3. Механизмы иммобилизации клеток микроорганизмов 51
Экспериментальная часть
Глава III. Материал и методы исследований 67
3.1. Материал исследований 67
3.2. Отбор проб 67
3.3. Методы исследований 68
3.3.1.Состав питательных сред 68
3.3.2. Выделение и идентификация индивидуальных штаммов микроорганизмов 68
3.3.3. Сравнительная оценка культур микроорганизмов по степени деструкции нефти и нефтепродуктов 70
3.3.4. Определение и выбор носителей для иммобилизации клеток углеводородокисляющих микроорганизмов 71
3.3.5. Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха) 73
3.3.6. Определение оптической плотности 75
3.3.7. Аналитические методы 75
3.3.8. Методика определения нефтепродуктов 75
Результаты и обсуждения
Глава IV. Выделение и идентификация штаммов культур нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов 78
4.1. Характеристика выделенных штаммов бактерий 83
Глава V. Изучение ассоциаций нефте- и углеводородокисляющих культур и их иммобилизация на сорбентах-носителях 90
5.1. Выбор и создание искусственных ассоциаций активных нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов 90
5.2. Определение и выбор носителей для иммобилизации клеток углеводородокисляющих микроорганизмов 94
5.3. Влияние внешних факторов среды на нефтедеструктивную активность искусственной ассоциации свободных суспендированных и иммобилизованных клеток микроорганизмов 95
5.3.1. Изучение влияния аэрации на углеводородокисляющую активность ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов 95
5.3.2. Изучение влияния температурных условий на
нефтедеструктивную активность консорциума, выделенных штаммов микроорганизмов 99
5.4. Исследование эффективности деструкции нефти
иммобилизованными культурами микроорганизмов 107
5.5. Оценка углеводородокисляющей активности ассоциациями культур микроорганизмов 109
Выводы 112
Список использованных источников 114
- Состав и свойства нефтяных углеводородов
- Механизмы иммобилизации клеток микроорганизмов
- Сравнительная оценка культур микроорганизмов по степени деструкции нефти и нефтепродуктов
- Влияние внешних факторов среды на нефтедеструктивную активность искусственной ассоциации свободных суспендированных и иммобилизованных клеток микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Прогрессивный рост урбанизации и развитие таких отраслей промышленного производства, как нефтедобывающая, нефтеперерабатывающая и нефтехимическая, приводят к загрязнениям природных вод нефтью и ее производными. В результате нарушается естественный круговорот веществ, подрывается экологическое равновесие, наносится огромный ущерб водным и наземным экосистемам.
Одним из основных загрязнителей природных экосистем являются нефть и нефтепродукты (Печуркин, 1990; Барышникова с соавт., 2001; Белоусова, 2002; Драчук с соавт., 2002; Морозов, 2006, 2009, 2010), которые входят в число экологически опасных соединений (Юровская, 1984; Castaldi et al., 1991; Аренс с соавт., 1997; Шкидченко с соавт., 2002; Петрикевич с соавт., 2003; Федоров с соавт., 2006).
Альтернатива этому – применение методов очистки in situ (Пырченкова с соавт., 2006). Наиболее перспективными являются микробиологические способы, основанные на использовании организмов водных экосистем, и, в первую очередь, разнообразных таксономических групп углеводородокисляющих микроорганизмов. Как показано многочисленными исследованиями (Atlas, 1985; Salt et al., 1998; Van Hamme et al., 2003), именно биодеградация является первичным механизмом удаления углеводородных соединений. Предпочтение отдается микробным ассоциациям, либо специализированным, адаптированным к определенному составу химических загрязнений, культурам гетеротрофных микроорганизмов (Морозов, 2001; Пирог с соавт., 2005). Изучение видового разнообразия и физиологических свойств (Драчук с соавт., 2002) микроорганизмов, участвующих в биоокислении различных классов углеводородов подтверждает мнение целесообразности использования их в восстановлении естественных качеств окружающей водной среды.
Несмотря на известность факта изученности вопроса, проблема создания высокоэффективных и совместимых между собой ассоциаций нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов на базе аборигенных видов иммобилизованных на сорбентах-носителях, с широким спектром устойчивости их к изменяющимся условиям среды, была и остается очень острым вопросом современного состояния водных ресурсов загрязненных нефтью и ее персистентными соединениями.
В этой связи разработка новых биотехнологий защиты и восстановления природных вод, глубокая очистка и доочистка сточных вод от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, с помощью отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов имеет важное народнохозяйственное значение.
Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Тема диссертации связана с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» (на основании Приказа от 02.02.2011 г. №156 Министерство образовании и науки Российской Федерации государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» реорганизован в форме присоединения к ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»), по теме «Эколого-биотехнологические пути регулирования управления качеством водных и земельных ресурсов» по приоритетному направлению фундаментальных исследований технологической платформы «БиоТех 2030» в области экобиотехнологии и биоресурсных центров в РФ.
Цель исследования – комплексное изучение биотехнологических путей интенсификации процессов очистки природных вод и технологических стоков от нефти отселектированными углеводородокисляющими микроорганизмами на основе иммобилизации их на органических субстратах растительного происхождения.
Основные задачи работы:
1.Выделение, идентификация и подбор индивидуальных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в биодеградации нефтяных загрязнений.
2.Создание искусственного консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов, эффективно ускоряющего процессы биоокисления нефти в природных и технологических водах.
3.Выбор сорбентов-носителей и получение иммобилизованных культур микроорганизмов-нефтедеструкторов.
4.Исследование роли свободных суспендированных и иммобилизованных клеток на сорбентах растительного происхождения штаммов-деструкторов нефти.
5.Изучение влияния абиотических факторов среды на деструктивную активность нефти углеводородокисляющими микроорганизмами.
6.Оценка эффективности деструкции нефти и ее компонентов искусственно созданными консорциумами углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованными на сорбентах-носителях.
7.Разработка рекомендаций по практическому применению иммобилизованных клеток микроорганизмов на органических сорбентах для интенсификации процессов биоремедиации нефтяных загрязнений в природных водах и производственных стоках.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.Выделенные и идентифицированные культуры микроорганизмов из сточных вод способны использовать нефть и нефтепродукты как
единственный источник углерода и энергии.
2.Мониторинг углеводородокисляющих культур деструкторов нефти способствовал получению консорциумов высокоэффективных, взаимно дополняющих культур известного состава с целью разработки биотехнологического направления восстановления качества водных ресурсов после нефтяного загрязнения.
3.Применение иммобилизованных ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов на основе прикрепления их на органических сорбентах растительного происхождения обеспечивает высокую степень деструкции нефти и ее производных.
4.Абиотические условия среды воздействуют на эффективность биоокисления нефти и нефтепродуктов суспендированными и иммобилизованными клетками углеводородокисляющих микроорганизмов.
Научная новизна. Выделены и идентифицированы штаммы нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов (НиУОМ), обладающих широким спектром окисления различных классов углеводородов нефти. Подобраны культуры из многочисленных видов гетеротрофных бактерий, совместимых между собой для создания ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в биодеградации нефтяных загрязнений.
Выбран эффективный сорбент-носитель органического происхождения (гречишная и ячменная шелуха) для иммобилизации штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.
Дана оценка эффективности деструкции нефти и ее производных искусственно созданным консорциумом углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованных на растительных сорбентах, и их применение для интенсификации процессов очистки природных и сточных вод от нефтяных загрязнений.
Создан консорциум нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов промышленного образца для управляемого применения в борьбе с нефтяными загрязнениями в сточных водах, в природных водоемах, а также замазученных землях при аварийном или ином их поступлении.
Практическая значимость. Получены отселектированные штаммы-деструкторы Rhodococcus maris Г0611ВТ (№ 18), Rainey F.A., Klatte S., Kroppenstedt R.M., Stackebrandt E. (1995); Rhodococcus luteus Г0612ВТ (№ 19), Nesterenko O.A., Nogina T.M., Kasumova S.A., Kvasnikov E.I., Batrakov S.G. (1982); Pseudomonas gladioli Г0613ВТ (№ 20), Severini (1913), Yabuuchi et al. (1993); Corynebacterium vitarumen Г0614ВТ (№ 21), Bechdel et al. (1928), Lan elle et al. (1980); Flavobacterium aguatile Г0615ВТ (№ 22), Frankland and Frankland (1889), Bergey et al. (1923); Micrococcus agilis
Г0616ВТ (№ 23), Koch C., Schumann P., Stackebrandt E. (1995); Arthrobacter globiformis Г0617ВТ (№ 24), Conn (1928); Mycobacterium sp. Г0618ВТ (№ 25), Lehmann and Neumann (1896); Bacillus subtilis Г0619ВТ (№ 26) Nakamura L.K., Roberts M.S., Cohan F.M. (1999); Flavobacterium balustinum Г0620ВТ (№ 27), Harrison (1929) на базе которых создан консорциум для очистки и доочистки нефтезагрязненных вод.
Результаты исследований предлагается использовать для биологического мониторинга состояния водных объектов при их загрязнении нефтяными углеводородами и управляемой интенсификации биодеградации нефти и нефтепродуктов с применением сорбентов растительного происхождения на основе целенаправленной иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующих в процессе очистки.
Разработанные приемы и способы управляемой очистки вод от нефтяных загрязнений иммобилизованными на растительных сорбентах консорциумами НиУОМ отличаются своей экономичностью, так как эти сорбенты являются широко распространенными отходами сельскохозяйственного производства. Сорбенты также выступают в среде как легкоокисляемые субстраты, оказывающие благотворное влияние на жизнедеятельность углеводородокисляющих микроорганизмов и стимуляцию всего процесса биоочистки. Так как данные приемы выгодно отличаются экономичностью вследствие использования сорбента из отходов местного сырья растительного происхождения, есть возможность ее применения для восстановления естественных свойств загрязненных нефтью водных ресурсов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на VI республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 2004), на конференции «Экологические проблемы города Казани и прилегающих территорий» посвященной 1000-летию г. Казани (Казань, 2005), на конференции «Современные наукоемкие технологии» (Москва, 2005), VI всероссийской научно-технической конференции «Вузовская наука – региону» (Вологда, 2008), VI Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Образование. Молодежь» (Майкоп, 2009), на конференции «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию» (Казань, 2009), Х Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009), на международной конференции 17th International Environmental Bioindicators Conference (Moscow, 2009), на конференции «Окружающая среда и устойчивое развитие региона: новые методы и технологии исследований» (Казань, 2009), на конференции «Современные проблемы органической и биологической химии, молекулярной биологии,
экологии и биотехнологии» (Москва, 2009), на международном конгрессе «Чистая вода. Казань» (Казань, 2010), на конференции «Природоохранные биотехнологии в XXI веке» (Казань, 2010), на конференции «Актуальные вопросы естествознания начала 21 века» (Казань, 2010; 2011).
Публикации: По материалам диссертационной работы опубликовано 17 работ, в том числе в 2 изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 141 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 13 рисунков. Библиография содержит 248 наименований работ российских и зарубежных авторов.
Состав и свойства нефтяных углеводородов
В результате деятельности нефтеперерабатывающей промышленности образуется большое количество отходов (Saikia et al., 2001) - до 1,6 млн т, из которых 80 % перерабатывается непосредственно на предприятиях, а часть передается в другие отрасли (Абросимов, 2002). Потери нефти, содержащейся в отходах, по экспертным оценкам, составляют примерно 3 % годовой добычи. Важность проблемы определяется не только значительными потерями, но и негативным воздействием нефтеотходов практически на все компоненты природной среды (Боковикова с соавт., 2010).
Загрязнения нефтью и нефтепродуктами обычно происходят при бурении скважин в ходе поисков нефтяных месторождений, при эксплуатации промышленных запасов нефти, при авариях на промыслах, после взрывов и пожаров на танкерах, при кораблекрушениях (Садовникова с соавт., 2008).
Нефтепродукты, продукты износа шин и тормозных накладок, сыпучие и пылящие грузы, образуемые в транспортно-дорожном комплексе (Охрана ..., 2000) вносят существенный вклад в загрязнение водных объектов. В состав выхлопных газов автомобилей входят углеводороды (этан, метан, этилен, бензол, пропан, ацетилен, толуол, бутан), сложные ароматические углеводороды - бенз(а)пирен, пирен (Гольдберг, 1987).
Загрязнения поступают в водоем со всеми видами сточных вод, с атмосферными осадками (Трифонова, 1990; Левшина, 2008), в виде смыва с прилегающей территории ливневыми и паводковыми водами сельскохозяйственных отходов, удобрений, ядохимикатов, с инфильтрационными водами полигонов захоронения отходов и т.п. (Ивчатов с соавт., 2006).
Поступая в водоемы, нефть создает различные формы загрязнения: плавающую на воде нефтяную пленку, растворенные или эмульгированные в воде нефтепродукты, осевшие на дно тяжелые фракции, продукты, адсорбированные грунтом дна или берегов водоема (Кушелев, 1979). Последствием образования углеводородных пленок является изменение нагрева водной поверхности при снижении количества кислорода. Известно, что 2 г нефти в килограмме почвы делают ее непригодной для растений и почвенной микрофлоры. Литр нефти лишает кислорода 40 тыс. л воды, одна тонна нефти способна загрязнить до 12 км2 водной поверхности (Арене с соавт., 1997). Даже незначительное содержание нефти (0,2-0,4 мг/л) придает воде специфический запах (Комплексное ..., 1985). Растворенные и эмульгированные в воде нефтепродукты оказывают сильное отрицательное воздействие на водные организмы (Кушелев, 1979). При концентрации нефти в воде в количестве 0,1-0,01 мг/л икринки рыб погибают за несколько суток. Достаточно вылить в воду 1 л нефти, чтобы погубить более 100 млн личинок рыб и других морских организмов, а в воды рек, озер и Мирового океана ежегодно по различным причинам поступают миллионы тонн нефти.
Нефтяная пленка снижает интенсивность фотосинтетических процессов в водоемах, замедляет минерализацию органического вещества, изменяет солевой состав воды. Присутствие нефти и нефтепродуктов изменяет цвет воды, рН, придает ей специфический вкус и запах (Квасников с соавт., 1981).
Нефтепродукты относятся к числу органических трудноокисляемых соединений (Tschepigo et al., 1975; Белоусова с соавт., 2008) и при их высоких дозах почвенная масса становится гидрофобной, механические элементы и структурные агрегаты покрываются нефтяной пленкой, которая изолирует питательные вещества от корневых систем растений. Почвенные частицы слипаются, а при старении и частичном окислении компонентов нефти последняя загустевает и почвенный слой превращается в асфальтоподобную массу, которая совершенно непригодна для произрастания естественной растительности или возделывания сельскохозяйственных культур (Садовникова с соавт., 2008). Итак, при антропогенном воздействии на окружающую среду происходит нарушение функционирования экосистем, снижение их биопродуктивности, токсическое действие на водную флору и фауну.
В водоемы с поверхностным стоком и сточными водами поступает большое количество органических веществ, а в их составе - углеводородов природного и антропогенного происхождения (Немировская с соавт., 2009).
Нефть представляет собой многокомпонентную систему, состоящую более чем из 500 индивидуальных химических соединений (Ветрова с соавт., 2007). Главные нефтеобразующие элементы: углерод (83-87 %), водород (12-14 %), азот, сера, кислород (1-2 %, реже 3-6 % за счет серы) (Султанов с соавт., 1987; Биотехнология ..., 1988; Пиковский, 1988), многие из которых обладают поверхностно-активными свойствами, стабилизирующими нефтяные эмульсии. Благодаря этому любая смесь нефти и воды при перемешивании быстро превращается в довольно стойкие эмульсии, в которых вода эмульгирована внутри нефти, а сама нефть является внешней фазой эмульсионной среды. С изменением соотношения нефти и воды стойкость нефтяных эмульсий понижается (Гоник, 1998). Десятые и сотые доли процента нефти составляют многочисленные микроэлементы (Пиковский, 1988), в том числе и тяжелые металлы: цинк, хром, ванадий, никель, свинец, медь (Goettems et al., 1998; Juvonen et al., 2000).
Углеводороды, входящие в состав нефти, подразделяют на 4 класса (Нельсон-Смит, 1977): Парафины (насыщенные, предельные углеводороды) - органические соединения, характеризующиеся формулой СпН2п+2, имеющие прямую или разветвленную цепь. Они подразделяются на алифатические насыщенные углеводороды (алканы, парафины) и алициклические углеводороды (циклоалканы и циклопарафины), главным источником которых являются нефть, природные и попутные газы (Нуртдинов с соавт., 2006).
Механизмы иммобилизации клеток микроорганизмов
Все имеющиеся в настоящий момент методы иммобилизации клеток подразделяются на три основные группы: механические (включение в гель, мембрану), физические (адсорбция, агрегирование), химические (связывание бифункциональными реагентами) (Войшвилло с соавт., 1978; Скрябин с соавт., 1984; Промышленная ..., 1989).
Иммобилизацию клеток путем включения в различные гели, мембраны, волокна относят к механическим методам. Включение основано на неспецифическом осаждении (коллаген, агар, полистирол, хитозан, желатина, каррагинан), ионом образовании геля (А1- и Са-альгинаты), полимеризации (полиакриламид, фоточувствительные полимеры) (Губницкий с соавт., 1981; Скрябин с соавт., 1984; Промышленная ..., 1989; Graham et al., 2000; Сазыкин, 2006). Данный способ иммобилизации состоит в том, что микробная клетка как бы заключается в ячейку, разрешающую доступ к ней субстрата, но препятствующую ее собственному перемещению (Войшвилло с соавт., 1978). Клетки, включенные в полиакриламидный, Са-альгинатный и каррагинановый гели, могут сохранять свою жизнеспособность и в присутствии питательной среды (инкубация в питательной среде), размножаться в приповерхностных слоях гелей (Ohlson et al., 1979; Wada et al, 1981). Этот прием позволяет в значительной мере стабилизировать ферментативную активность иммобилизованных клеток и повысить активность иммобилизованной системы в целом.
К физическим методам относятся адсорбция и агрегация. Они основаны на способности клеток слипаться друг с другом либо адсорбироваться на подходящих развитых поверхностях (Войшвилло с соавт., 1978). Метод адсорбции на поверхности материала носителя является одним из наиболее простых и доступных способов иммобилизации микробных клеток (Максимов с соавт., 2007). Явления адсорбции клеток, обрастания постоянно существуют в природе. Следует отметить, что активные илы всегда содержали адсорбированные клетки. Применение добавочных стадий при очистке с помощью иммобилизованных клеток может дать больший эффект, так как позволяет направленно обезвредить особенно токсичные соединения (Войшвилло с соавт., 1978; Скрябин с соавт., 1984). Адсорбция исключает применение токсичных для клеток соединений и позволяет сохранить или повысить жизнеспособность микроорганизмов. Адсорбция бактериальных или дрожжевых клеток зависит от химической природы поверхности клеточной стенки, которая имеет в своем составе пептиды, диаминопимелиновую кислоту, гексозамины, обеспечивающие ионное взаимодействие с используемым носителем (Кощеенко, 1981).
Химический метод основан на образовании ковалентных связей с активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных групп аминокислот и других соединений в клеточной стенке с бифункциональными реагентами (Скрябин с соавт., 1984).
Существует другой принцип классификации методов иммобилизации, который основывается на следующих положениях: производится ли иммобилизация одновременно с обездвижением препарата и образованием матрицы носителя или же процесс иммобилизации происходит на заранее приготовленной нерастворимой основе, на которой тем или иным способом закрепляют биологическое действующее начало (Юрин, 2006).
Механизмы иммобилизации клеток микроорганизмов Благодаря современным микробиологическим и молекулярно-биологическим методам исследования стало известно, что более 99 % бактериальных популяций в природных экосистемах существует не в виде свободно плавающих планктонных клеток, а в виде специфически организованных прикрепленных к поверхностям биопленок (Ильина с соавт., 2004; Кирилина с соавт., 2009). Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде. Биопленки (biofilms) формируются в проточных системах, содержащих необходимые для роста субстраты и они являются одним из видов микробных консорциумов, играющих роль в биосферных биогеохимических процессах (Николаев с соавт., 2007; Чертес с соавтр., 2010).
В составе биопленок клетки бактерий объединены сложными межклеточными связями, в результате чего популяцию биопленочных бактерий можно рассматривать как функциональный аналог многоклеточного организма (Shapiro, 1998; Ильина с соавт., 2004). Биопленки являются микробными сообществами, формирующимися на поверхности раздела фаз. Всего известно четыре типа разделов фаз, на которых развиваются микробные сообщества (Николаев с соавт., 2007): жидкость (водная среда) - твердая поверхность; жидкость - воздух; две несмешивающиеся жидкости и твердая поверхность - воздух. Началом развития биопленок является переход бактерий от планктонного способа существования к другому, связанному с прикреплением клеток к биотической или абиотической поверхности (рис. 3) (Ильина с соавт., 2004). На начальном этапе формирования биопленки происходит прикрепление к твердой поверхности отдельной бактериальной клетки.
Сравнительная оценка культур микроорганизмов по степени деструкции нефти и нефтепродуктов
На втором этапе исследований изучали отношение идентифицированных штаммов НиУОМ к нефти и ее производным, как к единственному источнику углерода и энергии.
Исследованиями показано, что степень усвоения нефти (товарной и сырой) и нефтепродуктов строго зависит как от состава углеводородов, так и от количества нефтяного загрязнения, контактирующего с микроорганизмами. Как правило, уже в течение 1-3 суток пленка нефти изменяется по структуре, переходя от черного до коричневого, а далее в светло-серый цвет в конце опыта. В результате деструкции сплошная пленка нефти превращалась во множество мелких частиц (капель) размером от 0,1 до 0,4 мм в диметре и мелкодисперсную суспензию нефти.
Численность углеводородокисляющих микроорганизмов на среде МПА Анализ динамики общей численности бактерий, включая НиУОМ, показал, что внесение нефти в минеральную среду вызывало возрастание численности, причем в зависимости от фракции углеводородов, включаемых в биодеградацию (рис. 4).
В течение первых 3-х суток число микроорганизмов во всех вариантах опыта возрастало и колебалось от 1,9 107 до 6,7 -107 кл/мл, что, по-видимому, связано с адаптацией их к исходному субстрату, как единственному источнику углерода, и с началом его разложения. К концу эксперимента, на 9-10-е сутки численность микроорганизмов постепенно снижалась по мере уменьшения количества и усвояемой части нефти. Сравнение содержания гетеротрофных бактерий в опытах с нефтью показало стимулирующее влияние углеводородов на динамику микроорганизмов, участвующих в биоокислении, которая четко проявилась на третьи сутки и прослеживалась до конца эксперимента.
При деструкции нефти углеводородокисляющие микроорганизмы (на среде МПА) переходят в фазу интенсивного размножения лишь на 5-6-е сутки, численность их при этом достигала максимальной величины и колебалась от 3,0 107 до 8,6 107 кл/мл, так как нефть, являясь органическим веществом, выступает в качестве питательного субстрата для их развития (Жуков с соавт., 1977; Колешко, 1977; Миронов, 1987; Margesin et al, 2000), что приводит к биодеградации нефти и самоочищению воды. Интенсивное увеличение микроорганизмов авторы связывают с первоначальным разложением легких фракций нефти, после чего микроорганизмы приступают к утилизации углеводородов с более сложным строением и меньшей доступностью (Шкидченко с соавт., 2002; Федоров с соавт., 2006).
Отдельные виды углеводородокисляющих бактерий, такие как Rhodococcus maris, Pseudomonas gladioli, Micrococcus agilis (рис. 4), доминируют, благодаря своей численности, химической активности и продуктивности.
В результате проведения серий опытов по определению степени биодеградации сырой нефти и нефтепродуктов под воздействием НиУОМ, выявили, что деструкция фракций нефти начиная от бензина до керосина, вазелинового, турбинного и солярового масел идет быстрее, чем тяжелых фракций, таких как мазут и его компоненты (табл. 4), что подтверждается работами многочисленных авторов (Литвиненко, 1977; Morel et al., 1981; Murakami, 1982; Белоусова с соавт., 2002; Marin et al., 2005).
В последующих исследованиях основное внимание уделяли подбору смешанных культур, искусственно составленных из отдельных штаммов. Для этого из многочисленных видов гетеротрофных микроорганизмов, выделенных из объектов окружающей среды и объединенных в ассоциацию, подбирали подходящие условия, обеспечивающие их совместное развитие для управляемого применения при ликвидации локальных или иных нефтяных загрязнений.
Общепринято, в создании биопрепаратов на основе НиУОМ направленного действия, использовать два основных подхода. Первый основан на создании консорциума микроорганизмов, полученного посредством комбинирования ряда штаммов с известной деградирующей способностью (определенный консорциум). Второй - на получении так называемых неопределенных консорциумов - консорциумов с неизвестными характеристиками каждого из его членов. Это может быть особенно эффективно для деградации определенного загрязнителя, к которому данный консорциум заранее адаптирован (Жуков с соавт., 2007).
На основе выбранных десяти высокоактивных нефтеокисляющих монокультур были составлены искусственные ассоциации, состоящие из разного числа штаммов (табл. 5). В каждый из вариантов вошли по два, три, пять, семь и десять активных штаммов-деструкторов нефти.
Как видно из рисунка 5, ассоциации, состоящие из большего числа штаммов, обладали наибольшей деструктивной активностью.
Вероятно, при биотрансформации нефти происходит как количественное снижение содержания нефти, так и качественное изменение его фракционного состава, т.е. наблюдается избирательная способность утилизировать отдельных ее компонентов.
Численность углеводородокисляющих микроорганизмов на среде МПА По результатам исследований микробные ассоциации № 1 (Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 19)) и № 2 (Г0611ВТ (№ 18) + Г0612ВТ (№ 20) + Г0616ВТ (№ 23)) не показали высокой эффективности окисления нефти, что, по-видимому, связано с конкуренцией штаммов за субстрат, хотя каждый из штаммов в монокультуре показал более высокую деструктивную активность нефти. Из девяти проверенных вариантов ассоциаций для дальнейших исследований были выбраны два, состоящие из трех и десяти культур.
Влияние внешних факторов среды на нефтедеструктивную активность искусственной ассоциации свободных суспендированных и иммобилизованных клеток микроорганизмов
Культуры, выбранные в качестве объектов исследования деструкции нефтепродуктов, являются мезофилами, и поэтому процессы их жизнедеятельности - рост и развитие, при +4 С замедляются. Механизм действия низкой температуры на клетку заключается в затормаживании в ней процессов метаболизма, прекращении роста и размножения.
Корреляционная зависимость между влиянием температуры и окислением нефти в минеральной среде со свободными клетками показывает коэффициент: с тремя штаммами - 0,81; с десятью - 0,91, что является высоким показателем, отражающим тенденцию нефтедеструктивной активности с повышением температуры.
В случае исследования иммобилизованных клеток микроорганизмов на органических субстратах выявлена также положительная коррелятивная связь между деструкцией нефти и температурой, отражающаяся коэффициентом корреляции: при иммобилизации клеток на гранулах гречихи трех культур - Г0611ВТ (№ 18) Rhodococcus maris, Г0613ВТ (№ 20) Pseudomonas gladioli, Г0616ВТ (№ 23) Micrococcus agilis составило - 0,98; десяти - Г0611ВТ (№ 18) Rhodococcus maris, Г0612ВТ (№ 19) Rhodococcus luteus, Г0613ВТ (№ 20) Pseudomonas gladioli, Г0614ВТ (№ 21) Corynebacterium vitarumen, Г0615ВТ (№ 22) Flavobacterium aguatile, Г0616ВТ (№ 23) Micrococcus agilis, Г0617ВТ (№ 24) Arthrobacter globiformis, Г0618ВТ (№ 25) Mycobacterium sp., Г0619ВТ (№ 26) Bacillus subtilis, Г0620ВТ (№ 27) Flavobacterium balustinum - 0,98.
В случае иммобилизации клеток на гранулах ячменя трех культур представленных выше составило - 0,99; десяти - 0,98, т.е. с повышением температурного коэффициента увеличивается деструктивная активность нефти.
Исследование эффективности деструкции нефти иммобилизованными культурами микроорганизмов
Применение иммобилизованных микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных природных и сточных вод представляет особый интерес для утилизации субстратов углеводородного характера.
Одним из наиболее эффективных средств очистки от нефтяных загрязнений является сорбционная очистка. В работе исследовались отходы сельскохозяйственных культур - шелуха гречихи и шелуха ячменя, которые являются органическими материалами естественного происхождения.
Так, в ходе эксперимента было показано, что утилизация нефти, иммобилизованными штаммами-деструкторами оказалась более эффективной по сравнению со свободными клетками.
При анализе полученных данных выяснилось, что наилучшая трансформация нефти во всех вариантах опыта была достигнута клетками микроорганизмов, иммобилизованными на гранулах с шелухой гречихи (рис. 10, 11), с эффективностью деструкции до 98,17 %. Это означает, что шелуха гречихи является лучшим активатором и биостимулятором растительного происхождения для закрепления НиУОМ, чем шелуха ячменя (в состав шелухи ячменя входит меньшее количество углеводов и липидов). Минеральная среда с иммобилизованными клетками R. maris, P. gladioli, М. agilis на гранулах гречихи
И Минеральная среда с иммобилизованными клетками R. maris, P. gladioli, М. agilis на гранулах ячменя
Шелуха гречихи содержит в себе множество питательных веществ: 23 элемента в разных концентрациях с преобладанием калия, магния, фосфора, бора, кремния и кальция. В составе имеются фосфолипиды и двенадцать кислот, среди которых превалируют пальмитиновая (16:0) и семейство Си кислот, включающих стеариновую (18:0), олеиновую (18:1) и линолевую
Эффективность применения биопрепаратов на основе активных микроорганизмов-нефтедеструкторов для ликвидации нефтяных загрязнений водной среды была показана рядом отечественных и зарубежных исследователей (Скрябин с соавт., 1976; Setzemann et al., 1978; Коронелли с соавт., 1984; Квасников с соавт., 1986; Печуркин, 1990; Барышникова с соавт., 2001; Шкидченко с соавт., 2001; Белоусова с соавт., 2002; Лизунов, 2002; Golodjaev, 2002; Кобзев, 2003; Егоров, 2004; Пирог с соавт., 2005; Андреева с соавт., 2006; Жуков с соавт., 2007; Хуснетдинова, 2009; Бабошин с соавт., 2010). Одновременное использование целого спектра соединений, многие из которых являются взаимозаменяемыми, не под силу популяции одного вида микроорганизмов. Поэтому необходимо создавать управляемую по составу видов смешанную культуру, которая позволяет наиболее полно и экономично утилизировать все компоненты сложного субстрата, за исключением тех искусственно синтезированных, которым нет аналогов в природе (Пономарев с соавт., 1985).
В сложных сообществах микроорганизмы способны осуществлять совместную «метаболическую атаку» на субстрат, когда синтезируются разные компоненты ферментативного комплекса, или же цепочка ферментативных реакций (многосубстратные конверсии), обусловленных жизнедеятельностью разнообразных групп углеводородокисляющих микроорганизмов, собранных в единый консорциум.
В ходе проведенных исследований было показано, что в вариантах со свободными и иммобилизованными клетками микроорганизмов наибольшая эффективность деструкции нефти и нефтепродуктов достигалась в том случае, если в состав консорциума входило 10 культур, что объясняется наибольшим разнообразием бактерий, обладающих разными ферментными системами, способных извлекать углеводороды из субстрата с большей эффективностью (рис. 12, 13).
Во всех вариантах эксперимента с 3 активными культурами степень деструкции нефти была ниже, и составляла для клеток в свободном состоянии от 17,7 % до 45,3 %, на носителях - до 80,17 %, так как, скорее всего, штаммы обладают схожими системами ферментов, что приводит к
Похожие диссертации на Иммобилизация отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов для интенсификации биотехнологических процессов очистки вод от нефтяных загрязнений
