Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Распространенность и значимость антибиотикорезистентности микроорганизмов 14
1.2. Механизмы формирования устойчивости к антибиотикам 16
1.3. Резистентность к антибактериальным препаратам возбудителей гнойно-воспалительных осложнений у больных травматого-ортопедического профиля 20
1.4. Наночастицы металлов как альтернативные антибактериальные средства
1.4.1. Механизмы биологической активности наночастиц металлов 23
1.4.2. Влияние наночастиц металлов на бактериальные клетки
1.4.2.1. Влияние наночастиц серебра на прокариотические клетки 28
1.4.2.2. Влияние наночастиц меди на прокариотические клетки 29
1.4.2.3. Влияние наночастиц оксида титана на прокариотические клетки 31
1.4.2.4. Влияние наночастиц никеля на микроорганизмы 32
1.4.2.5. Биологическая активность наночастиц марганца 33
Глава 2. Материал и методы исследования 34
2.1. Объект исследования 34
2.2. Методы исследования 35
2.2.1. Физико-химические методы исследования наночастш 35
металлов
2.2.1.1. Определение химического состава поверхности наночастш.
2.2.1.2. Измерение дзета-потенциала и размеров агрегатов наночастиц методом динамического рассеивания света 35
2.2.1.3. Электронно-микроскопические исследования наночастиц металлов 36
2.2.2. Бактериологические методы исследования 36
2.2.2.1. Выделение и идентификация клинических антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов 36
2.2.2.2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам 37
2.2.2.3. Определение антибактериальной активности наночастиц металлов 39
2.2.2.4. Определение изменения биохимических свойств микроорганизмов после воздействия наночастиц металлов
2.2.2.4.1. Определение изменения биохимических свойств клинических антибиотикорезистентных штаммов Е. coli после воздействия наночастиц металлов 42
2.2.2.4.2. Определение изменения биохимических свойств антибиотикорезистентных штаммов P. aeruginosa после воздействия наночастиц металлов 43
2.2.2.4.3. Определение изменения биохимических свойств клинических антибиотикорезистентных штаммов S. epidermidisuocne воздействия наночастиц металлов 44
2.2.2.5. Определение изменения антибиотикочувствительности клинических штаммов микроорганизмов после воздействия наночастиц металлов 45
2.2.2. Статистическая обработка полученных данных 47
Глава 3. Физико-химическая характеристика наночастиц металлов 49
Глава 4. Влияние наночастиц металлов на антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов 53
4.1. Влияние наночастиц металлов на антибиотикорезистентные штаммы Е. coli 53
4.1.1. Чувствительность к антибактериальным препаратам клинических штаммовЕ. coli 53
4.1.2. Антибактериальное действие наночастиц меди в отношении клинических антибиотикорезистентных штаммов Е. coli 54
4.1.3. Антибактериальное действие наночастиц никеля в отношении антибиотикорезистентных штаммов Е. coli 58
4.1.4. Антибактериальное действие наночастиц титана в отношении антибиотикорезистентных штаммов Е. coli 61
4.1.5. Антибактериальное действие наночастиц марганца в отношении антибиотикорезистентных штаммов Е. coli 65
4.1.6. Сравнительный анализ антибактериального действия наночастиц металлов в отношении антибиотикорезистентных штаммов E.coli 68
4.2. Влияние наночастиц металлов на антибиотикорезистентные штаммы P. aeruginosa 73
4.2.1. Чувствительность к антибактериальным препаратам клинических штаммов P. aeruginosa 73
4.2.2. Антибактериальное действие наночастиц меди в отношении антибиотикорезистентных штаммовР. aeruginosa 75
4.2.3. Антибактериальное действие наночастиц никеля в отношении антибиотикорезистентных штаммов P. aeruginosa 78
4.2.4. Антибактериальное действие наночастиц титана в отношении антибиотикорезистентных штаммовР. aeruginosa 82
4.2.5. Антибактериальное действие наночастиц марганца в отношении антибиотикорезистентных штаммовР. aeruginosa 86
4.2.6. Сравнительный анализ антибактериального действия наночастиц металлов в отношении антибиотикорезистентных штаммов Р. aeruginosa 90
4.3. Влияние наночастиц металлов на антибиотикорезистентные штаммы S. epidermidis 95
4.3.1. Чувствительность к антибактериальным препаратам клинических штаммов S. epidermidis 95
4.3.2. Антибактериальное действие наночастиц меди в отношении антибиотикорезистентных штаммов 1, epidermidis 97
4.3.3. Антибактериальное действие наночастиц никеля в отношении антибиотикорезистентных штаммов , epidermidis 100
4.3.4. Антибактериальное действие наночастиц титана в отношении антибиотикорезистентных штаммов5. epidermidis 104
4.3.5. Антибактериальное действие наночастиц марганца в отношении антибиотикорезистентных штаммов.!?, epidermidis 108
4.3.6. Сравнительный анализ антибактериального действия наночастиц металлов в отношении антибиотикорезистентных штаммов S. epidermidis 112
Глава 5. Коэффициент редукции бактериальных клеток как критерий эффективности антибактериального действия наночастиц металлов в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов 117
5.1. Редукция бактериальных клеток клинических штаммов микроорганизмов под влиянием наночастиц меди 117
5.2. Редукция бактериальных клеток клинических штаммов микроорганизмов под влиянием наночастиц Глава 6. Влияния наночастиц металлов на чувствительность к
антибиотикам клинических штаммов микроорганизмов 122
6.1. Чувствительности к антибиотикам клинических штаммов Е. coli под действием наночастиц металлов 123
6.2. Чувствительности к антибиотикам клинических штаммов Р. aeruginosa под действием наночастиц металлов 127
6.3. Чувствительности к антибиотикам клинических штаммов S. epidermidis под действием наночастиц металлов 130
Глава 7. Влияние наночастиц металлов на биохимические свойства клинических антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов 134
7.1. Влияние наночастиц металлов на биохимические свойства клинических штаммов Е.coli 134
7.2. Влияние наночастиц металлов на биохимические свойства клинических штаммов P. aeruginosa 137
7.3. Влияние наночастиц металлов на биохимические свойства клинических штаммов S. epidermidis 141
Глава 8. Обсуждение результатов собственных исследований 145
Выводы 152
Список работ, опубликованных по теме диссертации 153
Список использованной литературы
- Механизмы формирования устойчивости к антибиотикам
- Измерение дзета-потенциала и размеров агрегатов наночастиц методом динамического рассеивания света
- Чувствительность к антибактериальным препаратам клинических штаммовЕ. coli
- Сравнительный анализ антибактериального действия наночастиц металлов в отношении антибиотикорезистентных штаммов Р. aeruginosa
Введение к работе
Актуальность темы.
Ежегодно в странах Европейского союза около 25 тыс. человек умирают от инфекций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов (Codex Alimentarius Commission, 2010). Повсеместное применение антибактериальных препаратов для лечения заболеваний различной этиологии способствует селекции и диссиминации антибиотикорезистентных микроорганизмов, что приводит к увеличению случаев гнойно-септических заболеваний (Козлов Р.С., 2010).
В структуре общей хирургической патологии гнойно-воспалительные заболевания достигают 30 %. При этом более 20 % всех гнойных заболеваний относятся к тяжелым гнойно-септическим поражениям конечностей (Чолахян А. В., 2013). Одним из факторов, ухудшающих результаты лечения данной группы пациентов, является лекарственная резистентность возбудителей (Рахимов Б.М., Коровин О.А., 2013).
Основными возбудителями гнойно-септических процессов у пациентов травматолого-ортопедического профиля являются стафилококки, которые выделяются в 49 – 60 % случаев (Гостев В.В. и соавт., 2008; Божкова С.А. и соавт., 2009; Рахимов Б.М., Коровин О.А., 2013).
Наряду с золотистым стафилококком, важную роль отводят коагулазоотрицательным стафилококкам и, в первую очередь, Staphylococcus epidermidis. Частота выделения S. epidermidis у пациентов с осложнениями опорно-двигательного аппарата составляет 6,3 – 15,1 % (Божкова С.А., 2011).
Второе место среди возбудителей гнойно-воспалительных осложнений у пациентов травматолого-ортопедического профиля занимают грамотрицательные бактерии, которые встречаются в 11 - 33 % случаев, из них неферментирующие, в том числе Pseudomonas aeruginosa, составляют 54 - 63%, энтеробактерии, в том числе Escherichia coli, – 28 – 36 % (Гостев В.В. и соавт., 2008; Божкова С.А. и соавт., 2009; Рахимов Б.М., Коровин О.А., 2013).
Быстрое формирование устойчивости микроорганизмов к антибиотикам диктует необходимость поиска новых, альтернативных антимикробных препаратов (Hajipour M.J. et al., 2013). В этом отношении металлы в виде наночастиц являются одним из перспективных претендентов на создание нового класса антибактериальных средств, поскольку они обладают низкой токсичностью, пролонгированным действием; в биотических дозах стимулируют функциональную активность ферментных систем (Глущенко Н.Н. и соавт., 2006). Нанопорошки металлов обладают бактериостатическим и бактерицидным действием. Показана высокая антибактериальная активность наночастиц серебра в отношении антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов (Singh М. et al., 2004; Sondi I., Salopek-Sondi B., 2004; Pal S. et al., 2007). Серебро относится к переходным металлам, к группе элементов побочной подгруппы I – VIII групп Периодической системы химических элементов Д.И. Менделеева, в атомах которых появляются электроны на d-и f-орбиталях. Незавершенность внутренних электронных оболочек предопределяет наличие у переходных металлов ряда общих специфических свойств, таких как небольшие значения электроотрицательности, переменная степень окисления и другие. Наряду с серебром к d-переходным элементам относятся 37 металлов побочной подгруппы. В настоящее время антибактериальная активность наночастиц меди, диоксида титана и никеля изучена на музейных штаммах микроорганизмов (Биркина А.И., 2006; Лущаева И.В., 2009; Cioffi N. et al., 2005; Yoon К. et al., 2007; Kumar Н. et al., 2010).
В связи с этим актуальным является изучение антибактериальной активности d-элементов группы переходных металлов в отношении антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, выделенных от пациентов травматолого-ортопедического стационара с целью их дальнейшего применения в качестве антибактериальных агентов.
В ряде работ, посвященных изучению свойств наночастиц металлов, показана зависимость антибактериальной активности от физических характеристик наноматериала (Андрусишина И.Н., 2011; Рахметова А.А., 2011). Антибактериальная активность наночастиц связана с их размерами, с большой удельной площадью, которая обеспечивает высокую химическую активность и способность проникать внутрь организма. В связи с этим необходимо провести исследования физико-химических параметров наночастиц металлов для их дальнейшего применения в качестве антибактериальных агентов.
Цель исследования - изучение влияния наночастиц меди, никеля, титана и марганца на антибиотикорезистентные штаммы бактерий (E. coli, P. aeruginosa, S. epidermidis), выделенные от пациентов травматолого-ортопедического стационара.
Задачи исследования
-
Исследовать физико-химические свойства нанопорошков меди, никеля, титана и марганца (химический состав поверхности наночастиц, способность к агрегации, размер наночастиц и их агрегатов).
-
Изучить и провести сравнительную оценку антибактериального действия суспензии высокодисперсных порошков меди, никеля, титана и марганца в отношении антибиотикорезистентных штаммов бактерий (E. coli, P. aeruginosa, S. epidermidis), выделенных от пациентов травматолого-ортопедического стационара.
-
Оценить характер воздействия суспензии нанопорошков металлов на биохимические показатели жизнедеятельности клинических антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов (E. coli, P. aeruginosa, S. epidermidis).
-
Изучить чувствительность к антибиотикам антибиотикорезистентных штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от пациентов травматолого-ортопедического стационара до и после воздействия наночастиц металлов.
Научная новизна работы
В результате проведенных исследований показана активность наночастиц переходной группы металлов в отношении клинических антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов. Полученные данные углубляют теоретические представления о многостороннем воздействии наночастиц переходной группы металлов на бактериальную клетку, об особенностях чувствительности клинических антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов к наночастицам меди, никеля, титана с определенными физико-химическими свойствами.
Впервые в экспериментах in vitro доказан антибактериальный эффект наночастиц меди, никеля, титана и марганца различной степени выраженности, зависящий от их концентрации и времени воздействия, а также от вида микроорганизмов.
Впервые показано, что наночастицы марганца проявляют низкую антибактериальную активность в отношении клинических штаммов бактерий.
Показано, что после воздействия наночастиц меди на антибиотикорезистентные штаммы E. coli восстанавливается чувствительность бактерий к ампициллину, амоксициллину/клавуланату, гентамицину, а после воздействия на антибиотикорезистентные штаммы P. aeruginosa - к цефтазидиму.
Установлено влияние наночастиц меди, никеля, титана и марганца на ферментативную активность микроорганизмов.
Практическая значимость работы
Доказанная in vitro антибактериальная активность наночастиц металлов (меди и никеля) создает основу для дальнейших исследований на лабораторных животных с целью последующего клинического использования наночастиц в качестве антимикробных агентов, препятствующих распространению антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов.
Разработан «Способ повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (заявка № 2013118376 от 19.04.2013г.).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Наночастицы переходной группы металлов (меди и никеля) с изученными физико-химическими свойствами обладают высокой антибактериальной активностью в отношении клинических антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, имеющей, как правило, время- и дозозависимый характер.
-
Наночастицы титана и марганца с изученными физико-химическими свойствами обладают слабой антибактериальной активностью в отношении клинических антибиотикорезистентных штаммов S. epidermidis, наночастицы титана в некоторых случаях проявляют ростстимулирующее действие.
-
Под влиянием наночастиц меди, никеля, титана и марганца происходят изменения ферментативных свойств клинических антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, в большинстве случаев затрагивающие их сахаролитическую активность.
-
Чувствительность клинических антибиотикорезистентных штаммов E. coli и P. aeruginosa к некоторым антибактериальным препаратам восстанавливается под воздействием наночастиц меди.
Личный вклад автора в результаты исследования
Состоит в разработке и проведении экспериментальных исследований на всех этапах диссертационной работы, интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на заседаниях научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Саратов 2011, 2013); научно-практической конференции молодых учёных «Актуальные вопросы травматологии, ортопедии, нейрохирургии и вертебрологии» (Саратов, 2012); заседании научного общества «Ассоциации травматологов и ортопедов» (Саратов, 2011, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в травматологии, ортопедии и нейрохирургии» (Саратов, 2013); XV Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии (Москва, 2013).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования» и пяти глав собственных наблюдений, главы обсуждения результатов исследования, выводов и списка используемых источников литературы, включающего 173 источника, из них 71 отечественный и 102 иностранных. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 21 рисунком.
Публикации
Механизмы формирования устойчивости к антибиотикам
Основными возбудителями гнойно-септических процессов у больных травматолого-ортопедического профиля являются стафилококки. Из раневого отделяемого пациентов травматологических стационаров данный возбудитель выделяется 49 - 60 % случаев (Гостев В.В. и соавт., 2008; Божкова СА.и соавт., 2009; Рахимов Б.М., Коровин О.А., 2013). Стафилококк обусловливает в настоящее время до 50% случаев сепсиса. Летальность при этом составляет 29-38 % (Волков И.И., 1999).
В настоящее время, наряду с золотистым стафилококком, важную роль отводят коагулазоотрицательным стафилококкам и, в первую очередьД epidermidis. Так, выявлен рост гнойных осложнений за счет эпидермального стафилококка с 9 до 18%, септических заболеваний - с 45% до 60,3%; рост послеоперационных нагноений в хирургии - до 21,4% (Ждакова Н.А. и соавт., 2001). Отмечается, что эпидермальный стафилококк вызывает септические процессы в настоящее время чаще, чем золотистый стафилококк.
Важность проблемы диагностики и профилактики стафилококковых инфекций обусловлена широким распространением полиантибиотикорезистентных штаммов, в особенности метициллинрезистентных. Прослеживается четкая тенденция в мире к увеличению частоты выделения MRS в хирургических стационарах, отделениях интенсивной терапии. До 19,0-42,8% выделенных культур S.aureus (Дехнич А.В., 2002) и 39,4-79,0% КОС могут бытьметициллинрезистентными (Ждакова Н.А. и соавт., 2001). Проблема распространения изолятов стафилококков, устойчивых к оксациллину, особенно актуальна в настоящий момент, что связано с отсутствием у них чувствительности не только к /?-лактамным антибиотикам, но и ко многим другим классам антибактериальных препаратов - макролидам, линкозамидам, аминогликозидам, тетрациклинам, хлорамфениколу, фторхинолону(Страчунский Л.С. и соавт., 2005; Собирова Е.В. и соавт., 2010; DaumR.S., 2007).
Формирование у стафилококка резистентности к /?-лактамным антибиотикам связано с геном тесА. Данный ген кодирует пенициллинсвязывающий белок 2а или ПСБ2, в норме связывающийся с /?-лактамными антибиотиками в клеточной стенке, что ведет к нарушению синтеза пептидогликана, и как следствие, гибели микроорганизма (РомановА.В., ДехничА.В., 2011).
Эпидермальный стафилококк способен продуцировать полисахаридный адгезии, обеспечивающий прикрепление микроорганизма к полимерным материалам, что приводит к образованию биопленок, внутри которых микроорганизм трудно поддается воздействию антибактериальных препаратов (ГординскаяН.А., 2012). Сочетание адгезивной способности с геном резистентности у штаммов эпидермального стафилококка является адаптивным механизмом, обеспечивающим устойчивость к широкому кругу антибактериальных препаратов.
Второе место по частоте выделения из раневого отделяемого больных травматолого-ортопедического профиля занимают грамотрицательньные палочки, которые встречаются в 11 - 33 % случаев, из них неферментирующие бактерии составляют 54 - 63%, энтеробактерии - 28 - 36 % (Гостев В.В. и соавт., 2008; Божкова С.А.и соавт., 2009; Рахимов Б.М., Коровин О.А., 2013).
Грамотрицательные неферментирующие бактерии - наиболее частые возбудители нозокомиальных гнойных хирургических инфекций. Наиболее значимой из них является синегноиная палочка (P. aeruginosa). Среди грамнегативных возбудителей раневой инфекции доля P. aeruginosa составляет около 24 %,причем в 7,4 % случаев она выделяется у больных травматологических стационаров (Пхакадзе Т.Я. и соавт., 2003; Копёнкин С.С. и соавт., 2007).
Важными особенностями синегнойной палочки считаются природная устойчивость ко многим антибактериальным препаратам, отсутствие чувствительности к дезинфицирующим веществам, а также высокая контагиозность.
Быстрое формирование устойчивости к антибактериальным препаратам различных классов Р. аег іпояаобеспечивается за счет мембранной системы активного выброса (эффлюкс-система MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN и MexXY) (Шагинян И.А. и соавт., 2005).
P. aeruginosa обладает способностью продуцировать бета-лактамазы I типа. При возникновении спонтанных генетических мутаций нестабильные антибиотики, инактивирующиеся ферментами I типа, ингибируют чувствительные немутантные штаммы микроорганизмов, но при этом позволяют размножаться устойчивым мутантным штаммам, которые становятся превалирующей флорой (Яковлев СВ., 1999).
Устойчивость к карбопенемам у P. aeruginosаформируется за счет мутации или уменьшения экспрессии поринового белка OprD, эффлюкса, а также ферментативной инактивации карбопенемазами 3 классов: металло-бета-лактамазами класса В (VIM, IMP), класса A (GES, КРС), класса D (ОХА-50) (Гладкий Д.В., 2007; QuecnanA.M.etal., 2007). Гены, ответственные за синтез металло-/3-лактамаз, локализованы преимущественно в интегронах.
Е. coli - грамотрицательная палочка, является одним из основных этиологических агентов инфекций различной локализации.У больных с патологией оппорно-двигательного аппарата данный возбудитель выделяется в 2 % случаеви характеризуется высокой частотой резистентности к антимикробным препаратам (Божкова С.А.и соавт., 2009; Гостев В.В. и соавт., 2011; Рахимов Б.М., Коровин О.А., 2013).
Характерным для штаммов Е. coli является формирование множественной резистентности, обусловленной продукцией бета-лактамаз расширенного спектра. Данный вид резистентности обеспечивает невосприимчивость микроорганизмов к цефалоспоринам I - IV поколений. БИРС Е. coli относятся к ТЕМ, SHV и СТХ-М типам (AndriatahinaT. etal., 2010; ChongY. etal., 2011). БЛРС-продуцирующие штаммы микроорганизмов часто проявляют устойчивость к небеталактамным препаратам (фторхинолонам и аминогликозидам). Данный феномен реализуется за счет ко-селекции резистентности и сцепления генов, кодирующих БЛРС, аминоглюкозидмодифицирующих ферментов и факторов устойчивости к хинолонам на плазмидах. Устойчивость к фторхинолонам Е. со/гформируется за счет одиночного нуклеотидного полиморфизма в генах gyrA и рагС, а также активации системы эффлюкса (CerquetteM. etal., 2010; JohnsonJ.R. etal., 2010). Кроме того, Е. со/г способна продуцировать карбопенемазы различных классов (МБЛ класса Б, КРС-тип карбапенемаз класса А и ОХА-типа, гидролизующие карбопенемы бета-лактамазы класса Д), обеспечивающие устойчивость к карбопенемам (CendejasE. etal., 2010; MariagouV. etal., 2010).
Измерение дзета-потенциала и размеров агрегатов наночастиц методом динамического рассеивания света
Нанопорошки металлов проявляют ярко выраженную биологическую активность, в том числе бактериостатическое и бактерицидное действия. В ряде работ описано антибактериальное действие наночастиц серебра, в том числе и в отношении полиантибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов (SinghM.etaL, 2004; Sondil., Salopek-SondiB., 2004;YamanakaM. et. al., 2005; PalS. etal., 2007;SarkarS. etal., 2007;ShahverdiA.R. etal., 2007; ShrivastavaS. etal., 2007;FabregaJ. etal., 2009; LaraH.H. etal., 2011; NandaA., SaravananM., 2009; JuanL.etal., 2010; LaraH.H. etal., 2010). Отмечено, что ультрадисперсное серебро имеет более выраженный антибактериальный эффект по сравнению с его ионной формой (PalS. etal., 2007). Рядом авторов установлено, что серебро в ультрадисперсной форме способно высвобождать ионы, что определяет основной механизм его антибактериального действия (Dragieval. etal., 1999; HamoudaT. etal, 2000; DibrovP. etal., 2002; FurnoF. et. al., 2004; RoeD. etal., 2008). Освободившиеся ионы серебра ингибируют действие дыхательных ферментов, что приводит к активации свободного кислорода и повреждению бактериальной клетки (StohsS.J., BagchiD., 1995). Кроме того, наночастицы серебра способны прикрепляться к клеточной стенке микроорганизма, что вызывает ее перфорацию (LokC.N. etal., 2006). Также наночастицы серебра проникают внутрь клетки и связываются с фосфор- и сульфосодержащими соединениями, такими как белки и нуклеиновые кислоты (PanacekA. etal., 2006). Степень выраженности антибактериального действия наночастиц серебра зависит от их размера и формы. Наночастицы с меньшим размером имеют более развитую площадь поверхности, что обеспечивает более эффективное их взаимодействие с бактериальной клеткой и, как следствие, приводит к более выраженному антибактериальному эффекту (BakerC. etal., 2005; PanacekA. etal., 2006). Исследования показали, что наибольшее бактерицидное действие в отношении штаммов Е. coli оказывают наночастицы серебра треугольной формы, по сравнению со сферической и палочковидной. Причины данного эффекта до конца не изучены(Ра18. etal., 2007).
Рядом авторов изучена антибактериальная активность наночастиц меди (АстротинаА.В., 2006; Биркина А.И., 2006;WeiY. etal., 2010; StanilaA. etal., 2011). N. Cioffi и соавт. (2005) в своих исследованиях продемонстрировали бактериостатическое и антимикотическое действие ультрадисперсного порошка металла. J. Ramyadevi и соавт. (2012) исследовали бактерицидное действие наночастиц меди в отношении штаммов Micrococcusluteus, S.aureus, E.coli, Klebsiellapneumonia, P. aeruginosa, также Aspergillusflavus, A. niger и Candidaalbicans. Наночастицы меди оказывали более выраженное действие по отношению к бактериальным клеткам. Кроме того, было выявлено фунгицидное действие наночастиц меди, однако оно оказалось слабее.
Антибактериальное действие наночастиц меди по своей активности сопоставимо с влиянием наночастиц серебра (ИльинА.П. и соавт., 2007). К.Уоопи соавт. (2007) изучено влияние наночастиц меди и серебра на стандартные штаммы Bacillussubtilis и Е. coli. Установлено, что наночастицы медис дисперсностью 100 нм обладали высокой активностью в отношении/?, subtilis, тогда как наночастицы серебра с дисперсностью 40 нм показали низкую активность в отношении штаммов Е. coli.
Д.Г. Дерябина и соавт. (2013) в работе по изучению антибактериальной активности наночастиц меди в тестах на люминесцирующих штаммах Е. coli(E. coliK12MG1655 pSoxS::lux, ketG::lux, recAr.lux) выявили основные механизмы антибактериального действия ультрадисперсного порошка металла. В исследовании показано формирование электростатического контакта при взаимодействии положительно заряженных наночастиц меди с отрицательно заряженной поверхностью бактериальной клетки. Кроме того, выявлено развитие окислительного стресса модельных микроорганизмов. Данный механизм определяется переносом электронов на молекулярный кислород через встроенные в мембрану бактериальной клетки наночастицы меди, результатом чего является повреждение молекулы ДНК активными формами кислорода.
Электронно-микроскопические исследования влияния наночастиц меди на штаммы Е. coli показали значительные разрушенияклеточной стенки микроорганизма при воздействиив течение 1, 3 и 6 часов (RaffiM., 2010). В результате гидролизапептидогликана из-за возникшего высокого осмотического давленияпроисходит разрыв муреинового мешка,что приводит к выпуску цитоплазматических компонентов и фрагментов клеточной стенки.
По мнению B.C. Лебедеваи соавт. (2002), антибактериальный эффект наночастиц меди обусловлен нарушением барьерной функции клеточной мембраны микроорганизма. Выявлено, что обработка бактериальной клетки наночастицами меди способствовала утечке катионов К+, которые определяют совокупность окислительно-восстановительных процессов в примембранном пространстве. Наноструктурированныйметаллможет вызвать высвобождение натрия, кальция, фосфора и калия, что приводит к дестабилизации мембраны и потереклеточных компонентов (Diaz-VisurragaJ. etal., 2010). Кальцийиграет важную роль в клеточном метаболизме и сохранении липополисахарида сборки на поверхности клетки грамотрицательных бактерий (KotraL.P. etal., 1999).
Кроме того, показано, что наночастицы меди способны вступать во взаимодействие с функциональными группами аминокислот, вызывать денатурацию белков клетки, нарушать ферментативное равновесие внутри клетки (Гарасько Е.В. и соавт., 2008). Металлические и ионные формы меди образуют гидрокси-радикалы, которые способствуют разрушению жизненноважных белков и ДНК (WangS. etal., 2011).
Чувствительность к антибактериальным препаратам клинических штаммовЕ. coli
В качестве контроля использовали 0,9 % раствор хлорида натрия и смесь 0,9 % растворахлорида натрия и ЭДТА. В контрольные пробирки вносили 100 мкл взвеси микроорганизмов и инкубировали в термошейкере (SkyLineST-3 (ELMI, Латвия))при 150 об/мин и температуре 37С в течение 60 минут; 100 мкл полученной биомассы высевали на агаризованную питательную среду и инкубировали в термостате при температуре 37С в течение 18-24 часов. На следующей день просматривали чашки с выросшей культурой и определяли чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В исследовании использовали перечень антибактериальых препаратов, приведенный в пункте 2.2.2.2.
Для всех исследуемых штаммов микроорганизмов до и после воздействия наночастиц металлов определен условный коэффициент резистентности по следующей формуле: ,(3) где К - коэффициент резистентности, R - количество антибиотиков, к которым исследуемый штамм резистентен (в том числе с промежуточной чувствительностью), N - общеечисло антибактериальных препаратов, принятых в исследование. Показатели коэффициента позволяют судить об относительной интегральной резистентности штаммов микроорганизмов к используемым в исследовании антибактериальным препаратам. Полученные показатели варьируют от 0 до 1. Нулевой показатель означает отсутствие резистентности у исследуемых штаммов микроорганизмов, 1 - наличие устойчивости ко всем препаратам, принятым в исследование (Гостев В.В. и соавт., 2010). 2.2.2. Статистическая обработка полученных данных
Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ MicrosoftExcel 2010 и Statistica 6.0(Реброва О.Ю., 2006). Проверку нормальности распределения количественных показателей выполняли с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, коэффициентов асимметрии и эксцесса. Оценку различий между выборками проводили с использованием t критерия Стьюдента, так как переменные соответствовали нормальномураспределению. В анализе использованы следующие статистические показатели: п - число наблюдений; М - среднее арифметическое значение; m - среднеквадратическая ошибка; р - коэффициент достоверности. Различия считали статистически значимыми при р 0,05, что соответствует требованиям, предъявляемым к медико-биологическим исследованиям.
Взаимосвязь между качественными признаками устанавливали путем выявления взаимной сопряженности. Для достижения поставленной цели рассчитан критерий х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Данная поправка используется при низких абсолютных частотах в таблице (менее 10). С помощью четырехпольной таблицы сопряженности (2x2) установлена связь между признаками и дана количественная оценка этой взаимосвязи. Таблица сопряженности имела следующий вид (таблица 1): А - число объектов исследования в группе 1 с исходом 1, В - число объектов исследования в группе 1 с исходом 2, С - число объектов исследования в группе 2 с исходом 1, D - число объектов исследования в группе 2 с исходом 2. Интерпретация результатов основывалась на следующем: - если р 0,05, то нулевую гипотезу об отсутствии различий между группами по частоте признаков не отвергают; - если р 0,05, то следует отклонить нулевую гипотезу и принять альтернативную гипотезу о существовании различий между группами по частоте изучаемого признака. Глава 3. Физико-химическая характеристика наночастиц металлов
Биологическая активность наночастиц металлов напрямую зависит от их физико-химических свойств, что позволяет моделировать основные их характеристики для получения необходимых показателей (Андрусишина И.Н., 2011).В ряде работ, посвященных изучению свойств наночастиц металлов, показана зависимость биологического действия наночастиц металлов от их физических характеристик(Рахметова А.А., 2011). В связи с вышеизложенным, необходимо провести исследование физическо-химических параметров наночастиц металлов для их стандартизации при дальнейшем использовании в качестве антибактериальных агентов.
При помощи энерго - дисперсионного анализа определена атомная доля элементов в составе поверхности наночастиц металлов. Анализ электронного состава поверхности наночастиц меди представлен на рисунке 1. На поверхности наночастиц меди обнаружено 55,11% меди,26,58% кислорода, 8,88% углерода, 9,44% железа.
Состав поверхности наночастиц металлов дает важную информацию о наличии посторонних соединений в их составе. Полученными данными по содержанию углерода в образцах можно пренебречь, так как его используют для напыления при проведении измерения. Присутствие кислорода в составе поверхности наночастиц металла свидетельствует о наличии оксидов, входящих в состав оксидной оболочки, которая обеспечивает постепенную диффузию ионов и пролонгированное действие наночастиц (Павлов Г.В. и соавт., 2007).
Проведено измерение -потенциала и среднего гидродинамического размера агрегатов наночастиц металлов. В результате установлено, что величина -потенциала наночастиц металлов варьировала в широких диапазонах. Для наночастиц меди его показатели составили 34,7 мВ, никеля - 3,51 мВ, титана -13,9 мВ, марганца - 2,92 мВ. Поскольку величина дзета-потенциала пропорциональна заряду коллоидной частицы, агрегативная устойчивость наночастиц будет возрастать с увеличением его величины. Значит, с уменьшением размера наночастиц металлов агрегационная стабильность суспензии будет повышаться, а заряд поверхности увеличиваться (Юнда Е.Н.,
Сравнительный анализ антибактериального действия наночастиц металлов в отношении антибиотикорезистентных штаммов Р. aeruginosa
Изучена чувствительность клинических штаммов P. aeruginosas: 10 антимикробным препаратам следующих групп: /?-лактамные антибиотики, аминогликозиды, хинолоны. Установлен высокий уровень резистентности клинических штаммов микроорганизмов к профильным антибиотикам. По результатам исследования из 20 клинических штаммов P. aeruginosa 14 штаммов оказались устойчивыми к 5 и более антибиотикам.
Диаграмма показывает, что наибольший уровень резистентности штаммов Р. аегг шояанаблюдали в отношениир-лактамных антибиотиков. Всего 19 штаммов микроорганизмов оказались устойчивыми к цефалоспоринам. В частности, эти штаммы обладали резистентностью к цефепиму, 15 штаммов - к цефоперазону, 15 штаммов - к цефтазидиму. Кроме того, у одного из исследуемых штаммов наблюдалась промежуточная устойчивость к цефтазидиму, также у одного - к цефоперазону. В отношении ингибиторозащищенных пенициллинов также отмечался высокий уровень устойчивости: 16 штаммов Р. aeruginosa являлись резистентными к пиперациллину/тазобактаму. Наиболее высокой активностью в отношении штаммов P. aeruginosa, из группы /?-лактамных антибиотиков, обладали карбопенемы (14 штаммов отнесены кчувствительным к меропенему, 10 - к имипенему). Кроме того, определена чувствительность к аминогликозидам. Выявлено 14 штаммов, устойчивых к гентамицину, 11 - к амикацину. Промежуточный уровень чувствительности к амикацину определен у одного штамма. Чувствительность к хинолонам определяли в отношении ципрофлоксацина и левофлоксацина. Исследование показало устойчивость к левофлоксацину 13 штаммов P.aeruginosa, 2 штамма обладали промежуточной чувствительностью; резистентными к ципрофлоксацину были 11 штаммов, 4 штамма обладали промежуточной чувствительностью.
В результате проведенных исследований выявлен высокий уровень резистентности клинических штаммов P. aeruginosa в отношении антибактериальных препаратов, наиболее часто используемых для лечения инфекций, вызванных данным возбудителем. Полученные данные обословили необходимость дальнейшего изучения антимикробной активности альтернативных антибактериальных средств, в частности, наночастиц металлов, в отношении резистентных штаммов P. aeruginosa.
Антибактериальное действие наночастиц меди в отношении антибиотикорезистентных штаммов P. aeruginosa В результате проведенных исследований оценено антибактериальное действие наночастиц меди различной концентрации на 20 клинических антибиотикорезистентных штаммах P. aeruginosa, при различном времени воздействия. При культивировании микроорганизмов на агаризованных питательных средах зафиксировано различие в количестве выросших колоний в опыте по сравнению с контролем. Результаты исследований представлены в таблице 7.
Количество микроорганизмов, выросших на агаризованной питательной среде после воздействия наночастиц меди, во всех вариантах опыта меньше, чем в контрольной группе.
Воздействие наночастиц меди в концентрации 0,01 мг/мл в течение 30 минут приводило к статистически достоверному (р 0,001) уменьшению количества жизнеспособных микроорганизмов до 47,96±2,32 %. Увеличение времени экспозиции до 60, 90 и 120 минутспособствовало снижению бактериальных клеток до 23,91± 1,24%, 31,97±1,75% и 10,66±0,36% соответственно(р 0,001). Увеличение концентрации наночастиц меди до 0,05 мг/мл приводило к усилению антибактериального действия ультрадисперсных порошков меди при времени воздействия 30, 90, 120 минут. Количество микробных тел здесь составило 26,64±1,59 %, 14,75±0,75% и 5,68±0,31% соответственно(р 0,001).
Действие наночастиц меди в концентрации от 0,05 до 0,1 мг/мл при времени воздействия 60 минут способствовало незначительному снижению бактерицидной активности по сравнению с концентрацией 0,01 мг/мл на 4,56±1,42% и 22,33±2,32% соответственно.
Концентрация наночастиц меди 0,1 мг/мл и время воздействия 30, 90 и 120 минут обусловила снижение бактериальных клеток до 26,64±1,59%, 10,06±0,69%, 0,24±0,05%соответственно(р 0,001).
Дальнейшее увеличение концентрации наночастиц меди приводило к усилению антибактериальной активности вплоть до полной гибели микроорганизмов. После воздействия нанопорошка металла в концентрации 0,5 мг/мл количество жизнеспособных микроорганизмов составило при 30-минутной экспозиции 10,53±0,48% (р 0,001), при 60-минутной - 7,52±0,75 % (р 0,001). Концентрация 1 мг/мл при 30-минутной инкубации способствовала снижению бактериальных клеток до 2,09±0,22% (р 0,001), при 60 мин. - до 0,72±0,2% (р 0,001). Увеличение времени воздействия до 90-120 минут при данных концентрациях наночастиц меди вызывало полную гибель микроорганизмов.
Похожие диссертации на Влияние наночастиц переходной группы металлов на антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов
