Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема симбиоза - одна из приоритетных в современной биологической науке. Симбиотические ассоциации представляют собой форму сосуществования неродственных организмов и ключевой вопрос - механизмы симбиотических взаимоотношений (Проворов Н.А., 2001;
Игнатов В.В., 2005; Бухарин О.В. и др., 2007; Смит С.Э. и др., 2012).
На современном этапе развития науки отмечено изменение парадигмы симбиоза. На смену представлениям о них как о двухкомпонентных системах в результате уточнения наших знаний об этом феномене приходит понимание симбиозов как многокомпонентных систем, включающих хозяина в качестве макропартнера, стабильный доминантный микросимбионт и минорных ассоциированных микросимбионтов с разнонаправленными воздействиями, определяющими формирование, стабильность существования и эффективное функционирование симбиоза в целом (Бухарин О.В., 2010).
Популяции микроорганизмов, вступая в конкурентные или кооперативные взаимоотношения, при заселении различных органов и тканей формируют его специфический микросимбиоценоз). Известно, что к наиболее сложному по составу микробиоценозу по праву относят микрофлору толстого кишечника (Барановский А.Ю., 2006; Несвижский Ю.В., 2009; Бондаренко В.М., 2008).
До настоящего времени дискутируется вопрос о роли отдельных видов условно-патогенных микроорганизмов в формировании нормальной микрофлоры человека, участии их в этиологии и патогенезе ряда заболеваний
(Шендеров Б.А., 2005; Лобзин Ю.В., 2009; Guignard S., 2000).
Анализ направленности межмикробных взаимоотношений позволяет правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микросимбионтов, приводящих к изменению их типичных или проявлению их новых биологических свойств (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М., 2000; Миллер Г.Г., 2007).
В последние годы в России официально регистрируется более 1,2 миллионов больных различными паразитоценозами, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами (Романенко Н.А. и др., 2000; Онищенко Г.Г., 2007; Козлов С.С., Жоголев Д.Т., 2011). В связи с этим, особую актуальность приобретает широко распространенная протозойная инвазия, обусловленная паразитированием в толстом отделе кишечника простейших
Blastocystis spp. (Торопова Н.П., 1998; Красноперова Ю.Ю., 2009; Jard B. et al., 1999; Zierdt C.H. et al., 1999).
Возбудитель бластоцистной инвазии является микроорганизмом, к усилению агрессии которого, с одной стороны, могут приводить факторы, снижающие защитные силы макроорганизма, а с другой - микроорганизмы, входящие в состав симбиоценоза.
Установлено, что, находясь в кишечнике, бластоцисты участвуют в формировании микробиоценоза данного биотопа. Нарушая баланс микроорганизмов, эти возбудители способствуют созданию благоприятных условий для развития патологических процессов (Потатуркина-Нестерова Н.И. и др., 2000, 2004; Ильина Н.А., 2005; Красноперова Ю.Ю., 2009). Однако механизмы, обеспечивающие симбиотические связи в формировании протозойно-бактериальных ассоциаций кишечника человека мало изучены.
Поскольку в последние годы повсеместно отмечается тенденция увеличения ассоциированных инфекций, проведение комплексных исследований, направленных на выявление изменений биологических свойств микросимбионтов в протозойно-бактериальных сообществах является весьма актуальным. С этих позиций значительный интерес представляет собой изучение простейших Blastocystis spp.
Известно, что энтерококки являются одним из наиболее распространенных участников развития анаэробно-аэробных микстинфекций, способных эффективно стимулировать рост облигатно-анаэробных патогенов, усиливая их вирулентный потенциал (Бондаренко В.М., 2004; Бондаренко В.М., Суворов А.Н., 2008, Бухарин О.В., Валышев А.В., 2012). Однако открытым остается вопрос о механизмах межмикробных взаимоотношений данных бактерий с простейшими.
Раскрытие механизмов формирования протозойно-бактериальных ассоциаций, определяющих поддержание микросимбиозов организма хозяина в норме и при патологических состояниях, открывает перспективу решения фундаментальной проблемы микробиологии, направленной на выявление причинно-следственных связей формирования патогенных вариантов микросимбионтов в ассоциации с бластоцистами.
Цель и задачи исследования.
Цель исследования - комплексная оценка взаимодействия ассоциативных микросимбионтов Enterococcus faecalis и Blastocystis spp. в системе ассоциативного симбиоза кишечника человека.
Для реализации цели работы были поставлены следующие задачи:
-
Определить частоту встречаемости в кишечнике обследованных простейших Blastocystis spp. в норме и при дисбиозе и изучить их биологические свойства (антилизоцимную, антилактоферриновую и антигистоновую активности).
-
Выявить генетические маркеры факторов патогенности бластоцист и на основе рестрикционного анализа ДНК определить зависимость между полиморфизмом длин фрагментов нуклеотидных последовательностей и вирулентностью простейших.
-
Изучить особенности микросимбиоценоза толстого и тонкого отделов кишечника человека при бластоцистной инвазии в зависимости от патогенного потенциала бластоцист.
-
Определить характер и направленность изменений биологических свойств Е. faecalis в условиях ассоциативного симбиоза с простейшими бластоцистами.
-
Провести молекулярно-генетический анализ факторов патогенности
Е. faecalis в алгоритме ассоциативного взаимодействия с Blastocystis spp. различной вирулентности.
Новизна исследования. Оценка межмикробных взаимоотношений микрофлоры толстого отдела кишечника человека при паразитарной инвазии, вызванной простейшими Blastocystis spp., с позиции ассоциативного симбиоза выявила снижение доминирования основных симбионтов (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp.) на фоне увеличения частоты встречаемости и повышения вирулентности ассоциативной микробиоты (Staphylococcus spp., Enterococcus spp. и др.) приводящего к нарушению структуры микросимбиоценоза.
Выявлен феномен избыточного роста бактерий в тонкой кишке на фоне инвазии бластоцистами, характеризующийся экспансией роста микробиоты тонкой кишки и транслокацией фекальной флоры из толстого кишечника в тонкий. У лиц, инвазированных бластоцистами, выявлены функциональные расстройства, сопровождающиеся избыточным количеством в кишечнике обследованных муцина, тканевого и сывороточного белков, органических кислот и аммиака, обладающих раздражающим действием и способствующих усилению слизеобразования, бродильных процессов, повышению проницаемости кишечной стенки для плазменных белков. Полученные материалы свидетельствуют о влиянии простейших Blastocystis spp. на структуру микросимбиоценоза, а также на пищеварительные процессы и химические реакции, протекающие в кишечнике.
Обнаружена прямая корреляционная зависимость между персистентной активностью бластоцист, их вирулентностью и глубиной нарушений микробиоценоза кишечника. Эти материалы позволяют использовать важнейшие биологические свойства выживания микроорганизмов для исследования механизмов формирования микросимбиоценозов в биотопе толстого кишечника и являются теоретической предпосылкой для разработки способа скрининговой диагностики кишечного дисбиоза, основанного на определении АЛА, АЛфА и АГА клинических изолятов бластоцист.
Использование молекулярно-генетического метода - рестрикционного анализа ДНК выявило комбинацию рестриктаз Hae III, Pst I и Hind III, позволяющих определить генетические маркеры вирулентности Blastocystis spp. (приоритетная справка на патент РФ № 2012154112 от 17.12.2012 г.)
В опытах in vivo установлено, что показатели вирулентности (LD50/lg) штаммов Е. faecalis, выделенных в консорциуме с высоковирулентными бластоцистами были достоверно выше, чем в ассоциациях с умеренно- и слабовирулентными щтаммами простейших.
При экспериментальном сокультивировании с бластоцистами выявлена взаимосвязь антилизоцимной активности и репродуктивной функции
E. faecalis, что может прояснить механизм взаимной адаптации микросимбионтов.
В протозойно-бактериальных ассоциациях обнаружен механизм, способствующий активации процессов взаимоадаптации симбионтов. В результате совместной инкубации высоко- и умеренновирулентных бластоцист с гемолитическими формами Е. faecаlis происходило обоюдное усиление биологической активности взаимодействующих микробов, напротив, после сокультивирования негемолитических энтерококков с бластоцистами выявлено статистически достоверное угнетение активности изучаемых ферментов агрессии, как среди бактерий так и среди Blastocystis spp.
На молекулярно генетическом уровне в условиях симбиотического взаимодействия E. fаecalis с Blastocystis spp. in vitro происходило увеличение показателей частоты встречаемости генетических детерминант факторов патогенности энтерококков (gelE и cpd), что позволяет объективно оценить роль простейших в селекции биоваров с различным уровнем вирулентности и реализации патогенного потенциала ассоциативных микросимбионтов.
Практическая ценность работы. Полученные материалы расширяют представления о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание симбиоценоза кишечника человека, в условиях бластоцистной инвазии и дополняют, учение об ассоциативных симбиозах в целом.
Обнаруженные функциональные расстройства пищеварения у пациентов на фоне инвазии простейшими Blastocystis spp. позволяют расширить представления о характере взаимоотношений в системе паразит-хозяин, понять связь микроэкологических нарушений с интенсивностью инвазии, а также наметить пути поддержания гомеостаза биоценоза толстого кишечника.
Результаты исследования динамики экспрессии факторов персистенции и вирулентности представителями микробного биоценоза кишечника человека в системе протозойно-бактериальной ассоциации может способствовать расшифровке механизмов возникновения инфекционных заболеваний.
Выявленная широкая распространенность факторов персистенции у простейших бластоцист может быть использована в качестве маркеров дисбиотического процесса.
Предложенный в работе способ определения Blastocystis spp. c различной степенью вирулентности с использованием РА ДНК простейших позволил разработать специфические маркеры вирулентности на основе фрагментарного анализа ДНК, отличительной особенностью которого является возможность построения молекулярно-генетических карт микроорганизмов, что при высокой степени воспроизводимости может быть использовано для видовой идентификации бластоцист.
Выявленные биологические и экологические особенности бластоцист позволяют рекомендовать внедрение в работу учреждений практического здравоохранения современных методик по обнаружению данных простейших у больных и носителей.
Внедрение в практику. По материалам диссертационной работы изданы монографии «Простейшие Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм». СПб.: Наука, 2009 (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова Н.А., Нестеров А.С., Фалова О.Е.); «Копрологические исследования толстого кишечника на фоне бластоцистной инвазии». М.: ФЛИНТА: Наука, 2012 (с соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Ильина Н.А.).
Опубликованы практические рекомендации: «Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника», Ульяновск, 2004 (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Фалова О.Е., Квасова Н.А., Немова И.С., Кулагина Г.М., Богомолова Л.К.); «Особенности микроэкологии кишечника больных псориазом» Ульяновск, 2004 (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Фалова О.Е., Квасова Н.А., Немова И.С., Кулагина Г.М., Нестеров А.С.); «Копрологическая характеристика кишечника при бластоцистной инвазии», Ульяновск, 2012 (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Ильина Н.А., Волгина Т.И.); Руководство к лабораторным занятиям по курсу «Биология». 1, 2 часть, СПб, 2007, 2008; Учебно-методическое пособие для студентов «Споровики: биологические свойства, диагностика вызываемых заболеваний», Ульяновск, 2010 (с соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Немова И.С.); Микробиология: [учеб.-метод. пособие] (с соавт. Красноперова Ю.Ю., Ильина Н.А., Касаткина Н.М.). М.: ФЛИНТА: Наука, 2011; Учебное пособие «Клиническая иммунология», Ульяновск, 2011 (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Немова И.С., Нестеров А.С., Мясникова А.В., Ильина Н.А., Красноперова Ю.Ю.). Получена приоритетная справка на патент РФ № 2012154112 от 17.12.2012 г. «Способ определения простейших Blastocystis spp. c различной степенью вирулентности».
Материалы работы используются в диагностической работе клинической и бактериологической лабораторий ГУЗ «Городской клинической больницы №1» г. Ульяновска при диагностике и оценке микробиоценоза кишечника, определении чувствительности микробов к антибиотикам, эффективности терапии пищеварительного тракта по выявлению направленности химических процессов в кишечнике при бластоцистной инвазии (Акт о внедрении от 16.03.2013).
Полученные результаты исследования внедрены в учебно-педагогический процесс ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова» (Акт о внедрении от 17.03.2013), ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» (Акт о внедрении от 12.03.2013).
Положения, выносимые на защиту
-
Бластоцистная инвазия вызывает микроэкологические нарушения, характеризующиеся угнетением доминирования основных симбионтов, повышением показателей частоты встречаемости и вирулентности ассоциативной микрофлоры на фоне изменения внутрикишечной среды.
-
Простейшие Blastocystis spp. в условиях ассоциативного симбиоза способствуют селективному накоплению генетических детерминант патогенности энтерококков, что может рассматриваться в качестве одного из системных факторов регуляции вирулентности и персистенции бактериальных симбионтов, способствующего реализации адаптационного механизма.
-
Выявленная комбинация рестриктаз Hae III, Pst I и Hind III, позволяющая определить генетические маркеры вирулентности Blastocystis spp. может служить основой для видовой идентификации и построения молекулярно-генетических карт изучаемых простейших.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии – 2006 (СПб., 2006), Международной научной конференции «Научные исследования высшей школы, научная конференция с международным участием (Испания, 2006), Научно-практической конференции «Естествознание и гуманизм. Современный мир, природа и человек» (Томск, 2007), Международной научной конференции «Современные проблемы науки и образования, III научной международной конференции» (М., 2008), Международной научной конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально-значимых заболеваний человека» (Турция, 2010), V Международной научной конференции «Перспективы развития вузовской науки» (Сочи, 2010), VII Международная научно-техническая конференция «Наука, Образование, производство в решении экологических проблем» (Уфа, 2010), I Международной телеконференции «Фундаментальные медико-биологические науки и практическое здравоохранение» (Томск, 2010), III Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Инфекции и паразитарные болезни в практике клинициста. Антибактериальная, антивирусная, антипаразитарная, иммунотерапия и иммунопрофилактика на догоспитальном и госпитальном этапах» (Харьков, 2010), 4-я Международная телеконференция «Issues and Perspectives in Contemporary Science»
(Томск, 2011), VIII Международной научно-технической конференции «Наука, образование, производство в решении экологических проблем (Экология, 2011) (Уфа, 2011), Международной научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (М., 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 59 работ, из них 17 статей в рецензируемых научных журналах ВАК; изданы 8 практических пособий и 2 монографии.
Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 301 страницах компьютерного набора, содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 6 глав результатов собственных исследований, заключение, выводы, список литературы, включающий в себя 201 отечественных и 224 иностранных источников. Иллюстрации представлены 65 таблицами и 63 рисунками.
Основные разделы работы выполнены по плану ЦНИЛ ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова» в рамках темы НИР «Роль условно-патогенных микроорганизмов в патологии человека» (№ гос. регистрации 01201055116).
