Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологические особенности актинобактерий рода Rhodococcus 10
1.1. Экологическая характеристика родококков 10
1.2. Пути ассимиляции углеводородных субстратов 12
Глава 2. Адгезивная активность микроорганизмов в отношении жидких гидрофобных соединений 22
2.1. Физико-химические свойства углеводородов и масел 22
2.2. Адгезия как механизм адаптации микроорганизмов к условиям внешней среды; термодинамические аспекты и механизмы процесса адгезии 26
2.3. Использование адгезивных свойств микроорганизмов в биотехнологии 42
2.4. Адсорбционная иммобилизация клеток микроорганизмов 47
2.5. Состояние проблемы адгезии актинобактерий рода Rhodococcus к жидким гидрофобным соединениям 53
Экспериментальная часть
Глава 3. Материалы и методы исследования 56
3.1. Рабочая коллекция, условия культивирования родококков 56
3.2. Тп5-мутагенез клеток родококков 61
3.3. Определение адгезивной активности исследуемых культур в отношении жидких углеводородов и их производных 64
3.4. Определение степени гидрофобности клеток родококков 65
3.5. Определение общего липида в клетках родококков 67
3.6. Оценка углеводород окисляющей активности родококков 68
3.7. Определение термодинамических характеристик клеток родококков на границе раздела фаз вода-воздух и вода-углеводород 68
3.8. Адсорбционная иммобилизация клеток микроорганизмов в колонке, содержащей криогель на основе полиакриламида 69
3.9. Определение жизнеспособности и функциональной активности иммобилизованных на гелевом носителе клеток 71
3.10. Статистическая обработка результатов исследования 72
Глава 4. Характеристика адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus 73
Глава 5. Термодинамические свойства клеток родококков при взаимодействии с жидкими углеводородами 114
Глава 6. Адсорбционная иммобилизация клеток родококков на полиакриламидном геле 121
Заключение 142
Выводы 145
Список литературы 161
- Пути ассимиляции углеводородных субстратов
- Рабочая коллекция, условия культивирования родококков
- Характеристика адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus
- Адсорбционная иммобилизация клеток родококков на полиакриламидном геле
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бактериальная адгезия является начальным этапом процесса ассимиляции и биотрансформации органических субстратов. Повышенный интерес исследователей к процессам адгезии бактериальных клеток к углеводородным соединениям и их производным обусловлен возрастающим загрязнением окружающей среды гидрофобными ксенобиотиками (Johnsen et al., 2005; Liu et al, 2009). Гетерофазные микробиологические процессы находят всё более широкое применение в биотехнологиях получения красителей и ароматизаторов на основе углеводородного сырья (Morrish et al., 2008; Garikipati et al., 2009), биотрансформации сложных органических соединений (Leon et al., 1998; Janikowski et al., 2002), а также в биотехнологиях очистки загрязненных углеводородами и маслами сточных вод (Quijano et al., 2009). Необходимо отметить, что если особенности адгезии микроорганизмов к твердым поверхностям и формирования биопленок в настоящее время интенсивно изучаются (Романова и др., 2006; Николаев, Плакунов, 2007; Speranza et al., 2004; Tsuneda et al., 2004; Bayoudh et al., 2006), то сведения об адгезивной активности бактериальных клеток в отношении жидких гидрофобных соединений немногочисленны и касаются, в основном, представителей грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas и Acinetobacter (Rosenberg, 2006; Zoueki et al., 2010). Бактериальная адгезия к жидким углеводородам отдельными авторами (Busscher, van der Mei, 2006; Munoz et al., 2007) рассматривается как механизм образования биопленок в водно-углеводородных средах, которые применяются в гетерофазных биореакторах. Аналогичные механизмы реализуются при бактериальной колонизации различных твердых поверхностей (трубопроводного и емкостного нефтяного оборудования, медицинского инструментария), покрытых жидкими гидрофобными пленками (Lejeune, 2003; Brakstad, Bonaunet, 2006).
Актинобактерии рода Rhodococcus - сравнительно новый объект промышленного использования, характеризующийся наличием полифункциональных оксигеназных ферментных комплексов и способностью к окислительной трансформации широкого спектра природных и антропогенных углеводородов. Адгезивные свойства родококков обусловливают эффективность процесса усвоения углеводородных субстратов и обеспечивают конкурентное преимущество данных
4 микроорганизмов в биотопах районов нефтяных загрязнений и нефтепромыслов (Ившина, 1997; Whyte et al., 1999). Реализация биотехнологического потенциала родококков предусматривает всестороннее изучение механизмов их адгезии к гидрофобным соединениям, а также физико-химических и биологических факторов, регулирующих данный процесс. В лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН в течение ряда лет изучаются закономерности адгезии клеток родококков к твердым носителям (Криворучко, 2008; Krivorachko et al., 2006, 2009), тогда как подобные исследования в отношении гидрофобных жидкостей ранее не проводились.
Цель настоящей работы - исследование особенностей и механизмов адгезивной активности актинобактерий рода Rhodococcus в отношении жидких углеводородных соединений и их производных.
Основные задачи исследования:
Исследовать адгезивные свойства родококков разных видов в отношении жидких углеводородов и их производных.
Определить термодинамические характеристики процесса адгезии клеток родококков к жидким углеводородам.
Изучить влияние условий культивирования родококков на их адгезивную активность.
Исследовать процесс адсорбционной иммобилизации клеток родококков в гидрофобизованном гелевом носителе.
Научная новизна. Установлено, что актинобактерий рода Rhodococcus обладают высокой адгезивной активностью в отношении жидких углеводородов и их производных. Выявлена прямая зависимость показателя клеточной адгезии от длины углеродной цепи и степени гидрофобности н-алканов в ряду С10—>С16. Показано, что адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовои специфичности, экологической приуроченности и условий культивирования. Обосновано, что родококки, изолированные из нефтезагрязненных экосистем, характеризуются повышенной адгезивной активностью по сравнению с таковыми, изолированными из незагрязненных природных биотопов. Впервые выявлена достоверная корреляция между степенью адгезии клеток родококков к жидким
5 углеводородным субстратам и показателями клеточного роста. С использованием метода высокоточной межфазной тензиометрии исследована термодинамика адгезионного процесса и экспериментально подтвержден сорбционный механизм формирования биопленки R. ruber в водно-углеводородной системе.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о процессе адгезии микроорганизмов к жидким гидрофобным субстратам как ключевом этапе ассимиляции углеводородных соединений и механизме адаптации к существованию в углеводородсодержащих биотопах. В результате проведенных исследований отобраны штаммы родококков с высокой (84-98%) степенью адгезивной активности в отношении алифатических и ароматических углеводородов, технических углеводородных смесей, пищевых и косметических масел. Выявленные закономерности изменения термодинамических параметров адгезионного процесса клеток родококков на границе раздела фаз углеводород-вода могут быть использованы при регуляции роста бактериальных биопленок в жидких гетерофазных системах. Разработан метод селективного выделения родококков из смешанных микробных популяций на колонке с гидрофобизованным полиакриламидным криогелем (криоПААГ). Определены оптимальные условия адсорбционной иммобилизации родококков, обеспечивающие повышенную жизнеспособность, каталитическую активность и функциональную стабильность закрепленных в криоПААГ клеток. Полученные данные и отобранные штаммы с высокой адгезивной активностью могут быть использованы при разработке иммобилизованных биокатализаторов процессов направленной трансформации углеводородных соединений и биоочистки нефтезагрязненных сточных вод.
Основные положения, выносимые на защиту
Актинобактерии рода Rhodococcus обладают высокой адгезивной активностью в отношении жидких (алифатических, ароматических) углеводородов и их производных (технических углеводородных смесей, пищевых и косметических масел).
Адгезивные характеристики родококков определяются степенью гидрофобности клеточной стенки и зависят от штаммовой специфичности, экологической приуроченности и условий культивирования.
Клетки родококков, адсорбируясь на межфазной поверхности углеводород-вода, проявляют выраженные поверхностно-активные свойства. При насыщении клетками межфазного сорбционного слоя наблюдается качественное изменение термодинамических параметров системы, что свидетельствует о начале процесса пленкообразования.
Использование в качестве носителя гидрофобизованного криоПААГ обеспечивает возможность селективного выделения родококков из смешанных микробных популяций.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии», Пермь, 2007; VI и VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008, 2010; III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь-Н. Новгород-Пермь, 2008; 14th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium, Мессина, Италия, 2008; II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009», Пермь, 2009; Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», Москва, 2009; 14th European Congress on Biotechnology, Барселона, Испания, 2009; 24th Conference of the European Colloid and Interface Society, Прага, Чехия, 2010.
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Работа изложена на 188 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 36 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 387 наименований, в том числе 57 на русском и 330 на английском языках.
7 Связь работы с крупными программами. Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экзоценозов и практической деятельности человека» (номер госрегистрации 01.9.70 005279). Исследования поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований и министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (№ 07-04-97612-р_офи), Президента РФ "Ведущие научные школы" № НШ-4112.2008.4 и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Пути ассимиляции углеводородных субстратов
Окисление углеводородов и их производных в результате ферментативной деятельности микроорганизмов является основным механизмом самоочищения почв от нефтяного загрязнения (Осипов и др., 1998; Guenter, 1996). Известно, что гидрофобные субстраты характеризуются малой растворимостью в водной среде, в связи с чем микроорганизмы выработали две стратегии взаимодействия с данными соединениями: 1) прямой контакт клеток с каплями гидрофобного субстрата за счет увеличения степени гидрофобности клеток (Bassel, Mortimer, 1985; Bouchez-Na itali et al., 2001); 2) синтез биосурфактантов микробной клеткой, что изменяет физические свойства гидрофобного субстрата, увеличивая его растворимость и доступность для бактериальной клетки (Zhang, Miller, 1994, 1995; van Hamme, Ward, 2001).
Для родококков, метаболизирующих жидкие н-алканы, характерна аккумуляция углеводородов на поверхности клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, появление в цитоплазме обширных участков вакуолизации - мест депонирования н-алканов в клетке (Ившина, 1997; Komarov, Ganin, 2004; Peng et al., 2007). При росте в присутствии углеводородов в качестве единственного источника углеродного питания.для родококков характерно образование углеводородсодержащих внутриклеточных включений (Kennedy et al., 1975; Scott, Finnerty, 1976; Alvarez et al., 1996; Kim et al., 2002), при культивировании их в присутствии глюкозы и ацетата подобного явления не наблюдается (Whyte et al., 1999).
Показано, что процесс накопления углеводородов требует затрат энергии, т.е. является активным. Кроме того, клетки микроорганизмов способны к избирательному транспорту определенных углеводородов из смеси. Такой механизм избирательного транспорта и поглощения дает определенные преимущества клеткам, позволяя выбрать предпочтительный субстрат и исключить неусваиваемые соединения (Kim et al., 2002).
Контакт бактериальных клеток с жидкими предельными углеводородами может осуществляться по одному из трех известных в настоящее время механизмов (Коронелли, 1980; Квасников, Клюшникова, 1981; Lang, Philp, 1998): (1) поглощение монодисперсных растворимых в водной фазе алканов (Bouchez et al., 1995; Grimberg et al., 1996); (2) прямой контакт клеток с большими углеводородными каплями (Efroymson, Alexander, 1991; Choi et al, 1999; Stelmack et al., 1999); и (3) контакт с углеводородными каплями, много меньше размера микробных клеток (псевдосолюбилизация) (Bouchez et al., 1995; Shreve et al., 1995). При этом низкомолекулярные углеводороды С5-Сю поглощаются в состоянии истинной растворимости, углеводородные молекулы с длиной цепи более 10 атомов углерода (слабо растворимые в воде) - при прямом контакте с клеткой. Для углеводородов Сц-Сі2 допускается наличие двух механизмов поглощения - в растворимом состоянии и при непосредственном контакте с углеводородными каплями.
Поглощение углеводородов клетками родококков осуществляется, по-видимому, по механизму прямого контакта с углеводородным субстратом. Так, микроскопический анализ растущих клеток родококков выявил их наличие на поверхности капель w-алкана на начальном этапе окисления субстрата, и внутри углеводородных капель — по мере дальнейшей утилизации субстрата (Звягинцева и др., 2001).
Известно, что окисление углеводородов происходит внутри клеток микроорганизмов (Коронелли, 1980). Физико-химические свойства углеводородных соединений (низкая растворимость в воде, устойчивость к действию химических окислителей) явились причиной появления в ходе эволюции углеводородокисляющих микроорганизмов приспособлений, обеспечивающих транспорт углеводородного субстрата в клетки для его дальнейшей трансформации.
В процессе транспорта «-алканов внутрь клеток родококков выделяют две стадии (Рачинский и др., 1971). Начальный этап осуществляется пассивно-диффузионным путем и представляет собой молекулярную сорбцию углеводорода. Данный процесс не требует затрат энергии, и молекулы н-алкана проникают через клеточную стенку до цитоплазматической мембраны без каких-либо изменений своей структуры. Определяющее значение в процессе сорбции жидких углеводородов клеточной стенкой играет ее липидный состав, что обеспечивает ее высокое сродство к гидрофобному субстрату. Специфическими соединениями, участвующими в увеличении липофильности клеточной стенки бактерий рода Rhodococcus, являются миколовые кислоты, представляющие собой высокомолекулярные ациклические жирные кислоты с длиной алифатический цепи 32—66 атомов углерода. Известно, что клетки микроорганизмов, содержащие миколовые кислоты, обладают большей гидрофобностью клеточной стенки по сравнению с таковыми, не содержащими миколовых кислот. Кроме того, показана тенденция к возрастанию величины контактного угла с увеличением длины углеродной цепи миколовых кислот (Bendinger et al., 1993). Благодаря липофильной оболочке клетки родококков способны интенсивно поглощать гидрофобный субстрат. У родококков пассивная диффузия углеводородов происходит по всей площади клеточной стенки, где они могут накапливаться и удерживаться без окисления в значительных количествах (до 70% поглощенного я-октадекана в случае R. erythropolis) (Коронелли, 1996). С увеличением гидрофобности клеточной стенки, обусловленным наличием в ней миколовых кислот, связаны, адгезивные свойства клеток родококков (Sokolovska et al., 2003). Благодаря наличию миколовых кислот клетки микроорганизмов приобретают устойчивость к действию химических веществ, антибиотиков, дегидратации (Barry et al., 1998), а также способность к адгезии — было показано, что увеличение степени гидрофобности клеточной стенки, как правило, связано с увеличением длины углеродных атомов в составе миколовых кислот (Bendinger et al., 1993; Sunairi et al, 1997).
Значительное влияние на структуру миколовых кислот оказывает биодоступность и структура гидрофобного источника углеродного питания микроорганизмов (Hallas, Vestal, 1978; Espuny et al., 1996; Whyte et al, 1999; Wick et al., 2002a, 2003a, б). Гидрофобные субстраты в качестве единственного источника углеродного питания при культивировании микроорганизмов способствуют синтезу миколовых кислот с более длинной алкильной цепью, по сравнению с миколовыми кислотами клеток, выращенных в присутствии водорастворимых углеродных соединений (Wick et al., 2002а). Кроме того, известно(\іск et al., 20026), что культивирование микробных клеток в присутствии гидрофобных субстратов способствует увеличению гидрофобности клеточной стенки, а также адгезии микроорганизмов к данным субстратам. Установлено, что углеводороды полностью встраиваются в мембранные фосфолипиды углеводородокисляющих родококков (Rodgers et al., 2000).
Существует сильная корреляционная связь между составом миколовых кислот и числом атомов углерода в гидрофобном субстрате. Показано, что при выращивании R. erythropolis El в присутствии углеродного источника как гидрофобной, так и гидрофильной природы с четным числом атомов углерода, миколовые кислоты с нечетным С-числом не синтезируются. В то время как при выращивании клеток в присутствии источника углерода с нечетным числом атомов наблюдается синтез миколовых кислот как с четным, так и нечетным числом, атомов углерода. Установлено также, что проницаемость клеточной стенки родококков для гидрофобных молекул увеличивается при росте культуры в присутствии гидрофобного источника углерода, в то время как гидрофильные компоненты хуже переносятся в цитоплазму клеток при данных условиях (Sokolovska et al., 2003). Изменения в составе миколовых кислот под воздействием источника углеродного питания могут оказывать влияние на избирательность поглощения и транспорта алканов клеткой. Было высказано предположение (Sutcliffe, 1998), что гликолипиды, содержащие миколовые кислоты, могут содействовать избирательной проницаемости клеточной стенки, однако подтверждения данного-факта не встречается.
Рабочая коллекция, условия культивирования родококков
В работе использовали 114 чистых идентифицированных культур микроорганизмов, принадлежащих к видам Arthrobacter (A. simplex ИЭГМ 667), Bacillus (В. subtilis ИЭГМ 665), Brevibacterium (В. ammoniagenes ИЭГМ 1834, В. linens ИЭГМ 1830, B. iodinum ИЭГМ 1835), Corynebacterium (С. ammoniagenes ИЭГМ 1862, C. glutamicum ИЭГМ 1861, С. mediolanum ИЭГМ 1860, С. vitarumen ИЭГМ 1864), Dietzia (D. maris ИЭГМ 45, 50, 52, 55, 191, 291), Gordonia (G. rubropertincta ИЭГМ 95, 96, 106, G. terrae ИЭГМ 143, 751), Micrococcus (M. luteus ИЭГМ 401), Rhodococcus (табл. 3) и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ; номер во Всемирной Федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html). Кроме того, в работе использовали 50 мутантных клонов R. ruber ИЭГМ 231, полученных методом неспецифического in vitro Тп5 мутагенеза методом электропорации (протокол Epicentre Biotechnologies; Fernandes et al, 2001) а также грамотрицательные бактериальные культуры - Escherichia coli К-12 и Pseudomonas fluorescens NCIMB 9046.
Бактериальные культуры выращивали на твердых и в жидких питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), среде Luria-Bertani (LB) (Sigma, США), мясопептонном агаре (МПА), агаризованнной среде LB (LBA), минеральной среде «К» с добавлением w-гексадекана (хч, Реахим, Пермь) или глюкозы в качестве единственного источника углерода и энергии при 28С в течение 28-120 ч. Культивирование в жидких питательных средах проводили в условиях перемешивания (160 об/мин) или стационарно. Использовали минеральную среду «К» следующего состава (Каталог штаммов.., 1994) г/л: КН2Р04 - 1,0; К2НР04 - 1,0; NaCl - 1,0; KN03 - 1,0; MgS04 х 7Н20 - 0,2; FeCl3 х 7 Н20 - 0,02 СаС12 х 2Н20 - 0,02. Дополнительно непосредственно перед инокулированием в среду стерильно вносили н-алканы (гексан, гептан, нонан, декан, ундекан, додекан, тетрадекан и гексадекан) (1,0 об.%), раствор микроэлементов (1 мл/л) и дрожжевой экстракт (0,05 г/л). Для оценки влияния условий культивирования на адгезивную активность различные культуры родококков параллельно выращивали в МПБ, МПА, жидкой и агаризованной минеральной среде «К» с добавлением «-гексадекана (1 о6.%), глюкозы (1 %), Твин-80 (0,1; 0,5; 1 и 2 об.%) или изопропанола (1 об.%) в качестве источника углеродного питания. Культивирование бактериальных культур осуществляли при температурах 17, 28, 37С в условиях перемешивания (160 об./мин) и стационарно в течение 3-7 суток.
Показатели роста клеток микроорганизмов в процессе культивирования в жидких питательных средах определяли по изменению оптической плотности клеточной суспензии (ОП6оонм), измеренной с помощью спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США), а также по приросту биомассы, определенному весовым методом и выраженному в г абсолютно сухого веса клеток (АСВ) (Методы общей бактриологии..., 1984).
Характеристика адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus
По нашим данным, большинство (86%) исследуемых штаммов родококков обладают значительной (более 50%) степенью адгезивной активности в отношении н-гексадекана (рис 3). Данный углеводород был выбран в качестве субстрата для адгезии как наиболее часто используемый при проведении классического МАТН-теста (Rosenberg et al., 1980; van der Mei et al., 19876; Hori et al., 2008). Данное наблюдение согласуется с литературными данными (Bouchez-Nai tali et al., 1999; Dorobantu et al., 2004; Hamada et al., 2008), свидетельствующими о высоком сродстве клеток родококков к гидрофобным субстратам, что, по-видимому, является характерной особенностью представителей данного рода. Установлено, что штаммы в пределах одного вида отличаются друг от друга по показателю адгезивной активности от 1,5 (R. ruber) до 99 («/?. longus») раз. Как видно из рис. 3, все штаммы R. ruber объединяются в одну группу, характеризующуюся наибольшими (89,9 ±6,27%) значениями адгезивной активности. Кроме того, представители «R. longus», R. opacus и R. fascians также образуют одну группу, показатели адгезии которой в среднем составляют 60-80%. Штаммы R. erythropolis на графике предсталены в двух группах - с высокой и низкой степенью адгезивной активности.
В табл. 4 представлены данные сравнительного анализа показателей адгезии штаммов родококков разных видов.
В скобках указано число исследуемых штаммов.
Как видно из табл. 4, наибольшими показателями адгезии характеризуются представители R. ruber (89,9±6,27) и R. opacus (87,5±8,64). Адгезивная активность прочих исследуемых штаммов родококков разных видов в среднем составила 70 ± 27%. Согласно литературным данным (Kim et ah, 2002; Rosenbergs 2006a), клетки, адгезивная активность которых составляет более 70%, обладают клеточной стенкой с высокой степенью гидрофобности. Таким образом, актинобактерии рода Rhodococcus характеризуются гидрофобной природой клеточной стенки, а, следовательно, и высокой адгезивной активностью к гидрофобным субстратам. Показано, что лишь единичный штамм «R. longus» ИЭГМ 63 не обладает выраженной способностью к адгезии т.е., по-видимому, характеризуются гидрофильной клеточной стенкой. Кроме того, в экспериментах по изучению обратимости/необратимости адгезионного процесса было показано, что адгезия клеток данного штамма к «-гексадекану является обратимой, в то время как все прочие исследуемые штаммы родококков характеризуются необратимостью данного процесса. Установлено, что культуры, выделенные из районов нефтепромыслов и нефтезагрязненных местообитаний, обладают адгезивной активностью, в среднем на 11 % превышающей таковую, выделенных из незагрязненных источников (рис. 4). Кроме того, родококки, выделенные из нефтезагрязненных почв районов с теплым климатом (Украина, республика Беларусь), характеризуются более высокой (84-99%) способностью к адгезии, в то время как культуры, выделенные из средних широт России (Пермский край, Тюменская область) проявляют несколько меньшую (68-81%) адгезивную активность.
1 - Все исследуемые субстраты; 2 - почва, 3 - вода. Представлены средние данные адгезивной активности 15 штаммов (R. erythropolis (3), R. fascians (2), «R. longus» (2), R. opacus (2), R. rhodochrous (3), R. ruber (3)) по результатам трех измерений с использованием МАТН-теста. - различия достоверны при/? 0,05.
Известно, что на адгезию бактериальных клеток помимо свойств клеточной поверхности, также оказывают влияние физико-химические свойства гидрофобного субстрата. С целью определения влияния природы жидкого гидрофобного субстрата на адгезионный процесс нами были исследованы различные углеводороды и их производные. Результаты определения наиболее эффективного субстрата для адгезии представлены нарис. 5. По нашим данным, наиболее эффективными субстратами для адгезии клеток родококков являются н-алканы Сі0-Сіб (64-84% прикрепленных клеток), ароматические углеводороды, вазелиновое и моторное масла, керосин.
Замечено, что степень адгезии родококков к н-алканам увеличивается с возрастанием числа углеродных атомов в молекуле углеводорода. Выявленный факт повышения адгезивной активности родококков в отношении н-алканов иллюстрируется корреляционным графиком (рис. 6), построенным для углеводородов с длиной углеродной цепи Cg-Cie, при этом коэффициент корреляции составляет 0,9817 при /7=0,0005. Выявленная корреляционная зависимость, по-видимому, обусловлена повышением гидрофобности углеводородного субстрата, которая, как известно (Tools et al., 2002; Verbruggen et al., 2000; Acosta et al., 2005), возрастает с увеличением углеродной цепи «-алкана.
Представлены средние данные адгезивной активности 22 штаммов через 24 ч по результатам трех измерений с использованием МАТН-теста.
При изучении процесса адгезии родококков в отношении низкомолекулярных н-алканов было показано, что наименьшие значения (63,3%) показателя адгезии клеток зарегистрированы для гексана (СбНи), гептана (С7Н16) и нонана (СрНго)- Из литературы известно (Ившина и др., 1987), что клетки родококков, как правило, не ассимилируют данные углеводороды, что, возможно, связано с их высокой токсичностью вследствие способности растворять липидные компоненты бактериальных клеточных мембран. Наиболее высокая (84%) степень адгезии клеток родококков наблюдается в отношении н-гексадекана, самого гидрофобного (растворимость его в воде равна 10 г/л) из всех исследуемых н-аканов.
Помимо н-алканов, значительные показатели клеточной адгезии регистрируются к техническим маслам -моторному (73%) и минеральному (78%), а также ксилолу (74%) и керосину (71%). Используемое в работе моторное масло по химическому составу является полусинтетическим, т.е. представляет собой смесь синтетических (20-40%) и минеральных (60-80%) базовых масел. Минеральные масла получают путем прямой перегонки нефти, в связи с этим, высокие показатели адгезивной активности в отношении моторного и минерального масел, а также керосина и ксилола, нефтяного объясняются тем, что данные гидрофобные соединения, представляют собой смесь среднецепочечных (С9-Сіб) н-алканов. Следует отметить, что такие н-алканы являются наиболее доступными углеводородными субстратами для микробных клеток.
Показано, что наиболее высокие показатели адгезии к гидрофобным субстратам наблюдаются у штамма R. ruber ИЭГМ 231. данный штамм выбран для детального исследования механизмов адгезионного процесса. Микрофотография клеток R. ruber ИЭГМ 231 в капле н-гексадекана представлена на рис. 7.
Адсорбционная иммобилизация клеток родококков на полиакриламидном геле
Поскольку криоПААГ и его гидрофобизованные производные обладают системой взаимосвязанных крупных (25-250 мкм) пор, то такие носители протекаемы не только для жидких сред (Lozinsky et al., 1986), но и для суспензий клеток (Лозинский, 2008; Lozinsky et al., 2003), что позволяет проводить адсорбционную иммобилизацию клеток родококковв проточном режиме без необходимости «изготовления» гранулированного носителя или измельчения цельного блока. Скорость протока воды используемых в настоящей работе колонок с криоПААГ-носителем составляет 410±10 мл/ч.
На основании полученных данных по гидрофобности клеточной стенки родококков (см. главу 4) была исследована возможность их иммобилизации и концентрирования в колонке с гелевым носителем на основе криоПААГ. В качестве гидрофобизующих группировок для увеличения сродства клеток родококков к криоПААГ, в структуру гидрофильного носителя реакцией с додециловым альдегидом вводились остатки «-додекана (С 12), способствующего достижению значительной (96%) степени клеточной адгезии, и относительно нетоксичного для бактериальных клеток. (Sikkema et al., 1995). Кроме того, температура плавления н-додекана составляет -9,6С, что позволяет использовать гидрофобизованный данным соединением носитель и в условиях низких температур.
Первоначально, с целью определения оптимальных условий адсорбции клеток R. ruber ИЭГМ 231 на криоПААГ с 0,2 мол.% Си были испытаны различные (ОПбоонм—0,25; 0,5, 1 и 2) исходные концентрации клеточной суспензии. Показано (рис. 25), что при пропускании через колонку с носителем концентрированной (ОПбооИм=1 и 2) суспензии родококков, сорбционная емкость колонки составила 0,44x10 кл/г носителя. В то время как при уменьшении концентрации клеток в 2-4 раза на носителе закреплялось уже 5,71x106 кл/г носителя. Дальнейшее уменьшение исходной концентрации (ОП6оонм=0,25) клеток родококков не способствовало увеличению числа закрепленных клеток, что свидетельствует о достижении максимальной сорбционной емкости носителя в отношении родококков.
Наблюдаемое явление, по-видимому, связано с тем, что при пропускании высоко концентрированной суспензии клетки родококков закрепляются в верхних слоях колонки, занимая всю возможную площадь поверхности пор гелевого носителя и сужая просвет пор. При последующем пропускании суспензии клетки в результате коадгезии задерживаются в верхней части колонки, не проникая внутрь. Регистрируемый с помощью спектрофотометра прозрачный элюат, по-видимому, образуется в результате фильтрации клеточной суспензии через верхний слой пор носителя с закрепленными на них клетками родококков.
При пропускании слабо концентрированной (ОП6оо=0,25-0,5) суспензии клеток, происходит более равномерное распределение клеток в колонке, что подтверждается однородным окрашиванием носителя в оранжевый цвет, характерный для клеток R. ruber, а также исследованием частиц геля, полученных из срединной части колонки, с использованием световой микроскопии (рис. 26).
Таким образом, использование слабо концентрированной суспензии клеток родококков способствует достижению максимальной сорбционной емкости носителя посредством оптимального (монослойного) распределения клеток родококков по поверхности пор носителя.
Анализ влияния степени гидрофобизации носителя на адсорбцию родококков показал (рис. 27), что число прочно закрепленных клеток родококков возрастает на 30% при повышении содержания остатков я-додекана в криоПААГ от 0,2 до 1,0 мол.% и достигает 89% (1,12x10 адсорбированных клеток/г носителя). Данный показатель в 1,7 раз превышает контрольное значение (гидрофильный криоПААГ). В то же время, дальнейшее повышение гидрофобности носителя (до 5,0 мол.% привитых додецильных группировок) не приводило к увеличению числа адсорбированных клеток (1,06 109 кл/г носителя), что свидетельствует о достижении максимальной сорбционной емкости данного типа гидрофобизованного носителя в отношении клеток R. ruber.
Подобный эффект был показан Е.А. Podorozhko с коллегами (2008) при избыточной гидрофобизации носителя на основе древесных опилок, приводящей к снижению числа иммобилизованных клеток родококков, что наглядно свидетельствует о необходимости оптимизации степени гидрофобности носителей, которые используются для адсорбционной иммобилизации микроорганизмов, основанной на гидрофобных взаимодействиях клеток с поверхностью носителя.
Наблюдаемая в контрольном (негидрофобизованном) образце адсорбция клеток, по-видимому, объясняется морфологическими особенностями родококков (размерами клетки до 10 мкм, наличием выростов клеточной стенки (Ившина и др., 1995). Таким образом, умеренная гидрофобизация (1,0 мол.%) криоПААГ способствует существенному (на 37%) увеличению числа адсорбированных клеток родококков, что свидетельствует о важной роли гидрофобных взаимодействий в процессе адсорбции данных бактерий к гелевому носителю на основе полиакриламида.
Обнаружено, что с использованием стандартных методов ПЦР возможна прямая детекция иммобилизованных клеток микроорганизмов в колонке и количественне определение их ДНК. Так, нами была проведена ПЦР образцов ДНК, выделенной непосредственно из криоПААГ-колонок с различным числом иммобилизованных клеток R. ruber ИЭГМ 231, с последующим разделением продуктов амплификации в агарозном геле.
Полученная электрофореграмма (рис. 28) подтверждает возможность выделения и видоспецифичной амплификации ДНК иммобилизованных в колонке клеток родококков и позволяет косвенно судить об их числе. С применением специального программного обеспечения возможно точное количественное определение числа иммобилизованных на колонке клеток микроорганизмов.
С целью изучения возможности повторного использования криоПААГ-колонок для иммобилизации микроорганизмов нами были проведены эксперименты по отмыванию адсорбированных клеток родококков. Показано, что промывание колонок 1М NaCl и 20% этанолом не приводит к десорбции закрепленных в криоПААГ клеток (табл. 13), однако, родококки частично вымываются под действием 0,1 и 1% раствора Твин-80.
