Введение к работе
Актуальность. В настоящее время применение микроорганизмов в целях извлечения металлов из руд широко используется в мировом масштабе (Кондратьева и др., 2012). В России использование биотехнологий при добыче полезных ископаемых также придается большое значение, что получило отражение в технических направлениях различных фондов содействия развитию предприятий, занимающихся решением данной проблемы (Черняк, 2002). Горнорудная промышленность относится к главным отраслям экономики Камчатского края. Согласно планам экономического развития Камчатки, в ближайшее время будут разрабатываться различные месторождения цветных металлов. Это приведет к увеличению негативной антропогенной нагрузки на окружающую природную среду, водные и рыбные ресурсы Камчатского края (Левенец и др., 2007). Поэтому необходимо разработать практические меры, направленные на охрану живой природы как на видовом, так и на экосистемном уровне, которые могут быть использованы при разработке месторождений цветных металлов. Известно, что экологическая безопасность предприятий по переработке руд цветных металлов может быть повышена за счет внедрения современных биотехнологий, например, биовыщелачивания (Минеев, 1989; Заулочный, 2011). В данной работе получены достоверные данные о структуре сообщества хемолитотрофных микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч. Использование этих результатов на практике будет способствовать внедрению современных биотехнологий в горнорудную отрасль народного хозяйства России.
Современное внедрение технологии биовыщелачивания невозможно без четких данных о структуре микробных сообществ или ассоциаций, вносимых в нарабатываемую культуру выщелачивающего раствора. Причем данные о качественном (видовом) составе микробной культуры и количественном соотношении микроорганизмов в ней необходимо узнавать перед внесением ее в выщелачивающий раствор (Rawlings, 2005). Это позволит интенсифицировать процессы биовыщелачивания не только путем проведения модельных экспериментов с различными микробными ассоциациями, но и оперативно контролировать и отслеживать процесс выщелачивания, вносить коррективы и управлять микробной популяцией при мониторинге процесса.
Мониторинг хемолитотрофных микроорганизм также в отработанных отвалах и хвостохранилищах позволит избежать загрязнения водных объектов и почвенного покрова возле рудников и объектов горнорудной промышленности.
Одним из наиболее перспективных подходов к изучению видового разнообразия микроорганизмов является анализ последовательностей их ДНК. В настоящем исследовании реализована модификация метода полимеразной цепной реакции (основы большинства методов генодиагностики микроорганизмов), основанная на использовании флуоресцентной детекции продуктов реакции – ПЦР в реальном времени.
Актуальность настоящей работы заключается в необходимости определения качественного и количественного состава сообществ биовыщелачивающих ацидофильных микроорганизмов, их генетического скрининга и мониторинга в культуральной среде, в создании технологии универсальной системы пробоподготовки, позволяющей с одинаковой эффективностью очищать ДНК различных микроорганизмов.
Степень разработанности темы. Технология биометаллургии для извлечения металлов из руд в последнее время активно используется и развивается (Халезов, 2008; Norris et al., 2000). Исследователи многих стран изучают микробное разнообразие биовыщелачивающих растворов, используя в том числе и современные методы (Кондратьева и др., 2012). Однако в большинстве работ по интенсификации процесса биовыщелачивания не определяется структура микробной ассоциации, вносимой в выщелачивающий раствор, в ее качественной и количественной характеристике. В основном используют аборигенную микрофлору, находящуюся в исходной пульпе, подразумевая, что она адаптируется к условиям выщелачивающего раствора (Левенец, 2012). Настоящая работа дополняет и уточняет вопрос мониторинга микробных ассоциаций в ходе процесса биовыщелачивания, рекомендуя для определения видового и количественного состава ассоциаций использовать разработанную схему исследования.
Цель исследования – оценить структуру сообществ хемолитотрофных микроорганизмов, принимающих участие в технологии биовыщелачивания, в ее качественной и количественной характеристике.
В соответствии с поставленной целью определены основные задачи:
1) провести молекулярно-биологическое исследование смешанного сообщества биовыщелачивающих микроорганизмов, включающее анализ его структуры и технические средства диагностики;
2) провести оценку эффективности методик очистки, выбор и адаптацию метода выделения бактериальной ДНК из образцов накопительных культур хемолитотрофных микроорганизмов;
3) оценить видовой состав сообществ микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч с помощью построения библиотеки клонов;
4) разработать комплекс ПЦР-тест-систем для выявления фрагментов генома основных представителей исследуемого сообщества;
5) определить количественный состав сообщества и целесообразность применения проведенного молекулярно-биологического исследования структуры сообщества в прикладных биотехнологических и микробиологических исследованиях.
Научная новизна. Впервые с помощью молекулярно-биологических методов охарактеризован видовой и количественный состав аборигенного сообщества биовыщелачивающих микроорганизмов месторождения Шануч. Таким образом, получены новые данные, вносящие вклад в развитие представлений об экологии характерной для данного региона микробной ассоциации, и получены новые данные о структуре сообщества, обладающей повышенной выщелачивающейся способностью.
Впервые в России сформирована методологическая и теоретическая база для осуществления мониторинга микробиологических параметров с помощью молекулярно-биологических подходов. В том числе проведена оценка эффективности методов очистки бактериальной ДНК из субстратов соответствующих естественной среде обитания ацидофильных микроорганизмов, разработаны и адаптированы к использованию с отечественным детектирующим оборудованием тест-системы для анализа микробиологических сообществ, применен оригинальный подход к оценке количества представленных микроорганизмов. Примененное в работе молекулярно-биологическое исследование смешанных бактериальных сообществ легко адаптируется к решению аналогичных задач, поставленным в настоящем исследовании. Реализованный подход позволил повысить точность результатов анализа и расширить область применения полученных научных результатов.
Впервые использование разработанных методов в рутинной биотехнологической практике позволило повысить эффективность мероприятий по мониторингу изменений биогенного состава культур, используемых в биореакторах, и, кроме того, откроет новые возможности к их позитивной трансформации и установлению ассоциаций, характеризующихся наибольшим биовыщелачивающим потенциалом.
Теоретическая и практическая значимость. Проведенное исследование с применением молекулярно-биологических методов может служить основой комплексного подхода к определению качественного и количественного составов смешанных сообществ микроорганизмов. Универсальность проведенного исследования определяет перспективность его использования в технологии промышленного биовыщелачивания для быстрого и точного анализа проб с руды, выщелачивающего раствора и инокулята.
Разработаны и внедрены в лабораториях НИГТЦ ДВО РАН в исследовательское испытание ПЦР-тест-системы для выявления микроорганизмов Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и Ferroplasma acidiphilum, а также модификации и повышения эффективности промышленной технологии биовыщелачивания (учрежденческий уровень внедрения).
Результаты работы будут использованы при исследовании штаммового полиморфизма A. ferrooxidans, идентификации микроорганизмов без выделения чистых культур, определения адаптации штаммов микроорганизмов к условиям биовыщелачивания, подбору сообщества, обладающего наибольшей продуктивностью в получении целевого продукта – ценных металлов.
Полученные результаты используются при разработке технологического процесса переработки низкообогащенных остатков и отвалов сульфидной руды рудника Шануч компанией, его разрабатывающего, – ЗАО «НПК Геотехнология» (региональный уровень внедрения).
Результаты исследования включены в образовательные программы для студентов биологических специальностей учреждений высшего профессионального образования (региональный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в лекциях для аспирантов НИГТЦ ДВО РАН.
Методология и методы исследования. В работе использованы экспериментальные методы исследования: микробиологические (культивирование микроорганизмов на жидких и твердых питательных средах), молекулярно-биологические (выделение и очистка нуклеиновых кислот хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов, очистка плазмидной ДНК, построение библиотеки клонированных фрагментов гена 16S рРНК, определение нуклеотидной последовательности выделенной ДНК, агарозный гель-электрофорез, полимеразная цепная реакция, в том числе ПЦР в реальном времени).
Положения, выносимые на защиту:
1. Модифицированная методика очистки ДНК характеризуется высокой эффективностью в отношении исследованных микроорганизмов, позволяет очистить образцы накопительных культур от ингибиторов ПЦР, обладает повышенной экспрессностью и рекомендуется для выделения ДНК из аналогичного материала.
2. Оценка качественной и количественной структуры сообществ, основанная на ПЦР в реальном времени, эффективна при анализе смешанных сообществ микроорганизмов (в том числе биовыщелачивающих), обладает универсальностью и низкой себестоимостью.
Степень достоверности результатов. Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных. Достоверность результатов исследований обосновывается корректной постановкой задач исследований, обоснованным использованием методов работы, значительным объемом качественно обработанных экспериментальных данных и учетом предшествующих работ. Достоверность результатов исследования также обеспечивается использованием современных, стандартных методов измерений, связанных с тематикой диссертации.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: IV международной конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2007), III и VI международных молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2010), V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), XI международной научной конференции «Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей» (Петропавловск-Камчатский, 2010), международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), III всероссийской научно-практической конференции «Природные ресурсы, их современное состояние, охрана, промысловое и техническое использование» (Петропавловск-Камчатский, 2012), научной конференции «Никеленосные провинции Дальнего Востока» (Петропавловск-Камчатский, 2012), I всероссийской научно-практической конференции «Экология Камчатки и устойчивое развитие региона» (Петропавловск-Камчатский, 2012); межлабораторных семинарах и Ученых советах НИГТЦ ДВО РАН в 2009–2013 гг.
Работа выполнена в лаборатории биогеохимии и экологии НИГТЦ ДВО РАН по теме НИР «Бактериально-химические и бактериально-автоклавные процессы и геотехнологии переработки сульфидных медно-никелевых руд», № госрегистрации 01200963715 (научный руководитель – д.г.-м.н. Ю.П. Трухин). Часть работы поддержана проектом РФФИ № 13-05-00585 (руководитель – д.б.н. Л.В. Захарихина), проектом ДВО РАН № 13-III-В-06-093 (руководитель – С.В. Рогатых).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 – в изданиях, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки России.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и выводов, списка литературы, приложения, изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами, 19 рисунками. Список использованной литературы включает 118 источников, из них 44 отечественных и 74 зарубежных.
