Введение к работе
Актуальность проблемы исследования. Бактериологическое исследование на дисбиоз кишечника привлекает внимание специалистов различного клинического профиля и является одним из наиболее востребованных в лабораторной практике. Значительная часть исследований по данной проблеме посвящена проведению разностороннего анализа состояния микробной ассоциации пищеварительного тракта при патологии пищеварительной системы и других органов, проведению коррекции дисбиотических состояний. Востребованность данного исследования требует оптимизации методического обеспечения исследования на дисбиоз кишечника. В ходе исследования на дисбиоз лишь иногда диагностируются кишечные инфекции. По данным ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора структура заболеваемости острыми кишечными инфекциями (ОКИ) в РФ в 2012 г. выглядела следующим образом: сальмонеллез - 6,5%, шигелез-1,8%, другие ОКИ установленной этиологии - 27,4%, кишечные инфекции неустановленной этиологии - 64,3% ( об инфекционных заболеваниях, 2012). У части обследуемых при отсутствии выделения патогенных микроорганизмов патологическое состояние рассматривается лечащим врачом как дисбиоз кишечника с назначением соответствующей коррекции в соответствии с требованиями отраслевого стандарта ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». В ряде случаев это приводит к этиологически некорректному выбору препаратов.
Лабораторное исследование на условно-патогенные микроорганизмы или дисбиоз кишечника должно включать и определение патогенных микроорганизмов. Однако ОСТ 91500.11.0004-2003 не предусматривает минимального перечня определяемых патогенов и использование современных методов диагностики. В последние годы вирусные агенты занимают ведущее место среди этиологических факторов острых кишечных инфекций у детей во всем мире (Горелов А.В., 2004). Доля бактериальных кишечных инфекций значительно снизилась и составляет 7-10%. Увеличилось число вирусно-бактериальных микст-инфекций до 15-17% (Горелов А.В. и соавт., 2005). Вклад возбудителей вирусной этиологии в общую структуру кишечных инфекций детей раннего возраста составляет 57,9%, среди них доля ротавирусов - 35%, норовирусов - 16,7%, астровирусов - 6,2% (Боднев С.А. и соавт., 2010). Таким образом, существует необходимость формирования минимального перечня патогенных микроорганизмов и методов их определения применительно к лабораториям, выполняющим исследования на дисбиоз кишечника.
Одной из наиболее частых причин формирования дисбиоза кишечника является антибиотикотерапия. В результате подавления индигенных микроорганизмов появляется риск колонизации кишечника токсигенными штаммами Clostridium difficile как в результате инфицирования, так и активации уже имеющихся симбионтов. Традиционное исследование на дисбиоз кишечника в России не подразумевает выявление C. difficile и их токсинов, поэтому требуется целенаправленная оценка их выявляемости при дисбиотических состояниях.
Одной из задач исследования на дисбиоз кишечника является подбор препаратов для его коррекции. Применение антибактериальных препаратов сопряжено с подавлением индигенных микроорганизмов кишечного микробиоценоза, поэтому существует потребность в определении чувствительности их к антибиотикам. Пробиотические препараты, применяемые при дисбиотических состояниях, являются актуальной альтернативой антибиотикотерапии. Проблемой заслуживающей особого внимания, является антибиотикорезистентность пробиотических штаммов, используемых в составе данных препаратов. Применение таких полирезистентных штаммов может способствовать распространению устойчивости к антибактериальным препаратам (АБП) среди представителей кишечного биотопа: индигенных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Так лактобактерии, выделяемые от детей грудного возраста, имеют от 8 до 15 маркеров резистентности (Николаева И.В и соавт., 2010). Все чаще появляется информация о плазмидной природе устойчивости лактобактерий к антибиотикам (Gueimonde M. et al., 2006; Huys G. et al., 2006; Masco L. et al., 2006; Saarela M. et al., 2007). Интерпретация результатов определения резистентности лакто- и бифидобактерий к АБП сопряжена с определенными трудностями. Многочисленные противоречия, в отношении оценок частоты находок антибиотикорезистентных штаммов лактобактерий могут быть обусловлены как естественными причинами, так и методическими: отсутствием, как стандартных методов тестирования, так и общепризнанных пограничных значений МИК. Учитывая важность данной проблемы, необходимо изучение устойчивости к антибактериальным препаратам пробиотических штаммов, индигенных микроорганизмов кишечного биоценоза, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий для оптимизации выбора средств противомикробной терапии.
Степень разработанности темы исследования. Большинство работ, посвященных дисбиозам кишечника, касаются изучения количественно-качественного состава микробиоценоза кишечника, наличию условно-патогенных микроорганизмов и их ассоциаций (Захаренко С.М. и соавт., 2006; Катаева Л.В. и соавт., 2010). Данный подход к изучению регламентируется соответствующим отраслевым стандартом. При этом недооценена роль возбудителей ОКИ как бактериальной, так и вирусной этиологии, наличие которых влечет за собой дисбиотические изменения.
Так, в соответствии с требованиями ОСТ 91500.11.0004-2003, необходимо выделять 16 групп микроорганизмов, в перечень которых не входят вирусные возбудители и труднокультивируемые патогены (Campylobacter spp., Y.enterocolitica). Нельзя не отметить, что классическое бактериологического исследование на дисбиоз не в полной мере отвечает современным потребностям клинической медицины и существующим возможностям диагностики. В связи с этим, необходима разработка алгоритма исследования на дисбиоз кишечника с формированием перечня выявляемых патогенов как бактериальной, так и вирусной этиологии.
Цель исследования. С помощью современных методов (ПЦР, иммунохроматография) определить частоту обнаружения вирусов и бактерий - этиологических агентов диарейного синдрома у детей, обследуемых по поводу дисбиоза кишечника, для оптимизации выбора средств противомикробной терапии.
Задачи исследования:
1. Оценить частоту выявления возбудителей кишечных инфекций у детей, обследованных на дисбиоз кишечника бактериологическим методом, сопоставить частоту выявления возбудителей кишечных инфекций с помощью ПЦР и классического бактериологического метода и оценить целесообразность включения генной диагностики в комплексную схему исследования на дисбиоз кишечника.
2. Оценить частоту выявления токсинов Clostridium difficile у детей, обследуемых на дисбиоз кишечника, и необходимость включения иммунохроматографического метода в комплексную схему исследования на дисбиоз кишечника.
3. Охарактеризовать устойчивость к антибактериальным препаратам возбудителей кишечных инфекций и условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых при исследовании на дисбиоз кишечника.
4. Охарактеризовать устойчивость к антибактериальным препаратам индигенных представителей микробиоценоза кишечника и пробиотических штаммов.
Научная новизна исследования:
1. Определена частота встречаемости возбудителей острых кишечных инфекций при проведении классического бактериологического исследования на дисбиоз кишечника и ПЦР, разработан алгоритм комплексного исследования, направленный на улучшение качества микробиологической диагностики кишечных инфекций в ходе исследования на дисбиоз кишечника.
2. Впервые на основании большой выборки определена частота встречаемости возбудителей острых кишечных инфекций в результате проведения классического бактериологического исследования на дисбиоз кишечника (8174 исследований).
3. У детей, обследующихся по поводу дисбиоза кишечника, впервые определена частота обнаружения токсина Clostridium difficile методом иммунохроматографии.
4. Впервые сопоставлена устойчивость к антибактериальным препаратам пробиотических штаммов и микроорганизмов кишечного биотопа, выявленных в ходе исследования на дисбиоз кишечника.
Теоретическая и практическая значимость исследования:
1. Предложен комплексный подход к диагностике дисбиоза кишечника, основанный на применении молекулярно-генетического и бактериологического методов исследования. Показана необходимость при проведении данного исследования целенаправленного поиска наиболее часто встречающихся возбудителей кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии. Получено удостоверение на рационализаторское предложение № 1857, принятое ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова 24.06.2011г. к использованию под наименованием «Уточнение диагностики дисбактериоза кишечника».
2. Сопоставлена устойчивость к антибактериальным препаратам микроорганизмов кишечного биоценоза и возбудителей кишечных инфекций, выявленных в ходе исследования на дисбиоз кишечника, являющейся важной информацией для дальнейшего изучения вероятности передачи генов резистентности в условиях кишечного биотопа.
3. Данные о минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных препаратов для лакто- и бифидобактерий являются важной информацией для проведения дальнейших исследований с целью выяснения вероятности передачи генов резистентности в условиях кишечного биотопа и разработки критериев безопасности пробиотических штаммов.
Методология и методы исследования. Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного многоцентрового проспективного исследования с использованием бактериологических, молекулярно-генетических, аналитических, статистических методов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Применение комплексного подхода к исследованию на дисбиоз кишечника с использованием полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей кишечных инфекций повышает расшифровку причин дисбиотических состояний.
-
Выявление токсинов C.difficile в рамках комплексного исследования на дисбиоз кишечника целесообразно.
-
Среди штаммов патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых при исследовании на дисбиоз кишечника, выявляются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.
-
Имеет место множественная лекарственная устойчивость лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов и лактобактерий кишечного микробиоценоза.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Степень достоверности полученных результатов проведённых исследований определяется достаточным и репрезентативным объёмом выборок исследований и обследованных пациентов с использованием современных методов исследования. Статистическая обработка полученных результатов осуществлена методами параметрической и непараметрической статистики с использованием компьютерных программ Excel. Достоверность различий определяли, рассчитывая Хи квадрат при р<0,05 и ошибку доли. Методы статистической обработки полученных результатов адекватны поставленным задачам. Сформулированные в диссертации выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа значительного объёма выборок обследованных пациентов и результатов выполненных исследований. Достоверность работы подтверждается публикацией её результатов в рецензируемых научных изданиях.
Основные положения диссертации представлены и обсуждены на отчетных научно-практических конференциях сотрудников и молодых ученых СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2010, 2011), на Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микробиологии и клинической микологии с международным участием «XV Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 27-28 июня 2012г.) и «XVI Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 19 – 21 июня 2013 г.) и Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCMID-2013, Берлин, 27-30 апреля 2013 г.).
Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры медицинской микробиологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, протокол № 12/13 от «31» октября 2013 г.; на заседании научной проблемной комиссии «Эпидемиология, профилактика, диагностика и лечение инфекционных (бактериальных, вирусных, микотических, паразитарных и связанных с оказанием медицинской помощи) и некоторых неинфекционных заболеваний» ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, протокол № 3 от 12.11.13.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Внедрение результатов исследования
Материалы диссертационного исследования внедрены в работу бактериологической лаборатории Госпиталя ветеранов войн и бактериологическую лабораторию ЗАО «СИТИЛАБ».
Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный курс кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова и курс практических занятий медицинского факультета СПбГУ.
Личное участие автора в получении результатов исследования. Автором обоснованы цель, задачи и схемы исследования, осуществлены сбор и анализ литературных источников. Выполнены основные микробиологические исследования. Предложен комплексный подход к исследованию на дисбиоз кишечника. Проанализированы полученные данные, осуществлено обобщение и статистическая обработка результатов исследования, сформулированы выводы и основные положения, выносимые на защиту.
Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстративный материал представлен 8 рисунками и 24 таблицами. Список использованной литературы содержит 156 источников, из них 87 отечественных и 69 зарубежных авторов.
