Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Строение кожи человека 7
2.2. Дифференцировка кератиноцитов 9
2.3. Маркеры стволовых клеток кожи 14
2.4. Белки базальной мембраны 17
2.5. Рецепторы кератиноцитов к белкам ВКМ 21
2.6. Влияние белков ВКМ на культивируемые кератиноциты 25
2.7. Методы выявления стволовых клеток для последующего обогащения ими культуры кератиноцитов 28
Цель и задачи исследования 31
Положения, выносимые на защиту 31
3. Материалы и методы 33
3.1. Выделение и культивирование кератиноцитов 33
3.2. Стриппинг многослойного пласта кератиноцитов и снятие клеток базального слоя 34
3.3. Субстраты 34
3.4. Схема селективной адгезии 35
3.5. Определение числа прикрепившихся к субстрату кератиноцитов 36
3.6. Получение и истощение иммуносывороток ИСб и ИСД 36
3.7. Обработка стекол для приготовления препаратов 38
3.8. Иммунофлуоресцентный анализ 38
3.9. Анализ изображений клеток 40
4. Результаты 43
4. 1. Взаимодействие свежевыделенных и культивируемых базальных
кератиноцитов с разными белками внеклеточного матрикса 43
4.2. Зависимость морфометрических параметров гетерогенной популяции кератиноцитов от времени адгезии к белкам внеклеточного матрикса 51
4.3. Распределение маркеров стволовых клеток кожи (рбЗ, КІ67, К19) в гетерогенной популяции кератиноцитов 65
4.4. Получение кроличьих антител к дифференцированным и недифференцированным кератиноцитам 74
4.5. Выявление субпопуляций кератиноцитов, окрашиваемых полученными антителами ИСб и ИСД 77
Обсуждение 81
Выводы 99
Список литературы 100
- Дифференцировка кератиноцитов
- Влияние белков ВКМ на культивируемые кератиноциты
- Стриппинг многослойного пласта кератиноцитов и снятие клеток базального слоя
- Зависимость морфометрических параметров гетерогенной популяции кератиноцитов от времени адгезии к белкам внеклеточного матрикса
Введение к работе
В последние годы большой интерес вызывают исследования, связанные с изучением и применением стволовых клеток в медицине для заместительной клеточной терапии поврежденных тканей. При этом до сих пор ведется много дискуссий на тему, что же понимать под термином «стволовые клетки», и можно ли их использовать в клинике. Кроме клинического применения, наличие такой линии способствовало бы изучению механизмов регуляции дифференцировки клеток, а также изучению влияния на нее различных факторов. Для того чтобы детально их изучать, необходимо наличие постоянной линии стволовых клеток с тем, чтобы исключить вариации каких-либо признаков, которые можно наблюдать при использовании материала от разных доноров. Кроме того, такая линия являлась бы постоянным источником материала для клеточных технологий. На данный момент из взрослого организма удается выделять в чистом виде только гемопоэтические мезенхимные стволовые клетки. Однако линии стволовых клеток взрослого организма до сих пор не созданы.
Было обнаружено, что в ряде тканей взрослого организма существуют ниши, в которых находятся стволовые клетки, например, в коже в базальном слое кератиноцитов. Кожный покров человека и животных постоянно обновляется за, счет пролиферации кератиноцитов и их последовательной дифференцировки по направлению от базальной мембраны к поверхности кожи. Согласно существующим представлениям покоящиеся стволовые клетки эпидермиса сосредоточены у базальной мембраны и в волосяных фолликулах. Они дают начало так называемым транзиторным клеткам, способным интенсивно размножаться, за счет чего эпидермис постоянно обновляется. После нескольких делений они вступают на путь дифференцировки. В результате образуются разные слои эпидермиса, содержащие кератиноциты, находящиеся на разных уровнях дифференцировки (Хэм, Кормак, 1983).
При переводе в культуру кератиноцитов базального слоя эпидермиса они способны размножаться и воспроизводить такой же процесс последовательной дифференцировки, как это происходит в коже. Образуется многослойный пласт эпидермальных клеток, который может быть использован в технологиях заместительной клеточной терапии (Limat, Klein, 1993; Romero et al., 1999).
В связи с тем, что доказано существование стволовых клеток в коже человека, представляется актуальным получить популяцию кератиноцитов, обогащенную стволовыми клетками, которые обладают большим пролиферативным потенциалом. Пул таких клеток можно было бы использовать как для фундаментальных исследований, так и для применения в заместительной клеточной терапии. Предполагается, что это позволит повысить эффективность технологий восстановления структурной и функциональной целостности кожного покрова.
Решить задачу получения линии стволовых клеток или, по крайней мере, обогащения ими гетерогенной популяции базальных кератиноцитов, можно было бы осуществить путем выявления стволовых клеток методом проточной цитометрии с помощью специфических маркеров. В литературе описан ряд подобных маркеров (Michel et al., 1996; Pellegrini et al., 2001). Однако на наш взгляд они не являются строго специфичными для этого типа клеток, так как они носят скорее количественный характер и найдены и в клетках других тканей (Fradette et al., 1998; Reis-Filho et al., 2002). Кератиноциты разной степени дифференцировки различаются лишь только по величине содержания в них маркерных белков (Moles, Watt, 1997; Yang et al., 1998).
В связи с отсутствием строго специфичных маркеров необходимо искать другие экспериментальные подходы для четкого выделения этих клеток или, по крайней мере, для обогащения ими культивируемой популяции кератиноцитов. Стволовые клетки эпидермиса локализованы на базальной мембране и, следовательно, тесно взаимодействуют с входящими в ее состав белками (Spradling et al., 2001). В связи с этим представлялось перспективным для указанной цели применить метод селективной адгезии выделенных кератиноцитов к разным белкам внеклеточного матрикса (ВКМ) базальной мембраны, с которыми они взаимодействуют в неповрежденной коже. Для проверки данного предположения и разработки метода селективного разделения гетерогенной популяции клеток необходимо прежде всего выяснить, какие из белков базальной мембраны могут быть использованы для этой цели. Кроме того, важно установить степень взаимодействия с этими белками как свежевыделенной популяции кератиноцитов, так и после их культивирования.
Таким образом, четкое определение и идентификация стволовых клеток, обладающих высоким пролиферативным потенциалом, а также возможность получения из общей популяции эпидермальных клеток фракции стволовых кератиноцитов, представляет собой насущную задачу как для решения ряда фундаментальных вопросов, так и с точки зрения применения этих клеток в медицине с целью сокращения сроков заживления ран.
Дифференцировка кератиноцитов
В эпидермисе и волосяных фолликулах поддерживается баланс между делящимися и дифференцирующимися клетками. Базальные эпидермальные клетки отвечают на некий внешний сигнал, который, как предполагается, запускает программу терминальной дифференцировки. Когда клетки приостанавливают деление и начинают перемещаться к поверхности кожи, они изменяют свои адгезивные свойства, вследствие чего, вероятно, изменяются программы дифференцировки (Watt et а., 1993).
Дифференцировка клеток эпидермиса связана с их постепенными морфо-биохимическими изменениями, которые сопровождаются изменениями размера, формы, организации цитоскелета и рецепторов этих клеток (Matoltsy, 1976). В настоящее время по степени дифференцировки кератиноциты подразделяют на стволовые, транзиторные (находящиеся на пути к дифференцировке) и дифференцированные клетки (Allen, Potten, 1974; Potten et al., 1974; Lajtha, 1979; Lavker, Sun, 1982; Potten, 1983; MacKenzie, Bickenbach, 1985; и др.). Стволовые и транзиторные клетки расположены в базальном слое, дифференцированные преимущественно находятся в супрабазальных слоях.
Стволовые клетки - это «клетки, способные к самоподдержанию, например, с неизменной пролиферативной способностью самовозобновляться, по крайней мере, на протяжении всей жизни организма» (Lajtha, 1979). Большинство их находится в фазе Go клеточного цикла (Potten et al., 1978). Считается, что стволовые клетки не существуют в организме сами по себе, а находятся в определенном микроокружении, которое обычно обозначают термином ниша, где специфическое микроокружение стабилизирует их специфические свойства. В настоящее время этот термин используется для обозначения совокупности факторов, обеспечивающих жизнеспособность и самовоспроизведение стволовых клеток, а также дифференциацию дочерних транзиторных клеток. Среди этих факторов следует упомянуть наличие молекул внеклеточного матрикса базальной мембраны и присутствие соседних клеток, продуцирующих факторы роста и другие регуляторные молекулы (Spradling et al., 2001). Структура ее полностью не известна.
Считается, что клетки эпидермиса с предполагаемыми свойствами стволовых клеток, имеют следующие характеристики: длительный клеточный цикл (до 200 ч) (Potten et al., 1982), что определяется по сохранению метки в ядре (меченного тимидина или BrDu), высокий пролиферативный потенциал, локализация в защитной нише, способность сохранять и восстанавливать ткань, в которой они находятся, большая продолжительность жизни, способность создавать клоны (Potten, Hendry, 1973; Bickenbach, 1981; Lavker, Sun, 1982; и др.). Такие клетки находятся в области «выпячивания» волосяного фолликула (Cotsarelis, Sun, Lavker, 1990; Michel et al., 1996; Morris, Potten, 1999) и в межфоликулярном базальном слое эпидермиса (Bickenbach, Mackenzie, 1984). Исследования in vitro показали, что в базальном слое эпидермиса содержится от 1 до 10% клеток, которые могут быть отнесены к стволовым (Potten, Hendry, 1973; Morris et al., 1985; MacKenzie, Bickenbach, 1985; Morris, Potten, 1994; и др.).
Длительное время существовало убеждение, что транзиторные клетки необратимо выходят из компартмента стволовых клеток, однако стали появляться данные, свидетельствующие о том, что между стволовыми и транзиторными клетками нет резкой границы, а скорее имеется постепенный переход. После того как стволовые клетки в результате деления дают начало транзиторным клеткам, последние еще некоторое время могут сохранять свойства стволовых клеток. Например, Поттен называет их потенциальными стволовыми клетками и считает, что в норме они относятся к транзиторной субпопуляции, но при определенных условиях, например, гибели предсуществующих стволовых клеток, могут заместить последние (Potten, Morris, 1988).
Считается, что транзиторные клетки являются дочерними клетками стволовых, имеют ограниченное время жизни, пролиферируют с высокой скоростью. Идентификацию стволовых и транзиторных клеток затрудняет отсутствие специфических молекулярных маркеров. Как правило, для этого используют радиоактивные метки и клональный анализ. Эти два метода дают информацию, дополняющую идентификацию клеток с использованием различных маркерных белков (Barrandon Y., 1993). Предполагается, что стволовые клетки отличаются от транзиторных по их более высокой экспрессии a2pl и аЗрі интегринов (Jones et al., 1995). Транзиторные клетки дают начало клеткам, которые начинают дифференцироваться (Barrandon & Green 1987; Jones & Watt 1993).
Одним из признаков, отражающих дифференцировку кератиноцитов in vivo, является смена в их цитоплазме ряда специфичных белков, в частности, кератинов (К) и появлением в супрабазальных клетках инволюкрина (Banks-Schlegel, Green, 1981; Moll et al., 1982; Barrandon, Green, 1987).
Однако в клетках кожи обнаруживаются не все кератины. Для клеток базального слоя характерно присутствие К5 (58 кДа) и К14 (50 кДа) и иногда К15 и К17 (Nelson, Sun, 1983; Lloyd et al., 1995). Предполагается, что экспрессия этих кератинов может продолжаться и в супрабазальных слоях (Fuchs and Green, 1980; Woodcock-Mitchell et al., 1982; Skerrow and Skerrow, 1983). Однако мРНК K14 и K5 экспрессируется преимущественно в базальном слое (Tyner and Fuchs, 1986; Lersch and Fuchs, 1988). По мере дифференцировки базальпых клеток они снижают экспрессию К5, К14 и К15 и начинают синтезировать новые наборы кератинов (Fuchs, Green, 1980; Sun et al., 1984; Lloyd et al., 1995). Для клеток супрабазальных слоев характерна экспрессия К1 (67 кДа), К2 (65 кДа), К10 (56,5 кДа) и К11 (56 кДа) (Rice, Green, 1979; Viae et al., 1980; Tseng et al., 1982; Woodcock-Mitchell et al., 1982; Skerrow and Skerrow, 1983; Kopan et al., 1987). Сдвиг к экспрессии Kl и K10 один из самых ранних биохимических показателей перехода клеток к терминальной дифференцировке (таблица 2).
Основные кератины клеток эпидермиса кожи человека. Экспрессия кератинов в культуре первичных кератиноцитов и в линиях трансформированных клеток может значительно отличаться от таковой в организме (Wu, Rheinwald, 1981; Quinlan et al., 1985). В случае дифференцировки в гиперпролиферативном эпидермисе (включая тканевую культуру), при повреждении и при заживлении ран экспрессируются Кб и К16 (Moll et al., 1982; Sun et al., 1984). В культуре по достижении монослоя кератиноциты синтезируют К5, К14, Кб, К16.
В процессе дифференцировки везикулы Гольджи увеличиваются в размерах, появляются покрытые мембраной гранулы. Позже накапливается кератогиалин, формирует гранулы. Когда клетки входят в стадию ороговевания, плазматическая мембрана утолщается (Matoltsy, Huszar, 1972). Кроме того, во время терминальной дифференцировки кератиноцитов экспрессируются такие белки как инволюкрин, лорикрин и филаггрин (Steinert et al., 1981; Dale 1977; Balmain et al., 1977; Watt, 1983).
Влияние белков ВКМ на культивируемые кератиноциты
Взаимодействие клеток и матрикса влияет на структуру эпителия, рост и дифференцировку клеток (Adams, Watt, 1990; Горелик и др., 1994 и др.). Интегрины вместе с другими белками клеточной поверхности, осуществляют адгезию эпителиальных клеток к ВКМ (Geiger et al., 2001). Образуемые лиганд рецепторные комплексы стимулируют наборы сигнальных молекул, способствующие регуляции пролиферации, дифференцировки, миграции и жизнеспособности клеток (Roskelley et al., 1995; Giancotti et al., 1999). В норме кератиноциты не имеют рецепторов к фибронектину, но после образования раны фибронектин становится основным компонентом временного матрикса, по которому кератиноциты мигрируют для закрытия раневой поверхности (Kim et al., 1992). Повреждение кожи служит сигналом для переключения кератиноцитов со стационарного на мобильный фенотип. Кератиноциты приобретают способность прикрепляться к фибронектину и витронектину, что связано с появлением интегриновых рецепторов a5pi и a5Pv (Takashima and Grinnell, 1985; Clark, 1990). По данным Гриннела свежевыделенные из кожи кератиноциты не прикрепляются к фибронектину (Grinnel, 1992).
Матригель, коллагены I и IV типов усиливают начальное прикрепление кератиноцитов первичной культуры, тогда как RGD последовательность, витронектин и фибронектин не оказывают влияния на начальные этапы адгезии (Murray et al.,1979; Dawson et al., 1996). При более длительном сроке наблюдения другими авторами было показано, что фибронектин способствует прикреплению клеток: прикрепляется примерно 30-40% клеток после 2-24 ч инкубации по сравнению с 4-6% в контроле (Gilchrest et al., 1982).
Ранее было показано, что ламинин-2/4 в большей степени способствует адгезии кератиноцитов человека, чем ламинин-1 и фибронектин, и в отличие от ламинина-1 поддерживает миграцию этих клеток (Woodley et al., 1988; Gorelik et al., 2001; Калмыкова и др., 2002).
При длительном культивировании адгезивные свойства кератиноцитов изменяются. Установлено, что значительная часть кератиноцитов, полученных сразу после выделения, адгезирует за длительное время - до 8-12 ч, тогда как при первом пересеве кератиноциты прикрепляются к субстрату за короткий срок (0.5-2 ч) (Васильев и др., 1991; Калмыкова и др. 2002). Адгезия кератиноцитов к субстрату предшествует распластыванию клеток. Есть данные, что кератиноциты первичной культуры начинали распластываться на ламинине только после 17 ч инкубации.
Исследования с антителами, блокирующими адгезию, выявили важную роль интегринов в подвижности кератиноцитов, движении на разных субстратах, опосредованном разными интегринами (Watt, Hertle, 1994; Nguyen et al., 2000). Передача сигналов интегринами стимулирует клеточную миграцию, вызывая изменения в организации цитоскелета и увеличивая сокращаемость клетки (Сагу et al., 1998; Sieg et al, 2000; Cox et al., 2001; и др.). Миграция инициируется поляризацией клеток и образованием ламеллы на ведущем крае. Предполагается, что в этом участвуют аЗ(31 (на лидирующем крае клетки) и а604 (на периферии) рецепторы (Adams, Watt, 1991; DiPersio et al., 1997; Goldfinger et al., 1999; Nguyen et al., 2000; Mercurio et al., 2001).
По другим данным рецептор ламинина аЗрі участвует в регуляции распластывания клеток и миграции, а а6Ь4, компонент полудесмосом, заякоревает кератиноциты плотно к ВКМ (Fuchs et al., 1997; Borradori, Sonnenberg, 1999). Участие интегрина аЗрі в миграции клеток подтверждается изучением метастатических опухолей эпителиального происхождения. Взаимодействие интегрина аЗрі с элементами базальной мембраны по всей видимости передает сигнал, который может подавлять инвазивные способности клеток (Kreidberg, 2000). Взаимодействие интегрина аЗ31 с ламинином-5 стимулирует пролиферацию кератиноцитов через активацию МАРК. Эта функция интегрина аЗрі является жизненно важной при развитии эпидермиса в эмбриогенезе и при его восстановлении после повреждения, так как оба эти процесса включают миграцию и пролиферацию кератиноцитов в контакте с компонентами ВКМ (Goldfinger et al., 1999; Gonzales et al., 1999). В условиях in vitro миграция кератиноцитов усиливается при обработке чашек коллагенами I и IV типа, по сравнению с непокрытыми чашками (Murray et al.,1979; Guo et al., 1990; Chen et al., 1994; Kim et al., 1994; Morita et al., 2005). На пролиферацию клеток положительно влияют матригель, коллагены I и IV типов, тогда как на фибронектине пролиферация кератиноцитов значительно снижается (Dawson et al., 1996). Имеется много общего между дифференцировкой клеток в организме и изменением их морфофункциональных особенностей в культуре. Переход кератиноцитов к терминальной дифференцировке связан со снижением их аффинности к белкам базальной мембраны (Watt, 1984). Когда кератиноциты человека или мыши переводят суспензию, они выходят из клеточного цикла и идут в терминальную дифференцировку (Green, 1977; Adams and Watt, 1989; Drozdoff, Pledger, 1993; Tennenbaum et al., 1996; Romero et al., 1999). Инициация терминальной дифференцировки может быть частично ингибирована фибронектином или антителами к Ыинтегринам (Adam, Watt, 1989; Watt et al., 1993; Levy et al., 2000). Для нормальной пролиферации эпидермиса важны pi интегрины, тогда как абр4 участвует главным образом в заякоревании клеток (DiPersio et al., 2000). In vitro кератиноциты с пониженной экспрессией В1 интегрина показывали значительное снижение адгезии к белкам ВКМ и 5-кратное увеличение доли терминально дифференцированных клеток по сравнению с В1-положительными кератиноцитами (Grose et al., 2002). Однако, данных, описанных в литературе, недостаточно для того, чтобы определить, есть ли какие-нибудь интегрины, специфичные только для стволовых клеток эпидермиса.
Стриппинг многослойного пласта кератиноцитов и снятие клеток базального слоя
В качестве субстратов для экспериментов использовали белки ВКМ коллагены I и IV типов, ламинин 2/4 и фибронектин, а также матригель, являющийся комплексом белков внеклеточного матрикса и протеогликанов. Коллаген I типа был получен из сухожилий крысиных хвостов (Chandrakasan et al., 1967), коллаген IV типа - из плаценты человека (Kleinman, 1994). Коллагены были выделены и любезно предоставлены Л. В. Кухаревой, Институт Цитологии РАН, С-Петербург. Ламинин 2/4 был выделен из плаценты человека модифицированным методом Палма и Фурча (Palm, Furcht, 1983, Черепанова и соавт., 2002), фибронектин был получен из плазмы крови человека (Ruoslahti et al., 1982), матригель - из EHS саркомы мыши (Kibbey, 1994). Фибронектин, ламинин 2/4 и матригель любезно предоставлены И. В. Воронкиной (Институт Цитологии РАН, С-Петербург). Растворы белков наносили в концентрации 10 мкг/мл на чашки Петри (для культивирования клеток; время инкубации 1 ч при 37 С) или на предварительно подготовленные покровные стекла (для иммунофлуоресцентного анализа; на ночь при 4 С). По истечении срока инкубации чашки и стекла трижды промывали раствором PBS. Для предотвращения неспецифического взаимодействия клеток с субстратом стекла дополнительно покрывали раствором 2% БСА (в течение 1 ч, при 37 С) с последующей отмывкой PBS. На приготовленные субстраты наносили суспензию клеток в среде без сыворотки. В качестве контроля были использованы бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma, США) и полилизин-L (Sigma, США).
Свежевыделенные кератиноциты инкубировали в течение 10 мин при 37 С в атмосфере 5% СОг на одном из субстратов в среде DMEM/F12 (3:1) без добавления сыворотки. Клетки, не прикрепившиеся за это время, переносили в другую чашку с тем же субстратом и инкубировали 20 мин.
Подсчет числа клеток, прикрепившихся за определенный срок к субстрату, нанесенному на поверхность лунок, проводили с помощью метода иммуноферментного анализа (Karecla et al., 1994). В этих экспериментах использовали 96-луночные платы (Nunc, США) для иммуноферментного анализа. В каждую лунку наносили 10 мкг субстрата и инкубировали при температуре 4 С в течение ночи. После этого лунки трижды промывали буферным раствором PBS. Выделенные клетки промывали трижды смесью сред DMBM и F12 (3:1) без сыворотки с последующим их осаждением при 1000 g в течение 5 мин. Затем клетки суспендировали в среде без сыворотки и высевали в 96-луночные платы по 105 клеток на лунку. После инкубации в течение определенного времени (в зависимости от конкретного эксперимента) неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся фиксировали в течение 10 мин при 20С 70 % раствором этилового спирта и окрашивали 0.1%-ым раствором генциан-виолета (в течение 20 мин). Затем краситель растворяли в 10%-ой уксусной кислоте в течение 20 мин. Была построена калибровочная кривая, с помощью которой по величине оптической плотности растворов в лунках при длине волны 570 нм (Е57о) судили о количестве клеток, адгезировавших к данному субстрату. В отдельных случаях количество прикрепившихся клеток подсчитывали с помощью камеры Горяева.
Для получения иммуносывороток на белки плазматических мембран кератиноцитов базального слоя (ИСб) и дифференцированных клеток супрабазальных слоев (ИСд), кератиноциты выделяли и культивировали до получения многослойного пласта. Культуру кератиноцитов подвергали дестратификации, как это было описано ранее. Затем собирали клетки базального слоя и супрабазальных слоев, и получали из них препараты плазматических мембран.
Для этого согласно методике Хеффнера (Haeffher et al., 1980) клетки набухали в 12 объемах 2 мМ ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), рН 7.0 на льду в течение 5 мин. Затем клетки осаждали при 4000 об./мин в течение 15 мин, ресуспендировали в 6 объемах холодного буферного раствора 18 мМ Трис-HCl, рН 8.0, содержащего 25 мМ NaCl и 0.5 мМ СаС12, и разрушали на льду с помощью гомогенизатора Даунса. Суспензию центрифугировали 2 мин при 2000 об./мин. Полученный супернатант центрифугировали в течение 2 мин при 2500 об./мин. Надосадочную жидкость отбирали и осаждали грубую фракцию плазматических мембран путем центрифугирования при 12000 об./мин в течение 15 мин. Иммуносыворотки получали путем иммунизации кроликов препаратами плазматических мембран кератиноцитов в смеси с адъювантом Фрейнда (1:1). Кровь брали из ушной вены на 14 сут после инъекции.
Получение препаратов плазматических мембран кератиноцитов, которыми иммунизировали кроликов, а также саму иммунизацию и получение иммуносывороток проводили в лаборатории цитологии опухолевого роста, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.
Полученные таким образом иммуносыворотки были подвергнуты перекрестному истощению. Для этого в иммуносыворотку ИСб добавляли фракцию дифференцированных клеток в соотношении 2:1 (по объему) и инкубировали в течение 30 мин при 37 С, а затем ночь при 4 С. Затем клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и в иммуносыворотку добавляли новую порцию дифференцированных клеток. Всего было проведено 4 истощения. Аналогично истощали ИСД (соответственно, базальными кератиноцитами).
Зависимость морфометрических параметров гетерогенной популяции кератиноцитов от времени адгезии к белкам внеклеточного матрикса
В связи с тем, что маркеры стволовых клеток эпидермиса не являются строго специфичными, как показали проведенные эксперименты, для того чтобы выявить разные субпопуляции клеток, необходимо привлечение дополнительных оценочных параметров. Из данных литературы следует, что недифференцированные прогениторные клетки кожи характеризуются меньшими размерами (около 10 мкм) по сравнению с дифференцированными, а также округлой формой (Barrandon, Green, 1985; Bickenbach, Grinnell, 2004; Webb et al., 2004). Кроме того, известно, что взаимодействие клеток с субстратом, и в том числе степень сродства к нему, выражается степенью распластывания на нем клеток. На основании этих данных было выдвинуто предположение, что если дать клеткам достаточно времени для распластывания на субстрате, стволовые клетки, тем не менее, должны оставаться мелкими и круглыми. Чтобы проверить данное предположение, во-первых, было проведено исследование морфометрических параметров кератиноцитов как первичных, так и после длительного культивирования. Во-вторых, полученные данные по морфометрическим показателям были сопоставлены с окраской кератиноцитов на кератин 19, считающийся маркером стволовых клеток эпидермиса. Одно из преимуществ данного подхода заключается в том, что он позволяет обсчитать и провести статистическую обработку большого количества клеток. Предварительный анализ показал, что через сутки после посева клеток даже визуально заметна разница в форме кератиноцитов на различных субстратах (рис. 13). Наряду с округлыми имеются полигональные клетки с различной степенью распластывания. Больший размер клеток на коллагене I типа по сравнению с остальными субстратами можно объяснить тем, что он больше способствует дифференцировке клеток в культуре. При использовании в качестве подложки матригеля характерно образование крупных конгломератов из агрегирующих клеток.
Для клеток, культивируемых на разных субстратах, была проведена оценка морфологических параметров (площади клеток и коэффициента распластывания). Проведенный анализ показал, что в среднем площадь (А) клеток общей популяции, растущих в течение суток на коллагене I типа, вдвое превосходит площадь тех же клеток, но культивируемых на коллагене IV типа или фибронектине. Достоверных различий по данному параметру между клетками на фибронектине и коллагене IV типа не выявлено (рис. 14).
Популяция свежевыделенных кератиноцитов через сутки после посева. Расчеты показали, что во всех случаях круглые клетки составляют приблизительно 50-60 % от всей популяции, а некруглые - 20-30 %. Величина площади круглых клеток колеблется от 2000 до 2500 пикселей, некруглых — от 3000 до 3500, что объясняется их большей степенью распластывания. Популяция кератиноцитов очень гетерогенна, в том числе, и по форме клеток. Распластанные клетки преимущественно большого размера и представляют собой, по-видимому, дифференцированные кератиноциты. Но более точно сопоставить конкретную форму клеток и выполняемую ими функцию достаточно сложно.
Точки — экспериментальные значения А. Сплошная линия — суммарная теоретическая кривая, полученная по опытным значениям, штриховые линии -кривые, отражающие распределение клеток по отдельным субпопуляциям. Таким образом, в общей популяции кератиноцитов, выделенных и посеянных на любой из исследуемых субстратов, достаточно сложно выявить некую субпопуляцию по такому параметру как размер клеток.
После селекции кератиноцитов по скорости адгезии к отдельным белкам ВКМ субпопуляции выявляются более четко. На рис. 16 представлены кератиноциты, адгезировавшие к субстрату за 10 мин, через сутки после посева. Среди клеток, культивируемых на коллагенах, визуально можно выделить округлые мелкие клетки и клетки более крупные полигональной или вытянутой формы. Из агрегатов кератиноцитов, состоящих в основном из круглых клеток, начинают формироваться колонии, чего не наблюдается в случае с фибронектином, где клетки выглядят более однородными, округлыми, менее распластанные, чем на коллагенах.
Распределение кератиноцитов по величинам площади клеток (А) на фибронектине через 1 сут после посева. Здесь и на рис. 18 и 19: Точки — экспериментальные значения А. Сплошная линия — суммарная теоретическая кривая, полученная по опытным значениям, штриховые линии - кривые, отражающие распределение клеток по отдельным субпопуляциям, а, б, в - клетки, отселектированные по адгезии в течение 10, 20 и 30 мин соответственно. Рис. 18. Распределение кератиноцитов по величинам площади клеток (А) на коллагене I типа через 1 сут после посева.
Распределение кератиноцитов по величинам площади клеток (А) на коллагене IV типа через 1 сут после посева. Таким образом, при селекции клеток, посаженных на фибронектин, не удается выделить отчетливых субпопуляций. При использовании в качестве субстрата коллагена I типа четко выявляется субпопуляция клеток небольшого размера после адгезии в течение 20 мин и 30 мин. В случае коллагена IV типа аналогичная картина наблюдается при 10- и 20-минутном отборе. В этих условиях, по-видимому, добавив еще один критерий, представляется возможным не только идентифицировать субпопуляцию небольших круглых клеток, которые, как предполагается, являются стволовыми клетками, но и выделить их в чистом виде.
Культивируемые кератиноциты через неделю после посева. Различия в морфологии клеток выявляются только в пределах суток. После образования монослоя с последующим формированием многослойной структуры (стратификации) примерно через неделю после посева эти различия нивелируются, что может быть объяснено тем, что клетки постепенно нарабатывают свой матрикс и модифицируют подложку (рис. 20).
Базальный слой кератиноцитов после стриппинга. Проанализировать клетки такого пласта достаточно сложно, так как прогениторные клетки располагаются в нижнем (базальном) слое и не видны под микроскопом. Если же подвергнуть культуру кератиноцитов процедуре стриппинга, можно получить монослой клеток и, следовательно, исследовать состав популяции кератиноцитов, находящихся в базальном слое. На фотографиях кератиноцитов, культивируемых на коллагене I типа и фибронектине, видно, что клетки базального слоя действительно различаются (рис. 21). При использовании в качестве субстрата коллагена они выглядят более распластанными и более крупными, по сравнению с клетками, выращенными на фибронектине. Однако проведение более тонкого анализа морфометрических показателей в данном случае затруднено вследствие плотного контакта клеток друг с другом. Для того чтобы исключить ошибки при измерении размеров клеток, после стриппинга базальные кератиноциты были сняты с подложки, на которой выращивались, и посажены повторно на такой же субстрат на 1 ч. Как было видно из предыдущих результатов, этого времени достаточно, чтобы основная масса популяции адгезировала. к белку. Это позволило провести анализ гетерогенности популяций длительно культивируемых кератиноцитов после пересева. На рис. 22 представлены гистограммы распределения частот кератиноцитов, находящихся на разных субстратах, по их площади.
