Введение к работе
Актуальность работы. Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе и являются представителями микрофлоры человека и теплокровных животных. Они обладают высокой биологической и функциональной активностью, что определяет их практическое использование в качестве пробиотиков и в производстве пищевых продуктов. Среди бактерий, применяемых как пробиотики, наиболее широко известна своим полезным действием Lactobacillus acidophilus, которая заселяет кишечник новорожденного ребенка и, вступив с ним в устойчивый симбиоз, сопровождает человека на протяжении всей его жизни, оказывая благотворное влияние на его здоровье [Королева, 1975; Каган, 2008]. L. acidophilus является наиболее сильным антагонистом среди других представителей рода Lactobacillus. Антагонистическая активность L. acidophilus к патогенной, условно-патогенной и технически-вредной микрофлоре осуществляется конкурентными и аллелопатическими взаимоотношениями. Изучение этих взаимоотношений, которые характерны как для представителей микробоценозов организма человека, так и микробных популяций на фоне действия факторов различной природы являются актуальными задачами экологии микроорганизмов [Тучина, 2008]. Особенно важно, что это свойство, привлекающее к данному виду лактобацилл наибольшее внимание исследователей, четко проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo -непосредственно в естественных системах L. acidophilus/отртаяизм хозяина.
Штаммы, обладающие антагонистической активностью, различаются по силе и характеру воздействия на ингибируемый микроорганизм, а также по ширине и специфичности спектра ингибируемых микробов. Антагонистическая активность L. acidophilus - важное, но далеко не единственное свойство этой бактерии. L. acidophilus обладает также высоким уровнем колонизационной способности, желчеустойчивости и антибиотикоустойчивости.
Все это определяет постоянно растущий интерес исследователей к изучению L. acidophilus и выделению штаммов, перспективных для использования в пищевой промышленности. Следует отметить, что входя в состав пробиотических продуктов или лекарственных препаратов, а также при попадании внутрь организма-хозяина, производственные штаммы L. acidophilus оказываются в среде обитания, где на рост и антагонистическую активность ацидофильной палочки влияют разные экологические факторы, поэтому детальное изучение влияния этих факторов на пробиотические микроорганизмы имеет большое значение. Кроме того, характеристика штаммов L. acidophilus, описанных в патентах не является завершенной, комплексной по оценке биологических и экологических свойств L. acidophilus..Поэтому необходимо описывать и вести мониторинг особенностей коллекционных штаммов, используемых в промышленности для обеспечения экологической безопасности продуктов питания.
Цель работы: провести эколого-биологическую оценку штаммов L. acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов. Задачи исследования:
1. Охарактеризовать морфолого-культуральные свойства исследуемых
штаммов L. acidophilus.
-
Изучить влияние экологических факторов (характер субстрата, аэробные и анаэробные условия, активная кислотность среды, молочная кислота) на рост и антагонистическую активность штаммов L. acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli в условиях in vitro.
-
Определить желчеустойчивость исследуемых штаммов L. acidophilus.
-
Оценить биосовместимость штаммов L. acidophilus между собой и со штаммами Propionibacterium freudenreichii.
5. Выявить жизнеспособность штаммов L. acidophilus и штаммов
P. freudenreichii в различных экологических условиях (выращивание на разных
средах, совместное и раздельное культивирование).
6. Разработать пробиотическую закваску и биотехнологию ацидофильного
пробиотического напитка на основе молочной подсырной сыворотки.
Научная новизна работы. Впервые дана комплексная эколого-биологическая характеристика штаммов L. acidophilus из сибирской коллекции микроорганизмов ГНУ СО РАСХН СибНИИ сыроделия. Выявлена зависимость роста и антагонистической активности исследуемых штаммов L. acidophilus от характера субстрата, аэробных и анаэробных условий, активной кислотности среды и наличия молочной кислоты. Для получения количественной оценки антагонистических взаимоотношений L. acidophilus и Е. coli нами модифицированы 2 метода - метод капель и метод культивирования на жидкой среде Кесслера. Проведена оценка биосовместимости штаммов L. acidophilus между собой и с P. freudenreichii. С учетом результатов исследования отобраны штаммы L. acidophilus и P. freudenreichii, перспективные для приготовления пробиотической закваски. Разработана биотехнология и рецептура пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки с применением пробиотической закваски.
Положения, выносимые на защиту:
-
Антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к тест-штаммам Е. coli зависит от аэробных и анаэробных условий, активной кислотности среды, наличия молочной кислоты и не зависит от характера субстрата.
-
Жизнеспособность штамма L. acidophilus СКМ-500 не изменяется при раздельном и совместном культивировании с P. freudenreichii, а при использовании разных сред численность сохраняется на высоком уровне (не менее106КОЕ/мл).
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволили выявить, что антагонистическая активность коллекционных штаммов L. acidophilus является индивидуальным, штаммоспецифическим признаком, а степень проявления этого признака зависит от экологических условий.
Результаты исследования могут быть использованы предприятиями молочной промышленности для мониторинга качества бактериальных заквасок и препаратов, обеспечения экологической безопасности продуктов питания, научно-исследовательскими организациями микробиологического профиля для селекции коллекционных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий. Модифицированные нами методы позволяют количественно оценить антагонистическую активность штаммов ацидофильной палочки и могут быть внедрены в практику микробиологических лабораторий и лабораторий по оценке качества пищевой продукции. На основе полученных результатов разработана про биотическая закваска и утверждена нормативно-техническая документация на производство пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки «Алтайское лето» ТУ 9222-056-00419710-10.
Результаты исследования используются при проведении занятий по Экологии микроорганизмов, Микробиологии, Прикладной биотехнологии, Прикладной экологии со студентами биологического факультета Алтайского государственного университета.
Апробация работы. Результаты работы апробированы на научных конференциях различного уровня: научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал ученых России» (Барнаул, 2009); XI городской научно-практической конференции «МОЛОДЕЖЬ-БАРНАУЛУ» (Барнаул, 2009); Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); 4-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с Международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2011); Всероссийской выставке «РосБиоТех» (Москва, 2010); Слете молодых сыроделов (Барнаул, 2011); Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011) и др.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 из них - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, библиографического списка и приложения. Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 35 таблицами. Основной текст изложен на 144 страницах машинописного текста. Библиографический список включает 173 наименований работ, в том числе 85 - зарубежных авторов.
Личный вклад автора. Автором определены цель и задачи исследования, спланированы и выполнены лабораторные эксперименты на всех этапах исследования, лично выполнена обработка и обсуждение полученных результатов.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту, к.б.н. Я.Р. Кагану за мудрые советы, терпение и понимание, за помощь в планировании экспериментов. Автор работы признателен своему
научному руководителю, д.б.н., проф. Г.Г. Соколовой за ценные замечания и консультационную помощь в написании работы.
