Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Микробная трансформация фенола и его производных . 22
Глава 1.1. Штаммы-деструкторы фенола и его производных. 22
Глава 1.2. Биохимические механизмы и пути расщепления фенола и его производных . 40
Глава 1.3. Биохимические механизмы и пути расщепления нитроароматических соединений. 46
Глава 2. Генетические аспекты биодеградации ароматических соединений . 57
Глава 3. Использование иммобилизованных бактериальных клеток в экологической биотехнологии . 69
Собственные исследования 92
Глава 4. Материалы и методы . 92
Глава 5. Создание коллекции штаммов-деструкторов ароматических соединений < 124
Глава 6. Генетические аспекты утилизации ароматических соединений выделенными штаммами-деструкторами . 137
Глава 7. Характеристика биодеструктивной активности выделенных штаммов 152
Глава 8. Изучение специфической активности штаммов-деструкторов ароматических соединений в иммобилизованном состоянии 188
Глава 9. Использование свободных и иммобилизованных клеток штаммов деструкторов для утилизации ароматических соединений в реальных сточных водах . 215
9.1. Использование свободных и иммобилизованных клеток для очистки фенольных сточных вод . 215
9.2. Микробная очистка фенольных сточных вод процесса термической переработки сланцев 232
Заключение 245
Выводы 281
Список основной использованной литературы. 284
Приложения 341
- Биохимические механизмы и пути расщепления фенола и его производных
- Использование иммобилизованных бактериальных клеток в экологической биотехнологии
- Характеристика биодеструктивной активности выделенных штаммов
- Использование свободных и иммобилизованных клеток штаммов деструкторов для утилизации ароматических соединений в реальных сточных водах
Введение к работе
Актуальность проблемы.
К настоящему моменту во всех странах мира, в том числе и в России, несмотря на существование достаточно большого количества различных законодательных актов и положений об охране окружающей среды, антропогенное загрязнение ее достигло громадных масштабов и постоянно продолжается, поскольку происходит повсеместное наращивание объемов промышленного производства.
Биосфера обладает определенным потенциалом самоочищения от токсических соединений, но эти возможности не безграничны (Кирсо и др., 1988). В целях предотвращения экологической катастрофы меры по защите окружающей среды от увеличивающегося загрязнения различными химическими соединениями, в том числе и фенольными производными, должны постоянно усиливаться. Осуществление этих мер может идти различными путями (Экологическая биотехнология, 1990).
Наиболее эффективным из них является комплекс мероприятий, направленных на предотвращение (уменьшение или полное прекращение) попадания таких соединений в объекты окружающей среды. Это может быть достигнуто путем постоянного совершенствования технологических процессов, переходом на современные безотходные технологии, повышением культуры производства.
К сожалению, в настоящее время этот путь осуществим только в малой степени. Напротив, рост использования устаревших оборудования и технологий приводит к тому, что все большее и большее количество сырья, промежуточных и конечных продуктов предприятий различных отраслей промышленности, в первую очередь химической, попадают в сточные воды, а с ними и в объекты окружающей среды.
Второй путь - использование мероприятий и устройств, предотвращающих поступление в окружающую среду загрязнителей со сточными водами, твердыми отходами и газовыми выбросами, достаточно актуален и эффективен, но, к сожалению, также мало используется. Причина этого в достаточно больших капиталовложениях, необходимых для его реализации через восстановление природных объектов уже загрязненных ксенобиотиками или разработку все новых и новых физико-химических методов очистки производственных сточных вод, создание различных очистных установок и сооружений.
Среди всех этих методов очень часто невозможно выделить физико-химические и биологические отдельно, поскольку в целях повышения эффективности их постоянно комбинируют (Ковалева, Ковалев, 1987). Тем не менее, общепризнанно, что наиболее экологически целесообразными являются биоремедиация объектов окружающей среды и биологическая очистка сточных вод, которые основаны на использовании штаммов микроорганизмов, способных разрушать соответствующие соединения (Алиева, Илялетдинов, 1986; Бельков, 1995; Вербина, 1978; Головлева, 1992, Головлева и др., 1995; Попов, Безбородое, 1999; Bioremediation..., 2000).
В связи с этим одним из путей повышения эффективности очистки фенолсодержащих объектов окружающей среды, и в первую очередь, сточных вод, является использование штаммов бактерий высокоактивных деструкторов их основных компонентов. Эти микроорганизмы с наибольшей вероятностью могут быть выделены различными методами из объектов окружающей среды, загрязненных близкими по химической структуре соединениями (Илялетдинов, Алиева, 1990; Карасевич, 1982; Наумова, 1985; Скрябин, Головлева, 1976).
Для дальнейшего использования такие микроорганизмы могут быть рекомендованы только после селекции среди них штаммов, обладающих наиболее высокой соответствующей специфической активностью, не образующих (накапливающих) в процессе метаболизма интермедиатов, более токсичных, чем исходное соединение, и, конечно, же, непатогенных для человека и животных. Изучение генетической природы детерминирования признаков биодеградации у отобранных таким образом штаммов микроорганизмов является одним из существенных аспектов проблемы утилизации микроорганизмами различных чужеродных соединений (Воронин, Скрябин, 1985). Это связано с тем, что при выявлении внехромосомной природы признаков биодеструкции создаются предпосылки для создания мультиплазмидных штаммов бактерий, способных разлагать сразу несколько компонентов-загрязнителей (Friello, Mylroie, Chakrabarty, 1976; Chakrabarty, Brown, 1979; Chakrabarty, 1980).
Кодирование признака разложения какого-либо соединения плазмидными генами обеспечивает возможность горизонтального распространения этого признака среди клеток бактериальных популяций (Воронин, Цой, 1989), связанную с происходящим обменом генетическим материалом штамма-деструктора с представителями аутохтонной микрофлоры (Fulthorpe, Wyhdham, 1991; Focht, Searles, Koh, 1996).
Однако в последнее время это направление исследований, связанных с выяснением генетического контроля процессов метаболизма ароматических соединений, к сожалению, имеет только теоретический интерес. Их количество значительно сократилось, и сводилось к чисто молекулярно биологическим исследованиям (Harayma, Rekik, 1990; Sayler, Hooper, Laiton, King, 1990), что может быть связано с трудностью получения разрешения на последующее практическое использование генноиженерных (рекомбинантных) микроорганизмов (Chakrabarty, Brown, 1979; Rochkind-Dubinsky, Sayler, Blackburn, 1987).
Тем не менее, независимо от природы генетического детерминирования высокоактивные штаммы-деструкторы ароматических соединений достаточно широко используются для очистки объектов окружающей среды.
Для биоремедиации они чаще применяются в виде бактериальных препаратов, содержащих свободные микробные клетки (Алещенкова, Самсонова, Семочкина, 1997; Васильева, Суровцева, 1994; Грищенков и др., 1996; Илялетдинов, Алиева, 1990; Bioremediation ..., 2000, Crowley, Singer, Gilbert, Newcombe, 1998; Robinson, Lenn, 1994; Weissenfels, Beyer, Klein, 1990).
Для очистки соответствующих сточных вод различных производств микроорганизмы-деструкторы в настоящее время чаще используются в иммобилизованном состоянии (Илялетдинов, Алиева, 1990; Никовская, 1989; Могилевич, 1995; Селивановская и др., 1996; Удод, 1986; Haculinen, Salkinoja-Salonen, 1991).
Это связано с тем, что очистка сточных вод прикрепленной (иммобилизованной) биомассой более устойчива к колебанию рН, температуры, воздействию других неблагоприятных факторов по сравнению со взвешенной свободной биомассой. Кроме того, использование иммобилизованных микроорганизмов в локальных очистных сооружениях позволяет стабилизировать состав микрофлоры, снизить ее вымываемость из биореактора с очищаемой жидкостью, а также создать более компактные проточные биореакторы.
Применительно к технологиям очистки сточных вод в настоящее время для иммобилизации клеток штаммов-деструкторов различных соединений-загрязнителей окружающей среды преимущественно применяются два метода: адсорбция клеток на твердом носителе и/или включение их в различные гели (Dervakos, Webb, 1988). При этом метод иммобилизации микробных клеток и природа носителя как способ применения иммобилизованных бактерий являются основными определяющими при разработке биореакторов соответствующей конструкции.
По данным литературы для проведения биохимической очистки сточных вод в аэробных условиях чаще всего используют капельные биофильтры - биореакторы с неподвижной биопленкой (Экологическая биотехнология, 1990 Biological degradation..., 1994). Среди них существуют реакторы или с псевдоожиженным слоем (частицы суспендированы в восходящем потоке жидкости) или с неподвижным слоем носителя (собственно биофильтры) (Биологическая очистка..., 1985; Яковлев, Воронов, 1982).
Выбор реактора для каждого конкретного процесса определяется множеством факторов — метод иммобилизации, характеристики частиц (форма, размер, плотность, прочность), природа утилизируемого субстрата, влияние ингибиторов, а, кроме того, и гидродинамические и экономические соображения (Форстер, Джонстон, ,1990; Вебб К., 1990; Бейли, Оллис, 1989). Реакторы с псевдоожиженным слоем используются для легких (типа гелевых) носителей или для механически прочных носителей типа песка или волокнистых пористых подушечек как в зарубежных установках типа "Окситрон" или "Кептор" (Форстер, Джонстон, 1990).
В качестве неподвижных носителей в биофильтрах чаще всего используют гравий, щебень, шлак или волокна. Биомасса растет на поверхности насадки в виде пленки, поэтому общая площадь поверхности и адсорбционные свойства носителя являются решающими факторами, обуславливающими эффективность процессов очистки.
В последнее время для очистки фенольных сточных вод чаще всего используются биореакторы с погружной насадкой - когда поток жидкости подается так, что насадка (биокатализатор) полностью в нее погружена. По существу — это реактор с неподвижным слоем. Этот тип биореакторов среди существующих занимает промежуточное положение, соединяя преимущества аэротенков (регулируемая гидравлическая нагрузка) и капельных биофильтров (неподвижная биомасса). Как вариант неподвижной насадки биореактора может использоваться мембрана из искусственных материалов (Peysetal., 1998).
Использование в биореакторах с погружной насадкой твердых носителей с определенным размером частиц (щебень, гравий, керамзит) обуславливает необходимость противотока жидкости и воздуха (воздух подается снизу, а жидкость - сверху). Размер частиц носителя должен быть по возможности однороден, т.к. за счет свободного объема в слое носителя он влияет на перепад давления и на диффузионное сопротивление (Форстер, Джонстон, 1990; Вебб, 1990; Бейли, Оллис, 1989).
Использование в лабораторных исследованиях модельных установок для очистки сточных вод с иммобилизованными клетками штаммов-деструкторов является заключительным этапом перед проектированием и сооружением пилотных промышленных установок, а выбор метода иммобилизации может оказаться решающим не только при их проектировании, но и при дальнейшем использовании.
Таким образом, подводя итог вышесказанному, можно отметить, что в результате плодотворных многолетних исследований отечественных и зарубежных ученых по теоретическим и прикладным аспектам микробных методов борьбы с загрязнением окружающей среды сформировалось целая новая отрасль науки - экологическая биотехнология. Несмотря на это, проблемы, связанные с необходимостью изучения закономерностей биологических процессов при очистке сточных вод от различных ксенобиотиков, и, в частности, от фенола и его производных, не теряют своей значимости и актуальности, и в настоящее время.
Это связано с тем, что алгоритм разработки эффективной биотехнологии очистки сточных вод какого-либо конкретного производства всегда требует дополнительных исследований по целому комплексу проблем. Это - поиск и выделение наиболее активных штаммов-деструкторов, их характеристика, изучение специфической активности свободных и иммобилизованных клеток ранее селекционированных микроорганизмов, разработка лабораторных модельных установок и их испытание на пробах соответствующих сточных вод в зависимости от выбранного метода иммобилизации. В этой связи целью настоящей работы явилось научное обоснование и разработка технологии локальной микробной очистки реальных сточных вод от фенола и его производных, позволяющей повысить ее эффективность. Для ее достижения предстояло решить следующие задачи:
1. Разработать принципы поиска и выделения штаммов-деструкторов ароматических соединений - компонентов фенольных сточных вод среди микроорганизмов различных биоценозов окружающей среды;
2. Создать коллекцию активных штаммов-деструкторов фенола и его производных, изучить их биологические свойства;
3. Подобрать оптимальные условия проявления селекционированными штаммами бактерий деструктивной активности, определить возможность ее зависимости, как от химической структуры загрязнителя, так и таксономической принадлежности бактерий;
4. Определить основные пути микробного метаболизма изучаемых соединений - компонентов фенолсодержащих сточных вод и природу генетического детерминирования признаков биодеградации у некоторых из выделенных штаммов;
5. Разработать эффективные биокатализаторы, содержащие свободные или иммобилизованные бактериальные клетки селекционированных штаммов-деструкторов, для очистки реальных сточных вод различных производств от фенола и его производных (методы наработки биомассы, подбор оптимального метода иммобилизации);
6. Разработать методические подходы практического использования бактерий для локальной микробной очистки реальных сточных вод различных производств от фенола и его производных (тип биореактора соответствующий подобранному носителю для иммобилизации, оценка эффективности очистки фенолсодержащих сточных вод, оптимальные условия работы лабораторных модельных установок).
Биохимические механизмы и пути расщепления фенола и его производных
К настоящему времени изучение биохимических механизмов и путей расщепления ароматических соединений сложилось в отдельное направление в области исследования процессов микробиологической утилизации фенола и его производных, которое постоянно ведется параллельно поиску и выделению штаммов-деструкторов (Наумова, 1985; Dagley, Evans, Ribbons, 1960; Evans, 1956; Haribabu, Kamath, Vaidyanathan, 1984; Reineke, 1998).
При этом было показано, что один и тот же микроорганизм может разлагать различные ароматические соединения по совершенно независимым метаболическим путям с образованием разных интермедиатов (Дуган, Головлев, 1985; Карасевич, 1982; Рубан, 1986; Hollender, Dott, Норр, 1994; Rosenberg, Hegeman, 1969; Seidman, Toms, Wood, 1969).
Поскольку в нашей работе мы, хотя и недостаточно глубоко касаемся вопросов путей метаболизма ароматических соединений штаммами нашей коллекции, мы посчитали целесообразным рассмотреть основные работы, описывающие те или иные ключевые моменты микробного метаболизма фенола и особенно его нитрозамещенных производных.
В зависимости от исходного соединения (фенол или его ближайшие окисленные производные) в качестве первого промежуточного продукта в результате окисления образуется пирокатехин, протокатеховая кислота или гидрохинон (Карасевич, 1982; Ribbons, 1965; Rogoff, 1961; Rogoff, Wender, 1962).
Биодеградация фенола под воздействием монооксигеназы (фенолгидрооксилазы) всегда идет через стадию образования пирокатехина, хотя этот фермент также может отличаться у различных микроорганизмов (Карасевич, 1982; Buswell, 1975).
Пирокатехин, кроме того, является промежуточным соединением метаболизма бензола, бензойной, салициловой, антраниловой, п-оксибензойной, 2,3-бензойной кислоты, а также ряда более сложных ароматических соединений, например, миндальной кислоты или нафталина, при бактериальном разложении которых образуются вышеперечисленные соединения (Карасевич, 1982; Наумова, 1985; Gibson, 1968; Patel, Grant, 1969).
Следует отметить, что образование фенолов как интермедиатов при разложении 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты штаммом Arthrobacter sp. (Loos, Roberts, Alexander, 1967; Tiedje et al., 1969) не сказывается на их дальнейшем разложении до пирокатехина. В то же время образование фенола при метаболизме п-оксибензойной кислоты штаммом Klebsiella aerogenes (Patel, Grant, 1969) является примером летального синтеза, так как его накопление в среде приводит к гибели бактерий-деструкторов.
Примеры летального синтеза, т.е. образование в процессе метаболизма промежуточных продуктов, более токсичных или более устойчивых к микробному разложению, чем исходное соединение, описаны А.В.Наумовым с соавт. (1999). Авторы изучали процессы трансформации 2,4,6-тринитротолуола выделенными из окружающей среды лактобактериями и установили, что при этом образуются гидроксиламинопроизводные, подавляющие развитие штаммов-деструкторов. Аналогичное явление наблюдали М. Haggblom, D. Janke, P. Middeldorp, M.S. Salkinoja-Salonen (1989) при изучении процессов утилизации хлорфенолов родококками. В их экспериментах токсическими интермедиатами были хлоранизолы. N. Sethunathan, Т. Yoshida (1972) описан штамм Flavobacterium sp., который мог гидролизовать паратион по фосфоэфирной связи с образованием диэтилтиофосфоната и п-нитрофенола, однако дальнейшей утилизации последнего не происходило.
Расщепление ароматического кольца является необходимым этапом биохимического разрушения многих соединений. Для пирокатехина оно осуществляется различными видами микроорганизмов путем раскрытия связи углерод-углерод или ближней к гидроксилу (мета-расщепление) или между двумя гидроксилами (орто-расщепление) (Evans, 1963; Hardisson, Salarepat, Stanier, 1963).
Фермент пирокатехин-2,3-оксигеназа, осуществляющий экстрадиольное расщепление ароматического кольца пирокатехина, был подробно изучен рядом исследователей и назван метапирокатехазой (Gibson, 1971; Kojima, Itada, Hayaichi, 1961; Nozaki, 1970). Более точная структура и частично аминокислотный состав этого фермента были определены позднее С. Nakai et al (1983). Объектом изучения служил бесклеточный экстракт штамма P.putida mt2, выращенного в среде с дрожжевым экстрактом, пептоном и бензойной кислотой. Под воздействием метапирокатехазы из пирокатехина образуется енол- или кето- формы полуальдегида 2-оксимуконовой кислоты.
В дальнейшем из этого соединения, в зависимости от вида микроорганизма-деструктора и его особенностей, могут образовываться различные интермедиаты, но конечные продукты этого пути всегда одни и те же - пировиноградная кислота и ацетальдегид, окисляющийся в дальнейшем в уксусную кислоту. Оба эти соединения легко вовлекаются в метаболические пути микробной клетки (Коренева, Миронова, Лосикова, 1977; Суровцева и др., 1980; Dagley, 1971).
Мета-путь расщепления фенола обнаружен у микроорганизмов различной таксономической принадлежности: Bacillus stearothermophilus (Buswell, 1975), Pseudomonas putida NCIB10015 (Bayly, Wigmore, 1973; Murray, Williams, 1974), Alcaligenes eutrophus ATCC17697 (Johnson, Stainier, 1971b) и др..
Начальное разложение пирокатехина по орто-пути (интрадиольное) происходит под действием фермента пирокатехин-1,2-оксигеназы, который получил название пирокатехаза (Kojima et al., 1967; Gibson, 1971). Образующаяся при этом цис,цис-муконовая кислота через (+)лактон муконовой кислоты и енол-лактон-3-кетоадипиновой кислоты превращаются в 3-кетоадипиновую кислоту. Этот тип расщепления ароматического кольца пирокатехина получил название 3-кетоадипатного пути. Никаких отклонений от такой последовательности реакции у различных микроорганизмов, способных разрушить пирокатехин по указанному типу, не обнаружено. Конечными продуктами метаболизма пирокатехина по орто-пути являются янтарная кислота и ацетил-КоА — классические метаболиты микробной клетки (Rogoff, Wender, 1962; Stanier, Ornston L.N., 1973).
Ключевые ферменты орто-пути разложения ароматических соединений, их взаимосвязь, регуляция и методы изучения образующихся интермедиатов были достаточно подробно исследованы на штамме P.putida, способном утилизировать бензойную кислоту и ее производные в качестве единственного источника углерода (Meagher, Ornston L.N., 1973; Ornston L.N., 1966; Ornston L.N., Stanier, 1966; Parke, Meagher, Ornston L.N., 1973), a также штаммах P.acidovorans, P.testosteroni (Ornston M.K., Ornston L.N., 1972), Bacterium NCIB8250 (Acinetobacter calcoaceticus) (Beveridge, Tall, 1969; Jones, Jansen, Mc Kay, 1973), Trichosporon cutaneum, Candida tropicalis (Gaal, Neujahr, 1979; Neujahr, Varga, 1970; Neujahr, Linsjo, Varga, 1974; Varga, Neujahr, 1970), Candida tropicalis HP 15 (Krug, Ziegler, Straube, 1985), Streptomyces setonii (Antai, Crawford, 1983).
Использование иммобилизованных бактериальных клеток в экологической биотехнологии
Выделение, отбор (селекция) или генно-инженерное конструирование штаммов-деструкторов различных органических соединений - это лишь первый шаг в решении одной из наиболее важных задач современной экологической биотехнологии - разработке методов биологической очистки промышленных сточных вод.
Наиболее распространенная в настоящее время технология биологической очистки сточных вод, включающая в себя их первичное отстаивание, биологическую очистку в аэробных условиях и метановое сбраживание осадков, в том числе избыточного активного ила, к сожалению, довольно энергоемка и требует значительных капитальных затрат. Главный же недостаток состоит в том, что подобные системы очистки не позволяют достаточно эффективно избавляться от трудноразлагаемых высокотоксичных соединений, присутствующих в высоких концентрациях в сточных водах большинства российских промышленных предприятий (Яковлев, Скирдов, 1987).
Сточные воды конкретного производства достаточно стабильны по составу и концентрации загрязнителей, поэтому в настоящее время все чаще применяют локальные очистные сооружения. Их использование позволяет подавать на последующие общезаводские (или городские) очистные сооружения сточные воды с более низкими концентрациями загрязняющих веществ, что приводит к более эффективной их очистке.
М. Krzemieniewski (1989) предлагает комбинированный электробиологический способ очистки сточных вод, позволяющий, по его мнению, достигать более высокой степени очистки по сравнению с традиционными методами.
Один из предлагаемых вариантов решения проблемы биологической очистки фенольных сточных вод заключается в повышении эффективности работы биореакторов за счет оптимизации состава их биоценозов путем введения в них культур-деструкторов соответствующих соединений или активизации автоселекционных процессов. Положительный эффект при очистке фенолсодержащих сточных вод может дать интенсификация процессов деструкции и автоселекции использованием в реакторах различных носителей, а дополнительное применение высокоактивных штаммов-деструкторов конкретных соединений позволит полностью или частично устранить основные компоненты сточных вод (Гвоздяк с соавт., 1989; Рыбникова, Закиева, 1990; Ни Lin, Shieh, 1987).
При разработке способов практического применения микробной очистки сточных вод, как и других различных биотехнологических процессов, одним из основополагающих принципов является применение иммобилизованных клеток микроорганизмов.
Иммобилизация позволяет не только создавать высокую концентрацию клеток микроорганизмов-деструкторов путем закрепления их на поверхности нерастворимых в воде носителей, но и при проточном режиме работы очистного сооружения предотвращать вынос из него с током жидкости микроорганизмов-деструкторов, т.е. удерживать в биореакторе необходимое количество биокатализатора на определенный промежуток времени. Внесение в реакторы закрепленных на носителях адаптированных к соответствующим соединениям микробных сообществ улучшает очистку сточных вод, в том числе и фенольных, а возврат вымываемых свободных клеток микроорганизмов в начало процесса очистки приводит к снижению интенсивности биодеструкции (А. с. 1 386589 СССР; Гвоздяк, 1987; Загорная и др., 1987).
Использование биомассы клеток бактериальных штаммов-деструкторов в иммобилизованном состоянии показало, что утилизации могут подвергаться органические соединения — компоненты сточных вод, обладающие различной химической структурой и токсичностью, например: н-тетрадекан (El-Aassar, Omar, Rehm, 1988), фенол (Anselmo et al., 1985; Anselmo, Cabral, Novais, 1989; Bettmann, Rehm, 1984 и др.), 4-хлорфенол (Westmeier, Rehm, 1985 и др.), бензол (Somerville et al., 1977), 2,3-хлорбензол (Sahasrabudhe, Amin, Modi, 1985), и многие другие.
Иммобилизация штаммов-деструкторов на носителях ведет не только к физическому закреплению клеток на их поверхности. Например, S.Rothenburger, R.M. Atlas (1993) установили, что хинолин-деградирующая культура P.putida в иммобилизованном состоянии приобретала новое свойство — способность использовать как единственный источник углерода и энергии его производное - 6-метилхинолин.
Совершенно очевидно, что самым важным условием успешного получения и последующего применения биокатализатора является сохранение микроорганизмами в процессе иммобилизации своей специфической активности.
Использование в различных биотехнологиях, в том числе связанных с очисткой сточных вод, иммобилизованных микробных клеток по сравнению со свободными имеет целый ряд вполне конкретных, достаточно известных и неоспоримых преимуществ. Отметим основные из них.
1. При иммобилизации происходит физическое разделение раствора и катализатора (клеток, клеточных фракций, ферментов), при котором молекулы субстрата и продукта могут легко обмениваться между фазами (Кирстен, Кафлен, 1988);
2. Возможность многократного использования полученного биокатализатора (Tramper, 1985), что связано с формированием в околоклеточном пространстве специфических микрозон на поверхности раздела твердой фазы и жидкости, в которых диффузия субстратов, метаболитов и растворенных в воде газов происходит иначе, чем около свободных клеток (Виске, 1986);
3. Повышение операционной стабильности клеток (Kloosterman, 1985), в том числе и рекомбинантных (Kumar, Schugerl, 1990); 4. Возможность использования более высоких температур культивирования клеток;
5. Возможность создания и использования стабильных консорциумов микроорганизмов (Звягинцев, 1987);
6. Упрощение решения инженерных проблем при конструировании биореакторов (Black, 1986) и значительное уменьшение капитальных и энергетических затрат на создание непрерывных биотехнологических процессов (Булыгин с соавт., 1987), в том числе возможность создания в различного типа биореакторах проточных систем очистки сточных вод;
7. Защита микробных клеток от действия фагов (Steenson et al., 1987);
8. Защита микробных клеток от высоких концентраций токсичного для них субстрата (Bettmann, Rehm, 1984; Shim, Yang, 1999), в том числе возможность обработки более высоких концентраций токсичных для клеток ксенобиотиков;
9. Увеличение сохраняемости (жизнеспособности и специфической деструктивной активности) микробных клеток при деструкции ксенобиотиков;
Характеристика биодеструктивной активности выделенных штаммов
Как и любой биотехнологический процесс, связанный с проявлениями специфической активности тех или иных микроорганизмов, процесс микробной утилизации ароматических соединений весьма чувствителен к различным воздействиям (Баснакьян, 1992; Громов, Павленко, 1989). Основными лимитирующими факторами, оказывающими влияние на процесс микробного метаболизма органических соединений, в том числе разложения фенола и его производных, являются:
- температура культивирования;
- степень насыщения среды культивирования кислородом (аэрация среды);
- рН среды;
- исходное количество микробных клеток (посевная доза);
- исходная концентрация органического субстрата (Бейли, Оллис, 1989; Экологическая биотехнология, 1990; Яковлев, Карюхина, 1980).
Изучение влияния этих факторов на процесс утилизации субстрата бактериями позволяет выявить оптимальные условия культивирования с целью создания условий, обеспечивающих максимальную скорость и полноту разрушения загрязнителя,«что немаловажно при разработке систем очистки соответствующих сточных вод.
Для фенола и его производных, как для "субстратов-ядов" (Карасевич, 1982) при их микробном метаболизме основными лимитирующими факторами являются исходная концентрация ароматического субстрата и возможность образования в процессе разложения промежуточных продуктов более токсичных для микроорганизмов, чем исходное соединение.
Помимо этого одной из важнейших характеристик штаммов при их возможном практическом использовании в процессах очистки сточных вод является спектр их деструктивной активности (субстратная специфичность), то есть способность штаммов утилизировать помимо фенола, как его производные, так и другие природные и неприродные трудноокисляемые соединения различной химической структуры. Круг изучаемых в наших исследованиях субстратов формировался из наиболее экологически значимых ароматических соединений — загрязнителей окружающей среды, а также из вероятных интермедиатов их микробного метаболизма.
При исследовании влияния температуры культивирования на деструктивную активность всех изученных штаммов из созданной нами коллекции были получены сходные результаты, независимо от природы разлагаемого субстрата. Для всех выделенных штаммов диапазон температур 25-30 С оказался оптимальным. Снижение этого параметра до 20 С, равно как и его повышение до 35-37 С существенно угнетало специфическую активность изученных штаммов (до 20-30 % и 10-20 % от исходного уровня, соответственно). Однако после изменения температуры культивирования и доведения ее до оптимальной уровень деструктивной активности восстанавливался до исходного достаточно быстро (в течение 12-24 часов в зависимости от таксономической принадлежности штамма-деструктора).
Исходя из этого, при проведении всех последующих экспериментов по изучению процесса биодеградации фенола и его производных наиболее активными отобранными ранее штаммами бактерий использовалась температура культивирования равная 30 С.
Для всех штаммов, которые являются аэробными или факультативно-анаэробными микроорганизмами, метаболизм ароматических субстратов идет окислительным путем (Карасевич, 1982; Наумова, 1985; Cerniglia, 1981; Gibson, 1971). При изучении штаммов-деструкторов из созданной нами коллекции, как и, следовало ожидать, время полного разложения субстрата значительно сокращалось при культивировании в условиях принудительной (усиленной) аэрации. Установлено, что немаловажную роль при этом играют и сами методы осуществления принудительной аэрации, обуславливающие различную степень насыщения среды культивирования растворенным кислородом - культивирование на круговой качалке, в ферментере, и, наконец, в биореакторе.
Это весьма наглядно можно продемонстрировать на примере штамма-деструктора фенола A.faecalis KSV21, который при использовании одинаковой посевной дозы (107 микробных клеток/мл) и культивировании в периодическом режиме полностью разрушал фенол при его концентрации в среде 0,5 г/л в условиях ограниченной аэрации - за 72-96 часов, при культивировании на круговой качалке (160 об/мин) - за 48 часов, а в ферментере — за 20-24 часа (рис. 4).
Прямая зависимость интенсивности процесса утилизации субстрата от условий усиленной аэрации (культивирование на круговой качалке и в ферментере) достаточно четко была показана и для штамма P.putida GFS-106, при использовании 0,5-0,75 г/л диметилфенилкарбинола в качестве единственного источника углерода (рис. 5).
Как видно из этого рисунка 5, разложение основного количества диметилфенилкарбинола (до 35,2 % и 1,6% от исходного, соответственно) этим штаммом псевдомонад происходило в течение 48 часов при достаточно продолжительном периоде утилизации остаточных количеств субстрата.
Нитрофенолы являются хорошо известными разобщителями процессов дыхания и окислительного фосфорилирования (Spain, Wyss, Gibson, 1979), с чем и связано их ингибирующее действие на микробные клетки. В связи с этим изучение влияния интенсивности аэрации на процессы утилизации нитрофенолов представляло особый интерес. При этом было установлено, что не только деструкция различных нитрофенолов, но и рост клеток изученных штаммов P.putida БА-11, A.calcoaceticus МН-21, Corynebacterium sp. 0-31, Corynebacterium sp. ПНК-2, Corynebacterium sp. T-2 невозможен даже в мягких анаэробных условиях. С другой стороны, можно было предположить, что интенсивность аэрации будет приводить к увеличению скорости деградации субстрата, поскольку все выделенные штаммы являются аэробами.
Использование свободных и иммобилизованных клеток штаммов деструкторов для утилизации ароматических соединений в реальных сточных водах
Высокая насыщенность окружающей среды фенолом и его производными, обладающими токсичностью для биосферы, делает целесообразным разработку способов устранения этого загрязнения. Основой любых микробных методов очистки окружающей среды от загрязнения ароматическими соединениями являются микроорганизмы, способные разлагать эти субстраты не только в синтетических минеральных средах, но и в составе реальных сточных вод, хотя, например, бактерии рода Alcaligenes могут усиливать механическую- очистку стоков, повышая процесс хлопьеобразования (Patent 4 356268 USA).
Для изучения проявления специфической активности отобранных нами штаммов, обладающих хорошими деструктивно-кинетическими характеристиками в отношении фенола и его производных, в условиях, максимально приближенных к производственным, в качестве объекта исследований были выбраны сточные воды, содержащие одно или несколько соответствующих соединений в качестве компонентов.
В начальных модельных экспериментах, близких с описанными для Pseudomonas sp. ВІЗ, Alcaligenes sp. A7 (Schmidt E., Hellwig, Knackmuss, 1983), на образцах общезаводских сточных вод химического комбината (г.Саратов), содержащих цианиды, фосфаты (до 10 г/л), азот аммонийный (до 40 г/л), роданиды (до 30 г/л), соли меди (до 0,5 г/л), сульфаты (до 0,6 г/л), соли натрия (до 1,0 г/л), нитрил акриловой кислоты (до 0,5 г/л), этиловый спирт (до 20 г/л), ароматические соединения (до 1,0 г/л, в том числе фенол — до 0,3 г/л) изучали деструктивную активность штамма A.faecalis KSV21. Для этого в пробу сточных вод (рН 6,8 - 7,0) объемом 0,1 л вносили взвесь суточной культуры A.faecalis KSV21 до конечной концентрации 2x104 клеток/мл. После суточного культивирования в условиях аэрации при температуре 30 С (оптимальные условия) фенол при спектрофотометрическом определении в сточных водах не обнаруживался. Это указывало на то, что содержание его в среде не превышало 0,005 г/л (граница чувствительности метода) , то есть, снижалось не менее чем в бОраз. В то же время концентрация фенола в контрольном образце сточных вод (без внесения испытуемого штамма) сохранялась на прежнем уровне.
Таким образом, эти эксперименты показали, что штамм A.faecalis KSV21, внесенный в сточные воды химического предприятия, содержащие значительные количества фенола (до 0,3 г/л), активно разлагал последний, снижая его содержание за 24 часа до величин порядка менее 0,005 г/л.
В дальнейшем в качестве объекта исследований деструктивной активности выделенных культур служили пробы сточных вод производства фенола и ацетона кумольным методом. В их состав входили различные высокотоксичные для микробных клеток соединения (ароматические и неароматические): фенол, диметилфенилкарбинол, гидроперекись изопропил бензол а, ацетофенон, окись мезитила и др.. Содержание этих соединений, а, следовательно, и соотношение их концентраций, в различных пробах сточных вод варьировало в достаточно широких пределах (разность содержания того или иного, в основном ароматического, компонента, могла составлять до нескольких сотен мг/л в зависимости от пробы).
Как правило, сточные воды перед биологической очисткой подвергают определенной обработке, которая чдще всего включает их нейтрализацию до нейтральных значений рН - 7,0-7,2, внесение по мере необходимости минеральных солей, в первую очередь ионов азота (аммоний) и фосфора (фосфатов натрия или калия), удаление из сточных вод грубых взвешенных частиц, а также наиболее токсичных соединений. Все эти процедуры необходимы для нормального культивирования микробных клеток и сохранения их деструктивной активности (Экологическая биотехнология, 1990).
В сточных водах производства фенола и ацетона кумольным методом наиболее токсичным соединением является гидроперекись изопропилбензола (гипериз). Необходимо отметить, что заводскими контролирующими службами уделяется внимание только содержанию фенола (3,0 - 8,0 г/л) и показателю ХПК, а наличие гипериза в сточных водах не учитывается, хотя его концентрация может составлять до 10,0 - 20,0 г/л, и такие сточные воды могут считаться условно чистыми. При данной технологии основное количество гипериза в составе общезаводских сточных вод обеспечивают сточные воды цеха получения гидроперекиси изопропилбензола (гипериза), поскольку в его технологической схеме отсутствуют системы физико-химической очистки (экстракция эфирами, пропарка перегретым паром на колонне и т.п.), входящие в состав технологий, используемых в других цехах, в частности, цеха получения изопропилбензола.
Одним из путей нейтрализации антибактериального действия гипериза является снижение его концентрации в сточных водах путем их разбавления. Однако только значительное разбдвление в несколько сот раз позволяло исследуемым микроорганизмам-деструкторам и микроорганизмам активного ила выживать в пробах этих сточных вод (Федоров, Костенберг, Барковский, 1989; Федоров и др., 1993). При этом практически к нулю сводились ресурсы углерода и энергии в среде культивирования, поэтому перед биологической очисткой необходимо удаление этого соединения физико-химическими методами.
