Введение к работе
Актуальность проблемы. Оптически активные (энантиомерно однородные, хиральные) органические сульфоксиды находят широкое применение в химической и фармацевтической практике. В асимметрическом синтезе сульфоксидная группа используется в качестве активного центра, способного с высокой степенью стереоселективности определять направление химических реакций. В современной медицине используются антибактериальные, противоязвенные, противовоспалительные и анальгетические препараты на основе сульфоксидсодержащих соединений. С учётом различия в скорости метаболизма (S)- и (7?)-энантиомерных сульфоксидов антисекреторных средств (пантопразола, рабепразола, лансопразола, омепразола, тенатопразола и др.) разработаны современные эффективные лекарственные препараты на основе индивидуальных энантиомеров (Захарова, 2008; Cotton et al., 2000; Andersson et al., 2001).
Получение оптически активных сульфоксидов осуществляется в основном методами химического синтеза. Однако при получении энантиомерно чистых сульфоксидов химическим путем не всегда достигается высокая энантиоселективность реакций (Толстиков и др., 2003). Альтернативой многостадийному химическому синтезу оптически активных соединений выступают биологические технологии, позволяющие существенно повысить уровень регио- и стереоселективности реакций (Сагепо, 1995; Solladie et al., 1995; Holand et al, 2002, 2003). В качестве биокатализаторов процесса окисления прохиральных сульфидов используются ферментные препараты (оксигеназы, пероксидазы) и целые микробные клетки. Однако промышленное использование чистых ферментов, несмотря на их высокую регио- и стереоселективность, ограничивается из-за проблем, связанных с очисткой, препаративным выделением и сохранением стабильности индивидуальных ферментов. Кроме того, спектр веществ, которые могут превращаться интактными микробными клетками, намного
4 шире. Специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем,
отсутствие проблемы с добавкой оксиданта и регенерацией кофермента,
устойчивая активность в экстремальных условиях внешней среды
обусловливают технологическую перспективность использования целых
клеток микроорганизмов в процессах асимметрического окисления
сульфидов.
В настоящее время в реакциях окислительной биотрансформации
многих органических соединений - алифатических и ароматических
углеводородов, изопреноидов, стеринов, стероидов и их структурных
аналогов всё чаще используются актинобактерии рода Rhodococcus,
обладающие высокой активностью оксигеназных ферментных комплексов
(Larkin, Kulakov, Allen, 2006; Martinkova et al., 2009). Родококки успешно
применяются в качестве биокатализаторов процесса десульфуризации
серосодержащих компонентов нефти, начальным этапом которого является
образование сульфоксидов. Недавно показана технологическая
перспективность использования цитохром Р-450 зависимых монооксигеназ
родококков в реакциях селективного биокаталитического синтеза
арилалкилсульфоксидов (Liu et al., 2006; Jackson et al., 2007; Zhang et al.,
2010). Вместе с тем, известны лишь единичные примеры использования
представителей R. equi и R. erythropolis в реакциях окисления прохиральных
сульфидов в оптически активные сульфоксиды. Низкая эффективность таких
реакций обусловлена высокой концентрацией используемых субстратов
и патогенностью культур R. equi (ОЫа. et al., 1984, 1985), либо низкой
концентрацией трансформируемых сульфидов при высокой нагрузке
биокатализатора (Holand et al, 2003). В связи с этим поиск новых культур
родококков, катализирующих целевые реакции биотрансформации
прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды
является весьма актуальным.
5 Цель настоящей работы - исследование возможностей использования
актинобактерий рода Rhodococcus для эффективной окислительной
биотрансформации прохирального фенилметилсульфида (тиоанизола).
Основные задачи исследования
Исследовать окисляющую активность коллекционных штаммов родококков разных видов в отношении арилалкильного сульфида тиоанизола.
Выявить оптимальные условия для окислительной биоконверсии тиоанизола с использованием свободных клеток родококков.
Провести сравнительное исследование каталитической активности свободных и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков при биотрансформации тиоанизола.
На основе иммобилизованных клеток родококков разработать эффективный биокатализатор для окисления тиоанизола и его гомологов в оптически активные арилалкилсульфоксиды.
Научная новизна. Проведен сравнительный анализ биокаталитической
активности коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus
в отношении арилалкильного сульфида тиоанизола. Выявлено, что родококки
разных видов катализируют образование как (R)-, так и (5)-сульфоксида
тиоанизола. Показано, что сульфидокисляющая активность родококков не
является видоспецифичной и реализуется в присутствии дополнительных
источников углерода. Наиболее эффективными ростовыми субстратами
в процессе окислительной биотрансформации тиоанизола являются глицерин
и н-гексадекан. Обнаружена обратная зависимость сульфидокисляющей
активности родококков от концентрации н-гексадекана в среде их
культивирования. Определены оптимальные условия направленного
окисления тиоанизола в оптически активный (5)-сульфоксид
с использованием иммобилизованных в матрицу криогеля на основе
поливинилового спирта (ПВС-криогеля) клеток родококков.
Экспериментально подтверждено, что иммобилизованные клетки родококков
характеризуются высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию повышенных концентраций тиоанизола.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представление о возможности использования бактерий для регио- и стереоселективной биотрансформации прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды. В результате проведенных исследований выявлены штаммы Rhodococcus spp., активно катализирующие направленное образование энантиомерно обогащенных сульфоксидов. На основе иммобилизованных в ПВС-криогеле клеток родококков разработан эффективный биокатализатор с высокой сульфидокисляющей активностью, обладающий длительной сохранностью функциональной стабильности и возможностью многократного использования для биотрансформации тиоанизола. Полученные экспериментальные данные представляют интерес для разработки биотехнологических способов получения практически значимых соединений - сульфоксидсодержащих интермедиатов тонкого органического синтеза, оптически чистых изомеров лекарственных препаратов, а также биокатализаторов процессов селективного извлечения сероорганических примесей из различных фракций нефти. Полученная информация о наиболее активных бактериальных биотрансформаторах тиоанизола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в каналах сети Интернет ().
Основные положения, выносимые на защиту
1. Свободные клетки родококков катализируют селективное окисление тиоанизола с образованием целевого (R)- или (5)-сульфоксида в соокислительных условиях. Сульфидокисляющие свойства родококков не являются видовой характеристикой, а определяются специфичностью штаммов и условиями их культивирования.
2. Родо кокки наиболее активно трансформируют тиоанизол
в присутствии н-гексадекана (0,1 об.%) при щелочных значениях рН (8,0) и оптимуме температуры 28С.
Иммобилизация родококков в матрицу ПВС-криогеля повышает сульфидокисляющую активность бактериальных клеток при использовании тиоанизола и его гомологов и одновременно сокращает продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола по сравнению со свободными клетками в 4 раза.
Разработанный на основе иммобилизованных клеток родококков биокатализатор характеризуется высокой сульфидокисляющей активностью, возможностью эффективного использования для получения оптически активных (5)-арилалкилсульфоксидов на протяжении четырех последовательных циклов и высокой устойчивостью при хранении в течение 12 месяцев при пониженной температуре +4С.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал", Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008; VI и VII Международных конференциях "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии", Минск, 2008 и 2010; V Всероссийской молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, 2009; II Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов "Симбиоз-Россия 2009", Пермь, 2009; The XIII Annual Symposium for Biology Students of Europe, Kazan, 2009; III Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов "Симбиоз-Россия 2010", Н. Новгород, 2010.
8 По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе
2 статьи в научных журналах "Прикладная биохимия и микробиология"
и "Вестник Пермского университета".
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 11 таблиц и 24 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 128 наименований работ, в том числе 46 отечественных и 82 зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека" (номер госрегистрации 01.9.70 005279), Работа поддержана грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Биологическое разнообразие" (№ 09-П-4-1034, номер госрегистрации 01200963679), Президента РФ "Ведущие научные школы" (№ НШ-64403.2010.4), Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (№ 10-04-96032), а также Стипендией Пермского края для молодых ученых.