Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
2.1. СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ БИОТИНА 7
2.2. РАСПРОСТРАНЕНИЕ БИОТИНА В ПРИРОДЕ 10
2.3. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БИОТИНА 13
2.4. БИОСИНТЕЗ БИОТИНА У МИКРООРГАНИЗМОВ 15
2.5. ТРАНСПОРТ БИОТЙНА КЛЕТКАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ 27
2.5.1. Транспортные системы ауксотрофных организмов 27
2.5.2. Поглощение биотина прототрофами ЗІ г
2.6. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ БИОТИНА С ПОЮЩЬЮ МИКРООРГАНИЗМОВ 35
2.6.1. Трансформация естественных и химически синтезированных аналогов биотина в биотит 36
2.6.2. Способы полного микробного синтеза биотина ^... 38
2.6.3. Антиметаболиты биотина и их действие на его биосинтез 39
2.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 44
3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ 58
4.1. ОБРАЗОВАНИЕ БИОТИНА РАЗЛИЧНЫМИ ГРУППАМИ МИКРООРГАНИЗМ МОВ 58
4.2. ОБРАЗОВАНИЕ БИОТЙНА В СВЯЗИ С СИНТЕЗОМ ЛИГЩЦОВ У НЕКОТОРЫХ ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ 65
4.3. ИЗУЧЕНИЕ РЕПРЕССИИ БИОТИНОМ СВОЕГО СИНТЕЗА У НЕКОТОРЫХ ДРОЖЖЕЙ ИПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ 71
4.4. ТРАНСПОРТ БИОТЙНА В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ 74
4.5. ВЛИЯНИЕ ПОЛИЕНОШХ АНТИБИОТИКОВ Ш РОСТ И ПРОДУКТИВНОСТЬ RHIZOPUS DELEMARI428 И ПРОНИЦАЕШСТЬ ЕГО МЕМБРАНЫ ДНЯ ЭКЗОГЕННОГО БИОТИНА 85
4.6. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИ СИНТЕЗИ РОВАННЫХ АНАЛОГОВ БИОТИНА 88
4.7. ТРАНСФОРМАЦИЯ ДЕСТИОБИОТИНА В БИОТИН РАСТУЩЕЙ, ПОКОЯЩЕЙСЯ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КУЛЬТУРОЙ ГРИБА RHI- ZOPUS DELEMAR 1428 94
4.8. ПОЛУЧЕНИЕ БИОТИНА ПУТЕМ МИКРОБНОГО СИНТЕЗА
4.8.1. Получение обогащенного биотитом препарата на Основе культуральной жидкости Rhizopus delemar 1428 112
4.8.2. Получение препарата, обогащенного биотитом путем Поверхностного культивирования Гриба Rhizopus delemar 1428 114
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 117
6. ВЫВОда 127
7. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 128
8. ПРИЛОЖЕНИЯ 145
- СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ БИОТИНА
- МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- ОБРАЗОВАНИЕ БИОТИНА РАЗЛИЧНЫМИ ГРУППАМИ МИКРООРГАНИЗМ МОВ
СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ БИОТИНА
Биотин (витамин Вг » витамин Н, фактор w , коэнзим R был обнаружен в начале века в результате изучения пищевой недостаточности, возникающей у различных организмов.
Кёгль в 1936 году, исследуя компоненты биос-комплекса дрожжей выделил один из наиболее активных его компонентов, названный биотином. Кеглю и Теннису (Kogi and Tormis , 1936) удалось выделить биотин в кристаллическом виде.
Открытие биотина не было обойдено вниманием отечественных ученых. Уже в 1949 году Иерусалимский в книге "Азотное и витаминное питание микробов" подробно описывает строение, функции этого витамина и его содержание в природных субстратах. История открытия биотина приведена в книге Мейселя "Функциональная морфология дрожжевых организмов" (1950). Выяснение химического строения биотина и методов его микробиологического определения описаны в книге Одинцовой "Микробиологические методы определения витаминов" (Ї959). Широко известны также монографии Филиппова (1962) о физиологической роли биотина в растительном и животном организмах,Березовского (1973) по химии этого витамина и работа Диканской(1980), суммирующая основные сведения о биосинтезе и физиологической роли биотина.
Химическая структура биотина была определена через б лет после выделения витамина в кристаллическом виде. В 1942 году дю Ви-НЬО С сотрудниками ( du Vigneaud, 1942, du Vigneaudet al,1942 , a,Ъ, Hofmann et аї?42) показали, что биотин представлен бициклической структурой из иммидазольного и тетрагидротиофенового колец, соединенных в цис-конфигурации с боковой цепочкой валериановой кислоты, прикрепляющейся к Cg-aTOMy тиофенового кольца (рис.1).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Начальным этапом работы была проверка способности к синтезу и экскреции биотина микроорганизмов различных таксономических групп. Были использованы представители плесневых грибов: родов
Rhizopus, Мисor, Aspergillus, Penicillium, Neurospora, Alterna ria, Dimargaris, Cladosporium , а также НЄИДЄН тифицированных плесневых грибов, выделенных из почв Пермской области (всего 38 штамме; Дрожжей родов: Rhodotorula, Candida, Saccha romyces, Hansenula, Pichia, Trichosporon (всего 22 штамма) и стрептомицетов (7 штаммов).
По литературным данным, среди представителей именно этих групп встречаются виды с повышенным уровнем синтеза биотина ( Ogata et al., 1965).
Микроорганизмы были получены нами из коллекций различных лабораторий: кафедры микробиологии (МГУ), кафедры биологии почв(МГУ), Технологического института пищевой промышленности, Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков.
З. Хранение и поддержание культур в активном состоянии
Плесневые грибы и дрожжи поддерживали в активном состоянии путем пересевов кшадые 3-4 месяца на агаризованное 4-баллинговое сусло, разлитое и скошенное в широких пробирках.
Стрептомицеты пересевали каждые 3-4 месяца на скошенную ага-ризованную среду (состав см. ниже).
ОБРАЗОВАНИЕ БИОТИНА РАЗЛИЧНЫМИ ГРУППАМИ МИКРООРГАНИЗМ МОВ
На начальном этапе работы нами было проведено исследование способности к синтезу и экскреции биотина 67 штаммов микроорганизмов, относящихся к следующим группам: плесневые грибы (38 штаммов), дрожжи (22 штамма) и стрептомицеты (7 штаммов).
Синтез витаминов в клетках, протекающий обычно со скоростью, значительно меньшей, скорости синтеза основных метаболитов (аминокислот, нуклеотидов), принято называть минорным синтезом (Шавловский, 1974). Хотя скорость образования витаминов невысока, и процесс находится обычно под строгим генетическим контролем, для ряда витаминов известно явление сверх синтеза. Некоторые микроорганизмы способны образовывать больше витамина, чем необходимо для нормальной жизнедеятельности и значительные количества его выделять в среду.
Так широко известен сверхсинтез флавинов. Сверхсинтетики фла-винов выделяют до 90$ синтезированных витаминов (Диканская, 1972).
Результаты обследования нами большой коллекции штаммов разных таксономических групп, представленные в таблицах 3-5 и на рисунке 15, показывают, что повышенным уровнем синтеза биотина среди них
Отличаются представители плесневых Грибов. Так Rhizopus delemar 1428, Мисor sp. 344 образуют 87-107 мкг биотина на грамм клеток, по сравнению с 69 мкг/г биотина у наиболее продуктивного представителя дрожжей Rhodotoruia giutinis или 54 мкг/г У Streptomyces rubescens б9б.
Еще более разительная разница наблюдается при сравнении доли выделяемого из клеток биотина. У некоторых грибов она достигает 50% (что для R.delemar 1428, M.sp. 344 составляет 39-51 мкг), а дрожжи выделяют не более 17мкг/г (25% общего коли - 59 чества) большинство же штаммов дрожжей вообще не экскретирует витамина.
Обращает на себя внимание, что определенная закономерность в распределении способности к синтезу биотина прослеживается не только при сравнении больших таксономических групп: плесневых грибов, дрожжей, стрептомицетов, но и в пределах одной группы, например, плесневых грибов.
Среди плесневых грибов в основном были изучены представители родов: Rhizopus и Mucor , относящиеся к низшим грибам фикоми-цетам порядка Mucoraies (мукоровые головчатые плесени), и представители РОДОВ Aspergillus И Penicillium , ОТНОСЯЩИЄСЯ К ВЫСШИМ грибам - аскомицетам. Виды с повышенным синтезом биотина обнаружены среди Представителей порядка Mucoraies . %КОровые головчатые плесени живут в естественных условиях на гниющих органических материалах, некоторые из них копрофилы, т.е. в природных условиях их окружают субстраты,предельно богатые как органическим веществом, так и витаминами. Представители этого порядка редко образуют антибиотики. Зигомицеты, использованные в нашей работе, были также выделены из богатых органических источников и поддерживались во Всесоюзной коллекции культур микроорганизмов на богатых органических средах (Милько А.А., "Определитель мукоровых грибов, Киев, 1974 ; "Каталог культур Всесоюзной коллекции микроорганизмов ВКМ").
