Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 26
1.1. Особенности эпидемиологической ситуации и характеристика возбудителя на современном этапе развития VII пандемии холеры 26
1.2. Антибиотикорезистентность возбудителя холеры 30
1.3. Экспериментальные подходы к совершенствованию профилактики и этиотропной терапии холеры 34
1.4. Пробиотики, эубиотики (пробиотические микроорганизмы): характеристика, таксономия, классификация 39
1.5. Характеристика биологических свойств пробиотиков 44
1.5.1. Антагонистическая активность: кислотообразование, продукция бактериоцинов, перекиси водорода и другие механизмы реализации 45
1.5.2. Антибиотикорезистентность пробиотических бактерий . 50
1.5.3. Адгезивная активность 52
1.6. Требования к отбору и характеристике предлагаемых производственных штаммов пробиотических микроорганизмов 55
1.7. Классификация препаратов-пробиотиков 57
1.8. Формы применения препаратов-пробиотиков 60
1.9. Прикладные аспекты использования пробиотических микроорганизмов 61
1.9.1. Применение пробиотиков при острых кишечных инфекциях . 63
1.9.2. Применение пробиотиков при дисбактериозах и дисбиозах различного генеза 65
1.10. Перспективы использования пробиотических микроорганизмов при особо опасных мнфекциях 67
ГЛАВА 2. Материалы и методы . 69
2.1. Музейные штаммы штаммы пробиотических бактерий . 69
2.2. Препараты-пробиотики . 70
2.3. Штаммы холерных вибрионов, холерный бактериофаг . 70
2.4. Бактериальные штаммы других родов и видов микроорганизмов 77
2.5.1. Питательные среды для выделения, культивирования, изучения биологических свойств и хранения пробиотиче-ских бактерий 77
2.5.2. Питательные среды для выделения, культивирования и изучения биологических свойств холерных вибрионов 79
2.5.3. Питательные среды для культивирования энтеропатогенных и условно-патогенных бактерий . 80
2.5.4. Питательные среды для определения контаминации пробиотиков посторонней микрофлорой 80
2.6. Методы выделения и идентификации культур, состав ляющих основы пробиотических препаратов . 80
2.7. Методы изучения биологических свойств пробиотиков 82
2.7.1. Изучение антагонистической активности пробиотиков по отношению к холерным вибрионам 82
2.7.2. Изучение адгезивной активности пробиотических бактерий 83
2.7.3. Определение активности кислотообразования пробиотических бактерий 83
2.8. Методы выделения, идентификации и определения фено-
и генотипических характеристик штаммов холерных вибрионов 84
2.9. Экспериментальные модели холеры, использованные при разработке критериев отбора штаммов пробиотических бактерий 85
2.9.1. Модель кроликов-сосунков . 85
2.9.2. Модель изолированных петель кишечника взрослых кроликов . 85
2.10. Методы изучения биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, отобранного в качестве основы для лабораторно-экспериментальной разработки нового пробиотика «Лактоацид-Р» 87
2.10.1. Изучение фено- и генотипических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 87
2.10.2. Секвенирование ДНК штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 89
2.10.3. Определение лизоцимной активности и продукция перекиси водорода . 90
2.10.4. Изучение чувствительности/устойчивости к антибак териальным препаратам, применяемым для экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры 90
2.10.5. Методика определения антагонистической активности по отношению к энтеропатогенным и условно-патогенным микроорганизмам 90
2.10.6. Изучение устойчивости к желчи, кислой, щелочной среде, NaCl, определение способности к синтезу экзополисахаридов 90
2.10.7. Изучение активации плазминогена клетками штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 91
2.10.8. Определение вирулентности, токсигенности, «острой» и «хронической» токсичности и безвредности штам- 91 ма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д .
2.10.9. Методика изучения возможности приживления штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д в кишечнике белых мышей на фоне антибиотикотерапии 91
2.10.10. Методика изучения влияния приобретенной рифам-
пицинрезистентности на стабильность биологической ак
тивности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д in vivo 92
2.11. Методы определения контаминации посторонней микрофлорой лабораторно-экспериментальных серий нового про-биотика «Лактоацид-Р» на основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 93
2.12. Методы контроля качества кисломолочного пробиоти-ка «Лактоацид-Р в соответствии с требованиями к пищевым продуктам 93
2.13. Изучение эффективности применения пробиотика «Лак-
тоацид-Р» на экспериментальных моделях холерной инфекции 93
2.14. Статистическая обработка результатов исследования 94
ГЛАВА 3. Выбор препаратов пробиотиков и выделение чистых культур производственных штаммов пробиотических бактерий 95
3.1. Обоснование выбора препаратов-пробиотиков и выделение чистых культур производственных штаммов пробиотических бактерий 95
3.2. Изучение штамма ацидофильной производственной за кваски на популяционном уровне. Получение авторского штамма Lactobacillus acidophilus ВКМ В-2020 Д и обоснова
ние его использования в работе 98
ГЛАВА 4. Комплексное изучение in vitro штаммов пробиотических микроорганизмов по параметрам биологической активности по отношению к vibrio cholerae 103
4.1. Изучение антагонистической активности пробиотиков по отношению к холерным вибрионам О1, О139 и неО1/неО139 серогрупп in vitro . 103
4.2. Изучение адгезивности пробиотических бактерий 125
4.3. Изучение активности кислотообразования 133
ГЛАВА 5. Разработка критериев отбора штаммов про-биотических бактерий, обладающих активностью по отношению К V.Cholerae 136
5.1. Анализ биологической активности штаммов пробиотиков по сочетанию результатов комплексного изучения in vitro.
Разработка критериев отбора пробиотических бактерий, в том числе на экспериментальных моделях холеры 136
5.2. Способ комплексной оценки активности штаммов пробиотических бактерий по отношению к V.cholerae 146
ГЛАВА 6. Изучение биологических свойств штамма l. acidophilus bkm b-2020 д как основы для разработки нового экспериментального пробиотика 150
6.1. Фенотипическая характеристика штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 151
6.2. Генотипическая характеристика штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 155
6.2.1. Изучение штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д методом ПЦР с набором универсальных праймеров 155
6.2.2. Изучение нуклеотидного состава ДНК штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 156
6.2.3. Гибридизация тотальной ДНК штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 157
6.2.4. Идентификация штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по последовательности гена 16S-рРНК 157
6.2.5. Исследование штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д на наличие плазмид 158
6.3. Антибиотикоустойчивость и чувствительность штамма
L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к антибактериальным препаратам, применяемых для экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры 160
6.4. Изучение антагонистической активности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к расширенному диапазону штаммов холерных вибрионов, энтеропатогенных и условно-патогенных бактерий 162
6.4.1. Антагонизм штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к холерным вибрионам, выделенным во время эпидосложне-ний по холере на территории Российской Федерации (1994-2005 гг.) 162
6.4.2. Изучение антагонизма штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к холерным вибрионам О1 серогруп-пы, выделенным при мониторинге объектов окружающей среды 164
6.4.3. Определение антагонистической активности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к холерным вибрионам неО1/неО139 серогрупп, вызвавших диарейные заболевания у людей на территории Ростовской области 166
6.4.4. Изучение антагонизма штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к токсигенным штаммам V.cholerae El Tor, завезенным на территорию Российской Федерации (1998-2012 гг.) . 167
6.4.5. Антагонистическая активность штамма L.acidophilus BKM-2020 Д в отношении ЭПМ и УПМ 169
6.5. Определение устойчивости штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к кислой и щелочной реакции среды, желчи и NaCl 170
6.6. Изучение способности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020
Д к синтезу экзополисахаридов 172
6.7. Система активатор плазминоген/плазмин у штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 174
6.8. Определение вирулентности, токсигенности, токсичности, безвредности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д . 177
6.9. Определение «острой» и «хронической» токсичности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д . 177
6.10. Экспериментальное изучение биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 179
6.10.1. Изучение возможности приживления штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д в кишечнике белых мышей на фоне антибиотикотерапии 179
6.10.2. Изучение влияния приобретенной устойчивости к рифампицину на стабильность биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д . 181
ГЛАВА 7. Разработка лабораторных серий нового пробиотика «лактоацид-р» для применения на моделях холерной инфекции 184
7.1. Разработка методики получения лабораторно-экспериментальных серий пробиотика «Лактоацид-Р сухой», контроль качества и характеристика препарата . 184
7.2. Методика изготовления в кисломолочном виде и контроль качества лабораторно-экспериментальных серий «Лактоацид-Р» 190
7.2.1. Разработка модифицированной методики приготов-ления лабораторных серий пробиотиков в кисломолочном виде 191
7.2.2. Характеристика и контроль экспериментального пробиотика «Лактоацид-Р» по требованиям к кисломолочным пищевым продуктам 197
ГЛАВА 8. Оценка активности применения пробиотика «лактоацид-р» при экспериментальной холере 201
8.1. Оценка эффективности применения пробиотика «Лактоацид-Р» при экспериментальной холерной инфекции на модели «опечатанных» взрослых мышей 201
8.2. Оценка эффективности сочетанного использования антибиотиков и лиофилизированного пробиотика при экспериментальной холерной инфекции на модели белых мышей 204
8.3. Модель кроликов-сосунков 207
8.4. Изучение эффективности сочетанного использования пробиотика «Лактоацид-Р» и холерного бактериофага К-1 при лечении экспериментальной холеры 211
8.5. Применение кисломолочного ацидофильного пищевого продукта на основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д для коррекции дисбиотических состояний 216
Заключение 220
Выводы 240
Список использованной литературы
- Экспериментальные подходы к совершенствованию профилактики и этиотропной терапии холеры
- Бактериальные штаммы других родов и видов микроорганизмов
- Изучение адгезивной активности пробиотических бактерий
- Изучение адгезивности пробиотических бактерий
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная неблагополучная эпидемиологическая обстановка по холере в мире и реальная угроза завоза инфекции на территорию Российской Федерации обусловливают неблагоприятный прогноз по этому высоко контагиозному заболеванию [Онищенко Г.Г. с соавт., 2007; Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., 2010; Назаретян А.А., Москвитина Э.А., 2013]. Ведущая роль в этиологии холеры принадлежит генетически измененным токсигенным штаммам Vibrio cholerae El Tor, однако не утрачивает своего значения V.cholerae О139. Нельзя исключать из числа возбудителей и V.cholerae classical [Смирнова Н.Н. с соавт., 2008, 2014; Alam M. et al., 2012; Hasan N.A. et al., 2012; Yu L. et al., 2012]. Заболеваемость диарейными инфекциями, вызванная холерными вибрионами, может быть связана с атоксигенными штаммами V.cholerae El Tor [Ерошенко Г.А. с соавт., 2008; Монахова Е.В., 2012, 2013] и с V.cholerae nonО1/nonО139 [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001, 2006; Авдеева Е.П. с соавт., 2006].
Существует серьезная проблема, обусловленная формированием и циркуляцией штаммов V.cholerae с множественной антибиотикорезистентностью, что осложняет использование регламентированных антибактериальных препаратов при профилактике и лечении этой инфекции [Рыжко И.В. с соавт., 2005; Дудина Н.А., 2007; Селянская Н.А. с соавт., 2012; Ghosh A., Ramamurthy T., 2011 и др.]. По данным ВОЗ, «массовая химиопрофилактика» относится к неэффективным мерам борьбы с холерой в связи с возможностью формирования носительства, дисбиозов и дисбактериозов, а вопрос адекватности экстренной профилактики в очаге холеры продолжает оставаться предметом дискуссии [Савельев В.Н. с соавт., 2005; Онищенко Г.Г. с соавт., 1995, 2006]. Вышесказанное свидетельствует об актуальности проведения исследований, направленных на совершенствование схем экстренной профилактики и этиотропной терапии при холере. В связи с этим приобретают интерес разноплановые экспериментальные работы, ориентированные на поиск неантибиотических потенциальных лечебно-профилактических биологических средств (бактериофагов, бактериоцинов, пептидов животного и растительного происхождения, «антипатогенных» лекарственных препаратов и др.) [Вахитов Т.Я. с соавт., 2006; Андрусенко И.Т. с соавт., 2009; Jaiswal A. et al., 2013].
С нашей точки зрения, целесообразным является изучение биологической активности штаммов пробиотических микроорганизмов, или пробиотиков (синоним – эубиотиков [Ардатская М.Д., 2008]) по отношению к V.cholerae. К пробиотикам относятся бактерии облигатной микрофлоры, сахаромицеты и апатогенные спорообразующие микроорганизмы, которые в различных сочетаниях могут входить в состав лекарственных препаратов, БАДов (биологически активных добавок), продуктов функционального питания и др. [Ливзан М.А., Костенко М.Б., 2008; Горелов А.В. с соавт., 2011; Dinleyici E.C. et al., 2012 и др.]. В отличие от пищевых продуктов и БАДов, для лечебных препаратов используются только те штаммы, терапевтическая эффективность которых доказана [Бондаренко В.М., Лиходед В.Т., 2008; Шульпекова Ю.О., 2012]. Пробиотические микроорганизмы повышают колонизационную резистентность (КР) слизистой кишечника, проявляют антагонизм по отношению к энтеропатогенным (ЭПМ) и условно-патогенным микроорганизмам (УПМ). Встречаются штаммы, обладающие антибиотикорезистентностью [Алешкин А.В. с соавт., 2009; Савченко Т.Н., 2011; Петраков Е.С., 2010; . et al., 2008; Kleerebezem M. et al., 2010 и др.]. В последнее время изучается эффективность аутопробиотикотерапии при экспериментальном дисбактериозе [Чичерин И.Ю. с соавт., 2013]. Вместе с тем, основными показаниями к применению пробиотических препаратов продолжают оставаться острые кишечные инфекции (ОКИ), а также дисбиозы различного генеза [Горелов А.В. с соавт., 2011; Воронин А.В. с соавт., 2013; Rohde C.L. et al., 2009; Grandy G. et al., 2010 и др.]. Пробиотики назначаются до, после или на фоне проведения курса этиотропной терапии, не исключая вариант «пробиотики без антибиотиков» [Терновская Л.Н. с соавт., 2005; Учайкин В.Ф. с соавт., 2012].
В течение последних лет в экспериментальных работах рассматривается возможность применения пробиотических бактерий и их метаболитов в комплексе с антибактериальными препаратами при лечении особо опасных инфекций (ООИ) бактериальной этиологии (чума, сибирская язва, туляремия) [Воробейчиков Е.В.с соавт., 2006; Добрынин В.М. с соавт., 2009; Шапошникова М.Ю. с соавт., 2009]. Данные литературы по этой проблеме в отношении холеры отсутствуют. Более того, сведения по действию пробиотиков на холерный вибрион носят лишь фрагментарный характер. В частности, показана профилактическая активность живой культуры аэрококков на экспериментальной модели холерной инфекции [Божко Н.В., 1992]. В некоторых исследованиях in vitro продемонстрированы: ингибирующее действие на холерный токсин (ХТ) культуры дрожжевого грибка Saccharomyces boulardii [McFarland L.V., Bernasconi I.P., 1997]; антагонистическая активность энтерококков и лактобактерий по отношению к ограниченному числу штаммов холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп и некоторых других представителей рода Vibrio [Simonetta A.C. et al., 1997; Tеtsuro K. et al., 1998]; подавление роста возбудителя холеры субстанциями, вырабатываемыми лактобактериями, входящими в состав фекальной микробиоты человека [Silva S.H. et al., 2001].
Таким образом, до начала наших исследований отсутствовало систематизированное представление по воздействию пробиотических микроорганизмов на холерный вибрион. Так, не изучена антагонистическая активность пробиотиков различной родовой и видовой принадлежности по отношению к V.cholerae. Не проведено сравнительное изучение антагонизма пробиотиков против штаммов в пределах вида V.cholerae. Не разработаны критерии целенаправленного отбора штаммов пробиотических микроорганизмов – антагонистов холерных вибрионов, как производственных, так и предлагаемых в качестве основ для разработки новых препаратов. Не решена проблема научно-экспериментального обоснования возможности и перспективности применения штаммов пробиотических микроорганизмов на моделях холерной инфекции, в том числе для предупреждения постинфекционных осложнений. Это определило актуальность и целесообразность проведения настоящего исследования.
Цель работы. Комплексное изучение биологической активности пробиотических микроорганизмов по отношению к Vibrio cholerae in vitro и на экспериментальных моделях холеры; отбор и характеристика антибиотикоустойчивого штамма – антагониста холерных вибрионов как основы разработки нового пробиотика.
Основные задачи исследования:
-
Отбор штаммов пробиотических микроорганизмов различной родовой и видовой принадлежности, как составляющих основу распространенных коммерческих препаратов, так и не являющихся производственными. Получение селекционным путем из производственной закваски «Симбиоз ацидофильных палочек. ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР» нового антибиотикорезистентного штамма лактобацилл – антагониста холерных вибрионов.
-
Фено- и генотипическая характеристика штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории России от больных и из объектов окружающей среды; подбор различных по происхождению, токсигенности и серологической принадлежности штаммов для использования при тестировании пробиотических микроорганизмов по параметру антагонизма к V.cholerae.
-
Сравнительное изучение испытуемых штаммов пробиотиков по антагонизму в отношении холерных вибрионов, адгезивности и кислотообразующей активности in vitro.
-
Разработка критериев отбора штаммов пробиотических бактерий, обладающих биологической активностью по отношению к холерным вибрионам in vitro и in vivo, и на основе этих критериев – способа комплексной оценки противохолерной активности пробиотиков in vitro. Отбор пробиотического штамма с оптимальным сочетанием параметров биологической активности.
-
Фено- и генотипическая характеристика отобранного пробиотического штамма, включая полногеномное секвенирование. Изучение его биологических свойств в соответствии с современными требованиями к штаммам, предлагаемых для разработки новых препаратов пробиотиков.
-
Лабораторно-экспериментальное изучение отобранного штамма пробиотика в расширенном диапазоне биологических свойств: антагонизма по отношению к штаммам V.cholerae, вызвавших эпидосложнения на территории России в последние десятилетия, и приживляемости в кишечнике лабораторных животных на фоне антибиотикотерапии.
-
Разработка на основе отобранного штамма лабораторно-экспериментальных серий нового пробиотика в лиофилизированном и кисломолочном виде.
-
Оценка эффективности разработанного пробиотика при различных схемах его использования на экспериментальных моделях холеры, в том числе в сочетании с антибиотиками и с холерным бактериофагом, а также при дисбиозах.
Научная новизна и теоретическая значимость. Из производственной закваски (ПЭЗ ВНИИМ МММП СССР), разрешенной к использованию в пищевой промышленности, селекционным путем получен полиантибиотикорезистентный штамм Lactobacillus acidophilus ВКМ В-2020 Д, обладающий антагонистической активностью в отношении холерных вибрионов, возбудителей других ОКИ и УПМ, превосходящий по биологическим параметрам все испытуемые штаммы пробиотиков. Приоритет подтвержден патентом на изобретение № 2063436 от 10.07.96 г. «Штамм Lactobacillus acidophilus – антибиотикорезистентный антагонист возбудителей кишечных инфекций».
Впервые проведен сравнительный анализ антагонистической активности пробиотических бактерий – представителей различных родов и видов по отношению к холерным вибрионам разных биоваров, серогрупп и токсигенности, выделенных от людей, из водных объектов окружающей среды и охарактеризованных по фено- и генотипическим свойствам.
Впервые на основании комплексной оценки антагонистической активности по отношению к V.cholerae О1, О139, nonO1/nonO139 различного происхождения и эпидемической опасности, а также адгезивности и кислотообразующей активности пробиотиков разработаны и научно обоснованы критерии отбора наиболее перспективных штаммов пробиотических бактерий. Приоритет подтвержден патентом на изобретение № 2487943 от 20.07.13 г. «Способ оценки биологической активности лактобацилл и бифидобактерий относительно холерных вибрионов in vitro». Получены данные по сравнительной характеристике биологической активности по отношению к V.cholerae штаммов пробиотических микроорганизмов, входящих в состав коммерческих пробиотиков или предлагаемых для производственного использования.
Показаны способность штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к приживлению в кишечнике лабораторных животных с сохранением жизнеспособности лактобактерий на фоне воздействия терапевтических доз антибиотиков, к которым данный штамм устойчив. Показано отсутствие влияния дополнительно наведенной устойчивости к рифампицину на стабильность биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д.
Впервые в модельных опытах доказана эффективность использования нового пробиотика «Лактоацид-Р» на основе антибиотикорезистентного штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д при экспериментальной холере в целях профилактики и на фоне лечения инфекции антимикробными препаратами, к которым устойчив пробиотик, но чувствителен возбудитель, а также в сочетании с холерным бактериофагом. Установлено, что лабораторно-экспериментальные серии препарата «Лактоацид-Р» предотвращают постинфекционные осложнения (вибриононосительство и нарушения микробиоценоза кишечника лабораторных животных).
Инновационная составляющая проведенных исследований состоит в научном обосновании возможности и эффективности применения пробиотических бактерий, отобранных с использованием способа комплексной оценки биологической активности пробиотиков по отношению к V.cholerae, в качестве дополнительных средств экстренной профилактики, лечения на фоне этиотропной и фаготерапии, а также коррекции дисбиотических состояний при экспериментальной холере. Впервые научно и экспериментально обоснована целесообразность и перспективность проведения дальнейших нормативно регламентированных испытаний коммерческих и вновь разрабатываемых препаратов (на основе штаммов пробиотических бактерий – антагонистов V.cholerae) с целью расширения спектра противохолерных средств.
Практическая значимость работы. Штамм с исходным наименованием L.acidophilus Р-1, полученный нами из «Симбиоза ацидофильных палочек» производственной закваски (ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР) путем селекции на популяционном уровне по признаку антагонизма к V.cholerae, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской академии наук (ИБФМ РАН) под номером ВКМ В-2020 Д. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате полногеномного секвенирования ДНК L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, депонированы в международных базах данных DDBJ/EMBL/GenBank под общим номером доступа JHUG00000000 (номер в подразделе геномных проектов BioProject: PRJNA243251; номер организма в подразделе BioSample: SAMN02713604) и дополняются по мере обработки данных. Показана 100% идентичность гена 16S-рРНК таковому штамма L.acidophilus PKSP (KF548315.1). Штамм был использован в научно-исследовательской работе специалистами Ростовского-на-Дону государственного медицинского университета (РостГМУ) (акт внедрения от 12.03.09).
На основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д с использованием модифицированных нами методик разработан новый экспериментальный пробиотик «Лактоацид-Р», на который оформлена научно-техническая документация: «Инструкция по изготовлению и контролю препарата «Лактоацид-Р сухой» и «Отчет о лабораторно-экспериментальном испытании нового медицинского бактериального препарата «Лактоацида-Р», одобренная Ученым советом РостНИПЧИ и утвержденная директором института (протокол № 8 от 10.11.05).
Усовершенствована методика приготовления препаратов пробиотиков (эубиотиков) в кисломолочном виде, что даёт возможность многократного стандартного воспроизводства циклов приготовления, гарантирует качественные и количественные характеристики в соответствии с требованиями к пищевым кисломолочным продуктам и увеличивает срок годности готовых пробиотиков до 21 сут. Разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и применению препаратов-эубиотиков в кисломолочном виде в лечебно-профилактической практике», которые одобрены Ученым советом РостНИПЧИ и утверждены директором (протокол № 5 от 09.10.07). Методические рекомендации были апробированы в научно-исследовательской и практической работе с коммерческими препаратами, назначаемыми в лечебно-профилактических целях сотрудниками РостГМУ (акт внедрения от 12.03.09) и специалистами ФБУН «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» (ФБУН РостовНИИМП, акт внедрения от 11.02.13).
Разработаны, одобрены Ученым советом ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора и утверждены директором «Методические рекомендации по оценке противохолерной активности пробиотиков» (протокол № 2 от 27.03.12). Материалы были использованы в научно-исследовательской работе сотрудниками ФБУН РостовНИИМП (акт внедрения от 12.02.13), а также специалистами лаборатории холеры ФКУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» (акт внедрения от 22.02.13).
Методические подходы к выделению, фено- и генотипической характеристике штаммов холерных вибрионов вошли в состав МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 31.05.07, МУК 4.2.2870-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровня», утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 25.05.12, и практического руководства «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (под редакцией акад. РАМН Г.Г. Онищенко и акад. РАМН В.В. Кутырева. М.: ЗАО «Шико», 2013).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Селекционным путем по параметру антагонистической активности по отношению к V.cholerae получен новый антибиотикоустойчивый штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д с наведенной дополнительной резистентностью к рифампицину. Экспериментально доказано, что по фено- и генотипической характеристикам штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д соответствует современным требованиям к отбору, проверке и хранению штаммов, предлагаемых в качестве производственных.
-
Использование модифицированной нами методики отсроченного антагонизма позволило впервые установить, что штаммы пробиотических микроорганизмов разной родовой и видовой принадлежности обладают антагонистической активностью по отношению к штаммам вида V.cholerae с различными фено- и генотипическими характеристиками, в том числе к эпидемически опасным. Наиболее сильными антагонистами являются представителями родов Lactobacillus и Bifidobacterium и вида L.acidophilus.
-
Впервые определены критерии отбора штаммов пробиотических бактерий, обладающих противохолерной активностью: антагонистическая активность по отношению к V.cholerae – высокая или средняя; адгезивность – только средняя; кислотообразующая активность – высокая или средняя.
-
На основе установленных критериев разработан способ оценки биологической активности лактобацилл и бифидобактерий по отношению к холерным вибрионам. Способ позволяет целенаправленно выявлять наиболее активные пробиотики против V.cholerae среди известных производственных штаммов, а также осуществлять поиск штаммов, перспективных для использования при разработке новых препаратов. Доказано, что штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по сочетанию биологических свойств обладает преимуществом перед производственными.
-
На основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д – антагониста холерных вибрионов и с использованием модифицированных нами методик разработан новый экспериментальный пробиотик «Лактоацид-Р» в лиофилизированном и кисломолочном виде, который соответствует предъявляемым требованиям системы предрегистрационного, доклинического изучения безопасности пробиотиков.
-
Впервые доказано, что использование лабораторно-экспериментальных серий пробиотика «Лактоацид-Р» повышает эффективность профилактики и лечения экспериментальной холеры, в том числе на фоне антибактериальной терапии или в сочетании с холерным бактериофагом. При этом предотвращаются постинфекционные осложнения, связанные с вибрионосительством, и оптимизируется микробиоценоз кишечника лабораторных животных.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 1990); Всероссийской научно-практической конференция «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 1996); юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МОРФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); юбилейной конференции Северо-Кавказского отделения Российского общества патофизиологов «Механизмы некоторых патологических процессов в эксперименте и клинике» (Ростов-на-Дону, 1999); юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Екатеринбург, 1999); юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 2000); международном конгрессе «Ninth International Congress for Culture Collections» (Brisbane, Australia, 2000); юбилейной научной конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); второй межгосударственной научно-практической конференции по взаимодействию государств-участников СНГ в области санитарной охраны территории (Алматы, 2001); международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009); XV, XVII, XIX Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2009, 2011, 2013); на заседаниях проблемной комиссии научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2000, 2002, 2003, 2005-2011).
Исследования выполнены в рамках пяти плановых научных тем: «Изучение нового штамма лактобацилл для возможного использования при кишечных инфекциях» (№ 022-4-93, инициативный план); «Использование лактобацилл в лечении и профилактике холеры на экспериментальных моделях» (№ ГР 01 950 003709); «Новый бактерийный препарат для лечения и профилактики диарейных заболеваний» (№ ГР 01.9.70 009318); «Оценка биотерапевтического препарата (эубиотика) «Лактоацид-Р» в доклинических испытаниях» (№ ГР 01.20.03 11549), «Пробиотики: комплексная оценка сравнительной эффективности противохолерного действия» (№ ГР 0120.0 800417), в которых автор являлся руководителем или соруководителем.
Публикация результатов исследования. Материалы исследований отражены в 42 опубликованных работах, из них 17 – в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.
Структура диссертации. Диссертация построена по традиционному плану, изложена на 284 страницах, состоит из введения, одной главы обзора литературы, семи глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов, иллюстрирована 42 таблицами и 22 рисунками. Библиография содержит ссылки на 410 публикаций (240 отечественных и 170 зарубежных).
Экспериментальные подходы к совершенствованию профилактики и этиотропной терапии холеры
В этой связи продолжает оставаться актуальным вопрос совершенствования экстренной профилактики, этиотропной терапии холеры и предотвращения последствий перенесенной инфекции: вибриононосительства и нарушений микробиоценоза кишечника [Кокушкин А.М. с соавт., 2002; Савельев В.Н. с соавт., 2005; Онищенко Г.Г. с соавт., 2007; Арутюнов Ю.И., 2009]. Следовательно, экспериментальные исследования, ориентированные на поиск неантибиотических потенциальных лечебно-профилактических биологических средств (бактериофагов, бактериоцинов, пептидов животного и растительного происхождения, «антипатогенных» лекарственных препаратов и др.), обладающих антагонистической активностью по отношению к возбудителю холеры, приобретают несомненный научно-практический интерес [Вахитов Т.Я. с со-авт., 2006; Андрусенко И.Т. с соавт., 2009; Sharma A., Patel V. K., 2009; Kitaoka M. et al., 2011; Jaiswal A. et al., 2013].
В этом аспекте, с нашей точки зрения, целесообразным является изучение биологической активности штаммов пробиотических микроорганизмов (или пробиотиков) по отношению к V.cholerae.
Термин «пробиотики» признан во всем мире. Его синоним – термин «эубиотики», который в основном используется в России. Оба термина правомерно употреблять для обозначения как микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов, так и самих препаратов, содержащих живые микроорганизмы [Ардатская М.Д., 2008; Горелов А.В. с соавт., 2011 и др.]. По определению экспертов ВОЗ [FAO/WHO Expert Consultation, 2002], пробиотики – это живые организмы, которые при назначении в адекватном количестве способствуют улучшению здоровья. В отличие от пищевых продуктов и БАДов, для лечебных препаратов используются только те штаммы, для которых доказана терапевтическая эффективность в экспериментальных, доклинических и клинических исследованиях [Коршунов В.М с соавт., 2000; Бондаренко В.М., Лиходед В.Т., 2008; Шульпекова Ю.О., 2012].
Согласно современным представлениям, к пробиотическим микроорганизмам относят живые бактерии облигатной микрофлоры, сахаромицеты и са-профиты окружающей среды – апатогенные спорообразующие микроорганизмы, которые в различных сочетаниях входят в состав бактерийных препаратов [Лив-зан М.А., Костенко М.Б., 2008; Шапошникова М.Ю. с соавт., 2009; Савченко Т.Н., 2011; Verna E.C., Lucak S., 2010; Dinleyici E.C. et al., 2012; Zihler A. et al., 2013]. Данные препараты могут быть классифицированы, соответственно, как лакто-, бифидо-, коли-, бациллосодержащие и др., а также как моно-, поликомпонентные и комбинированные [Ушкалова В.Ф., 2007; Шендеров Б.А., 2008; «Федеральное руководство по использованию лекарственных средств», 2011].
Биологический потенциал пробиотических бактерий способствует выполнению в организме человека защитной функции, повышая колонизационную резистентность (КР) слизистых оболочек и оптимизируя кишечный микробиоценоз [Белоусова Е.Л., 2006; Пилипенко В.И., 2008; Березняков В.И., 2011; Савченко Т.Н., 2011; Rolf R.D., 2000; Nagarjun P.A. et al., 2005].
Пробиотики проявляют антагонистическую активность по отношению к энтеропатогенным (ЭПМ) и условно-патогенным микроорганизмам (УПМ) [Баженов Л.Г с соавт. 2010; Черкашин А.В., Кузнецова Г.Г., 2010; Савченко Т.Н., 2011; Сухина М.А. с соавт., 2012; Zihler A. et al., 2011 и др.]. Механизм этой активности имеет комплексный характер, который связан с кислотообразованием, с продукцией перекиси водорода, летучих жирных кислот, внеклеточных субстанций (бактериоцины, бактериальные лектины), а также со способностью к адгезии на слизистой кишечника [Кравцов Э.Г., с соавт., 2008; Петраков Е.С. 2010; Kim Y. et al., 2008 и др.] и с оказанием влияния на ультраструктуру патогенов [Горелов А.В., Усенко Д.В., 2008; Шабанова Н.А. с соавт., 2009; Бухарин О.В., Сгиб-нев А.В., 2012; Лахтин М.В. с соавт., 2013; Schrezenmeir J., 2008; Kleerebezem M. et al., 2010; Zhao Q. et al., 2012]. Встречаются пробиотические штаммы, обладающие антибиотикорезистентностью [Алешкин А.В. с соавт., 2009; Moubareck C. et al., 2005 и др.]. Пробиотики устойчивы к кислой среде, к солям, желчи [Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г., 2009; Kim P.I. et al., 2007; Ryan K.A. et al., 2008]. Требования к штаммам, используемым в производстве пробиотиков, систематизированы в МУК 4.2.2602-10 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков».
Вместе с тем, в последнее время получены экспериментальные данные о низкой эффективности аутопробиотикотерапии при экспериментальном дис-бактериозе [Чичерин И.Ю. с соавт., 2013], и не все однозначно положительно в отношении использования препаратов на основе дрожжей и спорообра-зующих бактерий [Сорокулова И.Б. с соавт., 2004; Дармов И.В. с соавт., 2013]. Однако до настоящего времени основными показаниями к применению пробиотиков продолжают оставаться ОКИ, дисбиозы различного генеза, постинфекционные состояния [Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система), 2010]. Препараты назначают детям и взрослым при антибиотикоассоциированной диарее [Горелов А.В. с соавт., 2011; Rohde C.L. et al., 2009], шигеллезе, сальмонеллезе, эшерихиозе, ротавирусной инфекции, «диареи путешественников» и других ОКИ установленной и неустановленной этиологии [Утемурадова Г.Э., 2009; Воронин А.В. с соавт., 2013; Лазарев В.В. с соавт., 2013; Grandy G. et al., 2010; Sherman P.M., 2012]. С помощью пробиотиков проводится коррекция дисбиоти-ческих состояний [Гапон М.Н. с соавт., 2005; Парфенова А.И. с соавт., 2008; Корвякова Е.Р., Корвяков С.А., 2012; Kligler B. et al., 2007; Ramakrishna B.S., 2014 и др.]. Пробиотики назначаются до или после проведения курса этио-тропной терапии, а также в сочетании с антибактериальными препаратами, не исключая вариант «пробиотики без антибиотиков» [Терновская Л.Н. с со-авт., 2005; Гриневич В.Б. с соавт., 2006; Воробейчиков Е.В.с соавт., 2008; Учайкин В.Ф. с соавт., 2012; Abraham P., 2012]. До настоящего времени не описано ни одного случая бактериемии, ассоциированной с приемом пробио-15
Бактериальные штаммы других родов и видов микроорганизмов
В этой связи необходимо сделать акцент на то обстоятельство, что если до середины 80х годов прошлого столетия публикации об антибиотико-устойчивых вариантах возбудителя холеры встречались эпизодически [Ермольева З.В. с соавт., 1971; Finch M.J. et al., 1988], то уже к 90-м годам и далее по времени появились многочисленные сообщения о повсеместном распространении полиантибиотикорезистентных штаммов и о тенденции нарастания масштабов этого явления [Подосинникова Л.С., 2000; Рыжко И.В. с со-авт., 2000; Викторов Д.В. с соавт., 2006; Faruqe S.M. et al., 2006; Alam M. et al., 2012]. Множественную резистентность к антибиотикам (к стрептомицину, эритромицину, мономицину, рифампицину, гентамицину и др.) у штаммов холерных вибрионов О1, выделенных от людей и из водных объектов в Украине, описали А.Б. Хайтович с соавт. (1996, 1998, 2000).
В России, во время эпидемии холеры в Дагестане в 1994 году многие исследователи наблюдали выраженное снижение эффективности тетрациклина, доксициклина, левомицетина и фуразолидона [Ломов Ю.М. c соавт., 1994; Савельев В.Н. с соавт., 1994; Черепахина И.Я. с соавт., 1994; Онищенко Г.Г. с соавт., 1995]. Все штаммы V.cholerae El Tor, выделенные во время эпи-досложнения по холере в Казани (2001 г.) были резистентны к налидиксовой кислоте (МПК=64,0-128,0 мг/л). Кроме того, у них была установлена устойчивость к триметоприм/сульфаметаксазолу, стрептомицину, повышение значений МПК (в мг/л) левомицетина (4,0-8,0) и фуразолидона (16,0-64,0), а также чувствительность к фторхинолонам [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001; Рыжко И.В. с соавт., 2001, 2005].
Наличие множественной устойчивости холерных вибрионов О1, выделенных во время вспышки холеры в Каменском районе Ростовской области в 2005г., а также штамма V.cholerae El Tor, изолированного от больного (завоз из Таджикистана в Тверскую область), описали в своих работах Н.А. Дудина (2006) и Э.А. Москвитина с соавт. (2006) и др.
И.В. Рыжко с соавт. (2005) и Н.А. Дудина (2007), изучив 390 штаммов V.cholerae O1 и O139 серогрупп, выделенных от людей в период с 1927 по 2005 гг., показали резкое увеличение их числа с маркерами резистентности к антибактериальным препаратам, применяемым для экстренной профилактики и лечения холеры. Доказали индуцибельный характер трансмиссивной ан-тибиотикорезистентности у возбудителя холеры. Авторы представили данные о наличии у холерного вибриона генетической потенции к развитию устойчивости, а также о возможности существования разнообразных, в том числе и неизвестных, механизмов, обеспечивающих устойчивость у штаммов V.cholerae El Tor и О139 к антибиотикам. Отметили, что весьма важным обстоятельством является возникновение дисбактериозов как последствий интенсивного медикаментозного воздействия.
C. Chomvarin et al. (2012) установили наличие у клинических штаммов V.cholerae O1, выделенных во время вспышек холеры в 2007 и 2008 гг. на северо-востоке Таиланда, множественной антибиотикорезистентности к тетрациклину и ко-тримоксазолу, наряду с чувствительностью всех изолированных штаммов к норфлоксацину. Выявленные различия в антибиотикорези-стентности среди штаммов V.cholerae обусловили необходимость четкого обоснования применения определенных антимикробных препаратов в каждой конкретной ситуации. При анализе эпидемических вспышек холеры с умеренными показателями летальности в 2007, 2008 и 2010 гг. было установлено, что выделенные штаммы V.cholerae О1, циркулирующие в северовосточной Индии, относились к вариантам Эль Тор с геном ctxB классического типа и имели устойчивость к триметоприму и тетрациклину, что, по мнению авторов, требует пересмотра схем антибиотикотерапии при тяжелой форме холеры [Borkakoty B. et al., 2012].
Получив данные по устойчивости к антибиотикам V.cholerae О139, выделенных в Китае с 1993 по 2009 гг., L.Yu et al. (2012) заключили, что для разработки рациональных терапевтических схем, необходимо выявление профилей антибиотикорезистентности этих эпидемических штаммов.
Относительно холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп, выделенных от людей, было установлено, что указанные штаммы содержат маркеры резистентности к большому числу антибактериальных препаратов, что затрудняет выбор средств этиотропной терапии заболеваний, вызываемых этими возбудителями. Показана не только способность к индукции антибиоти-коустойчивости у штаммов холерного вибриона неО1/неО139 серогрупп, выделенных от людей, но и возможность ее самопереноса в штаммы Escherichia coli и в обратных кроссах V.cholerae El Tor. Установлено, что воздействие антибактериального препарата на фенотипически чувствительные штаммы может повышать экспрессию маркеров резистентности при наличии в геноме штамма участков, ответственных за их экспрессию. Необходим постоянный бактериологический контроль эффективности лечения с определением анти-биотикограмм выделенных культур и с проведением своевременной замены неэффективного препарата на эффективный [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001, Авдеева Е.П. с соавт., 2006; Селянская Н.А. с соавт., 2011, 2012]. S.M. Faruqe et al. (2006) также считают необходимым проведение мониторинга антибио-тикорезистентности эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов в связи с тем, что штаммы V.cholerae с множественной антибиотикоустойчиво-стью выделяются как от больных, так и из объектов окружающей среды. По данным K. Pande et al. (2012) и S.M. Marashi et al. (2012), в настоящее время в большинстве клинических штаммов V.cholerae из Азии широко распространен элемент SXT-С, участвующий в передаче устойчивости. По мнению исследователей, детекция SXT у штаммов V.cholerae О1 (в плане установления диссеминации антибиотикорезистентности) может способствовать рационализации лечения холерных больных.
Изучение адгезивной активности пробиотических бактерий
Первый этап настоящего исследования предусматривал подбор штаммов пробиотических микроорганизмов для проведения комплексного сравнительного изучения их биологической активности по отношению к V.cholerae in vitro.
При этом нами учитывалось, что современный спектр пробиотиков весьма широк и разнообразен. В производстве препаратов чаще всего используются микроорганизмы рода Lactobacillus и Bifidobacterium, реже – штаммы кишечной палочки, бактероидов, бацилл, сахаромицет и др. [Горелов А.В., Усенко Д. В., 2006; Reid G., 2008; Kligler B., Cohrssen A., 2008].
В связи с этим, мы посчитали необходимым дополнить предварительно отобранные музейные штаммы. В этом плане нас интересовали штаммы, составляющие основу современных и наиболее распространенных коммерческих пробиотиков, и штаммы, являющиеся перспективными в качестве производственных.
Следовательно, для расширения спектра подлежащих испытанию про-биотических бактерий нами первоначально был проведен отбор коммерческих пробиотиков и выделение пробиотических культур, составляющих основу этих препаратов. Кроме того, мы посчитали целесообразным обосновать возможность использования (в качестве испытуемого) авторского штамма L.acidophilus ВКМ В-2020, полученного селекционным путем в ходе данной работы.
Обоснование выбора препаратов-пробиотиков и выделение чистых культур производственных штаммов пробиотических бактерий При проведении отбора производственных штаммов, мы учитывали определяющие факторы, связанные с характеристикой пробиотических препаратов и с прикладными аспектами их применения. Основу препаратов со-95 ставляют живые апатогенные для человека пробиотические микроорганизмы, принадлежащие к различным родам и видам. При естественном пути введения пробиотики традиционно используются для подавления патогенной и УПМ, вызывающей ОКИ, а также для коррекции дисбиотических состояний у детей и взрослых [Корниенко Е.А., 2007; Шевелева М.А., Раменская Г.В., 2009; Boirivant M., Strober W., 2007; Salvatore S. et al., 2007]. Кроме того, наши исследования базировались на основных современных подходах к классификации пробиотиков [Ющук Н.Д., Бродов Л.Е., 2001; Мазанкова Л.Н. с соавт., 2005; Шендеров Б.А., 2008; Федеральное руководство по использованию лекарственных средств, 2010].
Исходя из вышесказанного, в ходе настоящего исследования были подобраны наиболее широко применяемые в практике здравоохранения и доступные моно-, поли- и комбинированные пробиотики (состав которых приводится согласно прилагаемым к препаратам аннотациям), охватывающие все современные классификационные категории, а именно: 1. лактосодержащие препараты – «Биобактон», в основе которого штамм L.acidophilus 12 б (I поколение), а также «Лактобактерин сухой» и «Кисломолочный лактобактерин», в состав которых входят штаммы L.fermentum 90C-4 и L.plantarum 8-RA-3 (III поколение); 2. бифидосодержащие препараты – «Бифиформ», содержащий штаммы B.longum ATCC 15707 и Enterococcus faecium SF68 (III поколение), а также «Бифидумбактерин форте», состоящий из культуры B.bifidum № 1, иммоби лизованной на сорбенте (IV поколение); 3. колисодержащий препарат «Колибактерин», содержащий штамм E.coli M-17 (I поколение); 4. пробиотики из родов бацилл и дрожжеподобных грибов сахаромицет – «Бактисубтил», в основе которого штамм B.cereus IP 5832 АТСС 14893; «Биоспорин», состоящий из культуры B.licheniformis; а также «Споробакте рин», содержащий штамм B.subtillus 534, и «Энтерол» на основе культуры Saccharomyces boulardii (II поколение). Расширение диапазона испытуемых штаммов пробиотических бактерий различных родов и видов достигали путем выделения чистых культур, составляющих основы подобранных препаратов.
Непосредственно в исследованиях по выделению чистых культур производственных штаммов были использованы следующие препараты: «Биобактон» («НИИ Комплексного использования молочного сырья», Россия), флаконы по 1 дозе, в 1дозе 2,0109 бактерий L.acidophilus 12б; «Лактобактерин сухой» (ФГУП «НПО «Микроген», Нижний Новгород, Россия), флаконы по 5 доз, в 1 дозе 2,0109 бактерий L.plantarum 8-PA-3 и L.fermentum 90T-C4 (возможны L.plantarum 38, L.fermentum 39); «Кисломолочный лактобактерин» (ООО «Диамед», Санкт-Петербург, Россия), во флаконах по 190 мл, в 1 мл – 1,0107 КОЕ L.plantarum 8-PA-3; «Бифидумбактерин форте» (НПО «Биомед им. Мечникова», г. Пермь, Россия), пакеты с порошком по 5 доз; в 1 дозе – 5107 бактерий B.bifidum № 1; «Колибактерин» (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, г. Пермь), флаконы по 5доз; в 1 дозе – 1,0109 бактерий E.coli М-17; «Бифиформ» («Ферросан Интернейшнл А/С», Дания), капсулы, в 1 капсуле 1107 бактерий B.longum АТСС 15707; Enterococcus faecium SF68; «Бактисубтил» («Marion Merrell S.A.», Франция), капсулы, в 1 капсуле 35 мг субстанции лиофильно высушенных спор В.cereus IP 5832; «Биоспорин» («Центр ВТ проблем БЗ НИИМ МО РФ», Россия), флаконы по 2 дозы, в 1 дозе – 1,0109 бактерий В.licheniformis; «Споробактерин жидкий» (ООО «Бакорен», г. Оренбург, Россия), флакон-капельница 10 мл, в 1 мл 1,0109 КОЕ В.subtilis 534; «Энтерол» («Biocodex» Франция), капсулы, в 1 капсуле 250 мг S.boulardii, во флаконе 10 капсул, в коробке 1 флакон. Все вышеуказанные препараты были закуплены в аптечной сети и имели действующие сроки годности. В результате проведенных исследований при использовании соответствующих рекомендуемых методик были выделены и идентифицированы до вида чистые культуры, составляющие основы указанных препаратов. Из препарата «Биобактон» был изолирован штамм L.acidophilus 12 б; из «Лактобак-терина сухого» – L.fermentum 90C-4; из «Кисломолочного лактобактерина» – L.plantarum 8-PA-3; из «Бифидумбактерина форте» – B.bifidum №1; из «Ко-либактерина» – E.coli М-17; из «Бифиформа» – E.faecium SF68; из «Бактисуб-тила» – B.cereus IP 5832; из «Биоспорина» – B.licheniformis; из «Споробакте-рина жидкого» – B.subtillus 534; из «Энтерола» – S.boulardii.
В итоге проведенного исследования к 30 имеющимся музейным штаммам были добавлены 10 штаммов, составляющих основу наиболее широко применяемых в практике здравоохранения препаратов-пробиотиков.
Изучение адгезивности пробиотических бактерий
Среди взятых в работу штаммов был и авторский штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д. Получение данного штамма и обоснование его использова ния связано с тем, что в результате проведенного нами в 1988 г. исследова ния in vitro было принципиально доказано наличие антагонизма у различных видов лактобацилл по отношению к холерным вибрионам О1 (44 тест штаммов) и неО1 (21 тест-штамм) серогрупп. Также была дана сравнитель ная оценка степени антагонистической активности этих микроорганизмов по отношению к V.cholerae на примере штаммов шести видов лактобацилл (L.acidophilus NCIB 4504; L.lactis ATСС 8000, L.casei subsp. casei NCDO 151, L.plantarum ATCC 10241, L.plantarum 8-PA-3, L.fermentum 90T-C4, L.acidophilus – производственный штамм). Наиболее выраженным антагонизмом обладал производственный штамм L.acidophilus, выделенный из разрешенной к использованию в пищевой промышленности закваски «Симбиоз ацидофильных палочек. ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР» (1988 г.). Данная производственная закваска была получена нами из лаборатории Ростовского-на-Дону молочного комбината [Богданова Т.Ф. с соавт., 1988]. В результате проведенных исследований было определено сильное антагонистическое действие вышеуказанного штамма на 55,0% взятых в исследование штаммов холерных вибрионов О1 и неО1/неО139, среднее – на 40,0%, а низкое – на 5,0%. Было показано, что механизм антагонистического действия штамма L.acidophilus имел комплексный характер, а кислотообра-зование являлось ведущим, но не единственным фактором антагонистического действия лактобацилл на вибрионы.
Полученные данные явились отправной точкой по проведению дальнейших исследований выделенного из ацидофильной закваски «Симбиоз ацидофильных палочек. ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР» штамма L.acidophilus на популяционном уровне с селекцией по активности кислотообразования и антагонизму по отношению к V.cholerae и другим ЭПМ с целью получения субкультуры с наиболее выраженной кислотообразующей и антагонистической активностью для перспективного изучения в качестве возможной основы экспериментальной разработки нового препарата-пробиотика.
Метод заключался в получении изолированных колоний лактобацилл, поколонийном (97 КОЕ – колониеобразующих единиц) отборе субкультур по морфологическим признакам, их накоплении, определении кислотообразующей функции, в проведении сравнительного анализа и определении наиболее сильного продуцента кислоты с выраженным антагонизмом по отношению к холерным вибрионам, сальмонеллам, шигеллам, энтеропатогенной кишечной палочки. Для этого из десятикратных разведений (от 10-1 до 10-5) закваски высевали по 0,1 мл материала на плотную питательную среду MРС-2. Посевы инкубировали в анаэробных условиях при 37о± 1оС в течение 44± 4 ч. По истечении указанного срока инкубации отбирали колонии размером не менее 1,3 мм, которые являлись каталазонегативными, а в мазках из этих колоний наблюдались грамположительные крупные палочки размером 1,1-1,5 7,0-8,0 мкм. После однократного пассажа отобранных субкультур на полужидкой 0,15% среде MРС и следующего за этим накопления культур на агаризованной среде MРС-2 определяли их кислотообразующую активность. Выраженность антагонистических свойств по отношению к тест-штаммам V.cholerae О1, nonO1/nonО139, Salmonella, Shigella и E.colі определяли методом отсроченного антагонизма (методом «лунок» с использованием щелочного и мясо-пептонного агара). В результате проведенного исследования был получен штамм, который по физиологическим и биохимическим свойствам был идентифицирован как принадлежащий к виду L.acidophilus и обладал выраженными ростовыми свойствами в аэробных условиях, кислотообразующей, а также антагонистической активностью по отношению V.cholerae О1, nonO1/nonО139 и ЭПМ. Штамм получил исходное наименование L.acidophilus Р-1 (табл. 7).
В процессе дальнейшей работы была реализована задача по изучению антагонистических свойств штамма L.acidophilus Р-1 в более широком диапазоне – по отношению к условно-патогенным микроорганизмам: к штаммам Staphylococcus, Proteus, Pseudomonas (табл. 8). Итоги проведенной работы позволили констатировать наличие антимикробного действия на УПМ и перейти к следующему этапу оценки биологической активности штамма – ан-тибиотикоустойчивости.
При изучении устойчивости штамма L.acidophilus Р-1 к антибактериальным препаратам, применяемым при этиотропной терапии холеры и других ОКИ, установлен следующий спектр хромосомной устойчивости (в мкг/мл): канамицин (500), полимиксин (4000), неомицин (100), невиграмон (2000), ципрофлоксацин (1). Учитывая тот факт, что рифампицин является эффективным препаратом при лечении холеры [Либинзон А.Е. с соавт., 1974; Хайтович А.Б. с соавт., 1996; Scrascia V. et al, 2003], методом одноступенчатого наведения устойчивости к рифампицину при посеве бактерий на плотную питательную среду МРС-1с концентрацией антибиотика 200 мкг/мл нами был получен спонтанный RifR мутант L.acidophilus Р-1 с уровнем рези 101 стентности МПК 250 мкг/мл. Частота образования спонтанных мутантов составляла 10-8 -10-9 .
Штамм L. acidophilus Р-1 был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Институт биохимии и физиологии микроорганизмов Российской академии наук (ИБФМ РАН) под номером ВКМ В-2020 Д и защищен патентом № 2063436 на изобретение «Штамм Lactobacillus acidophi-lus – антибиотикорезистентный антагонист возбудителей кишечных инфекций». Штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, полученный селекционным путем из симбиоза ацидофильной палочки ПЭЗ ВНИМИ МММП СССР был рекомендован «для использования в качестве основы антагонистических биологических средств в лечебно-профилактической и производственной практике» (Описание к патенту Российской Федерации RU 2063436 C1), что и послужило основанием изучения биологических свойств данного штамма в формате целей и задач настоящего исследования, в том числе как перспективного производственного штамма для разработки нового пробиотика.
Таким образом, в работе были использованы 40 штаммов пробиотиче-ских микроорганизмов, из них 29 музейных и 11 штаммов, дополнительно выделенных (и охарактеризованных) нами из препаратов пробиотиков, в т.ч. авторский штамм L.acidophilus ВКМ В-2020 Д. Штаммы относились к 5 родам (Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Escherichia, Enterococcus и Saccharo-myces) и к 22 видам. Применялись в производстве коммерческих препаратов-пробиотиков или являлись перспективными в качестве производственных.
