Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Характеристика микробиоценоза кишечника в норме и при патологиях пищеварительного тракта 16
ГЛАВА 2. Влияние Blastocystis hominis на морфофункциональное состояние макроорганизма. 24
ГЛАВА 3. Ареал распространения бластоцистоза ; 30 Ъ
ГЛАВА 4. Морфофизиологические свойства Blastocystis hominis Собственные исследования 48
ГЛАВА 5. Материалы и методы исследований 48
ГЛАВА 6. Экологическая характеристика микропейзажа кишечника при бластоцистной инвазии 77
6.1. Паразитоценоз кишечника 77
6.2. Характеристика выделенных штаммов Blastocystis hominis 88
6.2.1. Частота встречаемости Blastocystis hominis 88
6.2.2. Структурные особенности Blastocystis hominis 94
6.3. Микробная флора кишечника 110
6.3.1. Сравнительная оценка микробиоценоза кишечника практически здоровых людей и гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis hominis 110
6.3.2. Особенности бактериальной флоры в зависимости от вида заболевания 117
* 6.3.3. Оценка дисбиоза кишечника у гастроэнтерологических больных в зависимости от стадии заболевания 123
6.3.4. Кишечный микробиоценоз в зависимости от продолжительности заболевания
6,3.5. Микробный пейзаж кишечника при различных формах заболевания 138
6.4. Микопейзаж кишечника 157
ГЛАВА 1. Механизм воздействия Blastocystis hominis на макроорганизм 162
7.1. Вирулентность Blastocystis hominis 162
7.2. Энтеротоксигенность Blastocystis hominis 165
7.3. Антиинтерфероновая активность Blastocystis hominis 168
7.3.1. Распространенность и уровень антиинтерфероновой активности Blastocystis hominis 168
7.3.2. Зависимость антиинтерфероновой активности Blastocystis hominis от заболевания 171
7.3.3. Корреляция антиинтерфероновой активности с показателями потагенности Blastocystis hominis 176
7.4. Чувствительность Blastocystis hominis к антипротозойным препаратам 177
7.5. Изменение микрофлоры кишечника при экспериментальном бластоцистозе 186
7.6. Морфологические изменения кишечника при бластоцистной инвазии 190
ГЛАВА 8. Морфофункциональные особенности эритроцитов периферической крови при экспериментальном бластоцистозе 193
8.1. Изменение морфометрических показателей эритроцитов 193
8.2. Действие Blastocystis hominis на активность ферментов эритроцитов 207
ГЛАВА 9. Количественные показатели лейкоцитов при экспериментальном бластоцистозе 213
9.1. Количество лейкоцитов периферической крови 213
9.2. Количественные показатели нейтрофилов 216
9.3. Изменение количества лимфоцитов периферической крови 221
ГЛАВА 10. Характеристика иммунной функции лимфоцитов при экспериментальном бластоцистозе 234
10.1. Показатели (Т-лимфоцитов) клеточного иммунитета 234
10.2. Показатели (В-лимфоцитов) гуморального иммунитета 242
10.3. Характер изменений функциональной активности эффекторных механизмов иммунного ответа 244
Заключение 253
Выводы 274
Список использованных литературных источников 276
Приложения 301
- Характеристика выделенных штаммов Blastocystis hominis
- Микробный пейзаж кишечника при различных формах заболевания
- Корреляция антиинтерфероновой активности с показателями потагенности Blastocystis hominis
- Количественные показатели нейтрофилов
Введение к работе
Широко распространенное состояние дисбиоза кишечника свидетельствует о наметившемся сдвиге в микробном ценозе человека, и является отражением экологического неблагополучия внешней среды (Красноголовец, 1989; Куваева, Ладодо, 1991; Воробьев с соавт., 1996).
Учитывая значительную роль кишечной микрофлоры в защитных функциях макроорганизма, актуальным представляется изучение нарушения стабильности микробиоценоза кишечника при различных патологиях желудочно-кишечного тракта. Дисбиоз кишечника выявляется у 70 % больных с патологией гастродуоденальной зоны и гепатобилиарной системы, в 100 % случаях при заболеваниях кишечника (Дорофеев, Несвижский, 1997; Комаров, Рапопорт, 2000; Walker, 2005).
Дисбиотические расстройства характеризуются, как правило, снижением количественного содержания индигенных облигатно-анаэробных бактерий (бифидобактерий, лактобацилл, бактероидов и т.д.) и изменением количества других условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, синегнойной палочки, грибов рода Candida и др.). Среди условно-патогенных микроорганизмов, способствующих возникновению и поддержанию дисбиотического процесса, помимо бактерий и грибов, значительное место занимают кишечные простейшие, которые в небольшом количестве встречаются в кишечнике практически всех здоровых лиц (Воробьев с соавт., 1996; Бондаренко, 1999; Бухарин, 2000).
Известно, что кишечные паразитозы представляют актуальную эколого-медико-социальную проблему. По данным ВОЗ в России ежегодно регистрируется около 2 млн больных паразитарными болезнями (Сергиев, Лебедева, 1997; Онищенко, 2002).
Наиболее известными возбудителями кишечных расстройств протозойноЙ природы являются Entamoeba bystolitica, Giardia lamblia и
Criptosporidium (Генис, 1979; Крылов, 2004). Менее известна протозойная инфекция - бластоцистоз, обусловленная паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocystis hominis (Reinthaler et al., 1988; Ziertd et al., 1988; Чайка, 1992).
Дисбиозы кишечника, обусловленные инвазией Blastocystis hominis, характеризуются длительным течением, особенно на фоне снижения резистентности макроорганизма (Потатуркина-Нестерова с соавт., 2001). С биологических позиций это одна из распространенных форм функционирования биологической системы «паразит - хозяин», которая представляет собой эволюционно прогрессивную форму симбиоза, определяющее развитие и взаимоадаптацию микроорганизма и макроорганизма (Одум, 1986; Нетрусов с соавт., 2004). При этом данная система с медицинской точки зрения проявляется в виде носительства - одна их форм инфекционного процесса, при которой наступает динамическое равновесие между микроорганизмами и макроорганизмом с развитием иммуноморфологических реакций и антительного ответа (Беляков с соавт., 1987; Бондаренко, Горская, 1992).
В связи с этим, актуальным представляется рассмотрение взаимной адаптации Blastocystis hominis и макроорганизма, а именно инвазии и персистенции патогеном экологической ниши и механизмов защиты макроорганизма. В этом плане особого внимания заслуживает изучение преодоления Blastocystis hominis «экологического барьера» противодействия со стороны представителей индигенной микрофлоры и формирования устойчивого биоценоза кишечника (Бухарин, 1990; Соколов, 1990; Леванова, Алешкин, 2002).
В ряде работ (Валышев, Зыкова, Коннова, 1994; Зыкова, Челпаненко, 1994) при расшифровке взаимодействия патогенов и макроорганизма, в частности для выявления причинно-следственных связей дисбиозов, активно
обсуждаются факторы персистенции, обеспечивающие длительное выживание возбудителя в организме хозяина. Естественно, в зависимости от вида патогена, механизмы его персистирования и патогенности различны. Однако подавляющее большинство микроорганизмов продуцируют секретируемые факторы деградации защиты хозяина уклоняясь от нее, обеспечивая себе персистирование в организме (Сомов, Литвин, 1988; Бухарин, 1994; Прозоровский с соавт, 1994).
Одновременно важным является рассмотрение адаптации организма хозяина при инвазии Blastocystis hominis. Одними из наиболее чувствительных к действию инфекционных агентов защитных систем организма являются системы крови и иммунитета. Существует достаточное количество сообщений (Борисов, Смирнов, 1994; Рязанцева, Новицкий, Степовая, 2003; Новицкий, Уразова, 2004; Рязанцева, Новицкий, 2004) о ключевой роли данных систем в обеспечении противоинфекционной защиты, однако значение их при бластоцистозе до сих пор не изучено.
Расшифровка механизмов реагирования и ответа (в том числе иммунного) со стороны макроорганизма на внедрение и персистирование Blastocystis hominis открывает перспективы решения фундаментальных проблем биологии - понимание природы носительства микроорганизмов, выявления причинно-следственных связей дисбиозов, совершенствования оценки микробного состава кишечника, наконец, создание основ микроэкологического мониторинга микробных сообществ макроорганизма.
Цель работы - теоретическое обоснование и разработка оценки микробиоценоза кишечника как «экологического барьера» при бластоцистозе и изучение взаимоадаптаций системы Blastocystis hominis -макроорганизм.
Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:
1. Разработать систему мониторинга микробного состава кишечника
гастроэнтерологических больных при бластоцистозе и практически здоровых людей.
2. Охарактеризовать структуру микробиоценоза кишечника
гастроэнтерологических больных и практически здоровых людей при
инвазии Blastocystis hominis для анализа противодействия нормальной
микрофлоры патогенам.
3. Произвести морфофизиологическую оценку выделенных штаммов
Blastocystis hominis с целью определения биологически активной
морфологической формы, способствующей длительной инвазии
микроорганизма в кишечнике.
4. Определить степень вирулентности Blastocystis hominis путем
выявления антиинтерфероновой, энтеротоксической активности и
чувствительности к антипротозойным препаратам как механизмов
реализации экологической ниши.
5. Выявить морфофункциональные свойства эритроцитов и
количественные изменения лейкоцитов периферической крови при
бластоцистозе на модели экспериментальных животных (кроликах, крысах) с
целью расшифровки механизмов реагирования макроорганизма на внедрение
и персистирование Blastocystis hominis.
6. Исследовать показатели клеточного и гуморального иммунитета на
модели экспериментальных животных при инвазии Blastocystis hominis для
объяснения адаптации макроорганизма к патогену.
Научная новизна
Впервые разработана система мониторинга микробиоценоза кишечника, включающая комплексную оценку протоценоза и микрофлоры кишечника гастроэнтерологических больных, позволяющая повысить степень выявления дисбиозов, и получения унифицированных данных инвазивности Blastocystis hominis (Рационализаторское предложение №1 от
05.10.2005). Установлена высокая инвазивность кишечными паразитами -89,43 %, что сопровождалось снижением обсемененности представителей индигенной микрофлоры и повышенным содержанием транзиторных микроорганизмов.
Впервые установлено нарушение состава микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии Biastocystis hominis, которое характеризовалось структурной перестройкой ценотипа, сопровождающейся сменой абсолютных доминант (бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов) и появлением среди них грибов рода Candida. Одинаково высокий индекс постоянства эшерихий (С=100 %), выделенных у гастроэнтерологических больных и практически здоровых людей свидетельствует об активности «экологического барьера» нормальной микрофлоры кишечника.
Впервые установлено, что степень выраженности дисбиотических изменений микрофлоры кишечника зависит от периода (обострение, ремиссия), продолжительности гастроэнтерологического заболевания и морфологических форм Biastocystis hominis, вегетирующих в кишечнике организма человека.
Впервые описаны безъядерные морфологические формы Biastocystis hominis в фекалиях гастроэнтерологических больных, инвазивность которых в кишечнике сопровождалась диарейным синдромом.
Впервые показана выраженность вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активности и степень чувствительности к антипротозойным препаратам клинических изолятов Biastocystis hominis, определяющая возможность колонизации экологической ниши и персистенции микроорганизма.
Впервые установлены фазные изменения морфофункциональных свойств эритроцитов и количественного содержания лейкоцитов при
экспериментальном бластоцистозе, свидетельствующие о специфичности адаптации макроорганизма к данному патогену.
Впервые установлено, что при экспериментальном бластоцистозе снижение показателей Т-клеточного иммунитета обусловлено преимущественно угнетением Т-хелперного звена, в основе же гуморального иммунитета лежит угнетение генеза IgG, что можно расценивать как форму иммунодефицита.
Практическая значимость
Полученные в работе данные расширяют и углубляют теоретические представления взаимоадаптации Blastocystis hominis и макроорганизма, в частности расшифровывают механизмы выживания патогена в условиях экологического барьера нормальной флоры кишечника.
Разработанная система мониторинга микробиоценоза кишечника: БИ+КТ-ФЭО-ЦН-М рекомендована и внедрена в практику клинических и бактериологических лабораторий (Акт о внедрении в клиническую и бактериологическую лаборатории Городской больницы №1 г.Ульяновска от 10.10.2005).
Создана твердая питательная среда для культивирования Blastocystis hominis, позволившая выявить основные типичные (вакуолярная, гранулярная и амебоидная) и атипичные (безъядерная) морфологические формы простейших (Патентная справка на изобретение РФ № 2003135444 от 09.12.2003).
Выраженность вирулентных свойств: антиинтерфероновой, энтеротоксической активности и степени чувствительности к антипротозойным препаратам клинических изолятов Blastocystis hominis свидетельствует о реализации экологической ниши данных микроорганизмов, что сопровождается различной степенью дисбиоза кишечника гастроэнтерологических больных.
Разработана экспериментальная модель бластоцистоза с целью рассмотрение адаптации организма хозяина при инвазии Blastocystis hominis (Патент на изобретение РФ № 2224465 от 05.06.2002).
Определение изменений в системе крови (морфофункциональных особенностей эритроцитов и количественных показателей лейкоцитов) в макроорганизме можно рекомендовать при проведении комплексного диагностического обследования гастроэнтерологических больных на бластоцистоз.
По материалам диссертационной работы написаны монография «Бластоцистная инвазия и дисбактериз кишечника». Ульяновск, 2003, 155 с. (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Красноперова Ю.Ю., Нестеров А.С), практические рекомендации; «Микрофлора кишечника при бластоцистной инвазии» Ульяновск, 2003, 23 с. (соавт. Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нестерова Н.И, Исаева И.Н., Нестеров А.С, Бурганова Р.Ф.); «Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника». Ульяновск, 2004, 23 с. (соавт. Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нестерова Н.И., Бугеро Н.В., Немова И.С., Фалова О.Е., Кулагина Г.М., Богомолова Л.К.); «Методы выявления патогенных простейших кишечника человека». Ульяновск, 2004, 22 с. (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Валкина О.Н.).
Результаты исследования используются в процессе преподавания микробиологии, общей экологии и экологии микроорганизмов на естественно-географическом факультете ГОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова» (Акт о внедрении от 15.09.2005, утвержденный ректором ГОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова) и на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета (Акт о внедрении от 21.10.2005, утвержденный директором
Института Медицины, экологии и физической культуры Ульяновского
государственного университета).
Основные положения, выносимые на защиту
Разработана система мониторинга микробного состава кишечника гастроэнтерологических больных, позволяющая выявлять весь спектр микроорганизмов, в том числе единичные клетки Blastocystis hominis.
На основании коэффициентов постоянства определена структура микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при
инвазии Blastocystis hominis, в которой доминирующее положение
занимали бифидобактерии, бактероиды и эшерихии, наряду с ними в
группу постоянных микроорганизмов входили энтерококки, грибы рода
Candida, тогда как у практически здоровых данные микроорганизмы
являлись представителями транзиторной флоры.
3. В фекалиях и при культивировании В. hominis выявлены цисты, основные
морфологические формы бластоцист: вакуолярные, реже гранулярные, амебоидные клетки обнаружены только в культуре и атипичные безъядерные клетки. Отмечен высокий уровень антиинтерфероновой активности среди штаммов гранулярной и амебоидной форм, что обеспечивает длительную персистенцию данных микроорганизмов.
4. Длительное персистирование в кишечнике макроорганизма Blastocystis
hominis обусловлено выраженной степенью вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активность и степень чувствительности к антипротозойным препаратам. 5. При экспериментальном бластоцистозе показаны изменения морфофункциональных свойств эритроцитов и количественных
показателей лейкоцитов, что свидетельствовало о специфическом
реагировании макроорганизма на внедрение и персистирование
Blastocystis hominis.
6, Персистенция Blastocystis hominis в организме экспериментальных животных сопровождается депрессией клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Апробация работы
Результаты работы доложены и обсуждены на XVIII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова РФ (Казань, 2001), XVIII Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, Краснодар, 2002), VIII Российской гастроэнтерологической неделе (Санкт-Петербург, 2002, 2003), Всероссийской научной конференции «Клещевые и паразитарные болезни» (Санкт-Петербург, 2002), Всероссийской научной конференции «Проблема инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002), Международном Фальк-симпозиуме «GI Inflammation and Disturbtd Gut Function: The Challenge of New Concepts» (Германия, Фрайбург, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно - нарушенных территорий» (Ульяновск, 2003), II Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2003), IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2003), V Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро -2003» (Санкт-Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Роль социальных, гигиенических и биологических факторов в становлении возрастных особенностей здоровья населения» (Пенза, 2003), IV Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая природная среда и экологическое образование и воспитание» (Пенза, 2004), Сибирской зоологической конференции (Новосибирск, 2004), региональной конференции «Экологические и фаунистические исследования в Поволжье»
(Ульяновск, 2004), Выездном пленуме «Новые горизонты гастроэнтерологии» (Новосибирск, Москва, 2004), II Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения» (Ульяновск, 2004), Заседании областного отделения Всероссийского общества эпидемиологов и микробиологов (Ульяновск, 2005).
Публикации
По теме диссертации получены 1 патент на изобретение Российской Федерации, 1 приоритетная справка на изобретение Российской Федерации, 1 удостоверение на рационализаторское предложение, опубликовано 53 работы, в том числе 1 монография, 3 практические рекомендации и 27 статей (в том числе 10 в центральных журналах и 1 в зарубежной печати) и 22 тезиса (Российские и международные конференции, симпозиумы и съезды).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 263 источника и приложений. Диссертация изложена на 307 страницах машинописного текста, иллюстрирована 53 таблицами и 49 рисунками.
Характеристика выделенных штаммов Blastocystis hominis
Следующим этапом работы был анализ встречаемости бластоцист среди обследованных больных с заболеваниями органов пищеварения. Работа проводилась с 1998 по 2004 гг. в бактериологических лабораториях в областной клинической больнице №1, городской больнице №1, больнице скорой медицинской помощи г.Ульяновска.
Проведенные исследования показали, что из 350 больных у 272 (77,71 %) в фекалиях были обнаружены бластоцисты (рис. 4).
Анализ возрастного состава больных, инфицированных В. hominis показал, что эти простейшие чаще обнаруживаются в более позднем возрасте как у лиц мужского, так и женского пола. При этом у больных в возрастной группе от 30 до 45 лет бластоцисты встречались в 92,5 % у мужчин и в 88,37 % у женщин. В возрасте старше 45 лет эти простейшие были выявлены у мужчин в 96,0 %, у женщин в 93,75 % случаев.
Вместе с тем показатель инвазированности простейшими В. hominis у лиц мужского и женского пола не имел существенных различий. Бластоцисты были обнаружены нами у 135 обследованных мужского пола и 137 женского пола, что составляет 79,41 % и 76,11 %, соответственно (рис.
Как видно из таблицы, частота обнаружения бластоцист при различных заболеваниях неодинакова. Наибольшее количество бластоцист выявляли в фекалиях больных язвенной болезнью - 72,22 %, хроническим гастритом -67,21 % и хроническим холециститом - 71,42 %. Однако и при других нозологиях этот показатель был достаточно высок и превышал соответствующее значение в контрольной группе, где бластоцисты были обнаружены лишь в 6,3 % случаев (рис. 6).Таким образом, инфицированность простейшими В. hominis среди лиц, страдающих заболеваниями органов пищеварения составила 62,57 %. При этом существенных различий в обнаружении бластоцист у мужчин и женщин нами обнаружено не было. Вместе с тем прослеживается четкая тенденция роста инфицированности этими простейшими у лиц старших возрастных групп, что, вероятно, связано с инволюционными изменениями организма и снижением иммунорезистентности.
Говоря о нозологической структуре обследованных больных, следует отметить, что при всех хронических заболеваниях органов пищеварения бластоцисты обнаруживаются значительно чаще, чем у лиц контрольной группы. Причем наиболее высокие показатели инфицированности данными простейшими установлены при язвенной болезни - 72,22 %, хроническом гастрите - 67,21 % и хроническом холецистите - 71,42 %. Достаточно высоким остается процент выделения бластоцист и у лиц с другими заболеваниями пищеварительной и гепатобилиарной систем, так, при циррозе печени он составляет 66,66 %, при желчнокаменной болезни - 42,42 %. Вместе с тем лица контрольной группы инвазированы В, hominis лишь в 6,3 % случаев.
6.2.2. Структурные особенности выделенных штаммов Blastocystis hominis В ходе работы нами была изучена морфология выделенных простейших Blastocystis hominis. Исследования показали, что в препаратах, приготовленных из фекалий больных, преобладали бластоцисты размером от 5 до 15 мкм, они составили у мужчин - 65,92 % (89 человек), у женщин 67,88 % (93 человека). Простейшие, диаметр которых был менее 5 мкм, встречались у 26 мужчин и 27 женщин, что составляет (19,26 % и 19,71 % соответственно). Крупные бластоцисты (диаметр более 15 мкм) были обнаружены у мужчин в 14,81 %, у женщин в 12,41 % (табл. 7). Таблица 7 Размеры выделенных бластоцист
На рисунке 7 видно, что соотношение размеров бластоцист у мужчин и женщин существенно не отличается. В препаратах, приготовленных из фекалий больных обоего пола, преобладали бластоцисты размером 5-15 мкм, реже всего встречались простейшие крупных размеров (более 15 мкм). Среди выделенных из фекалий бластоцист встречались две формы -вакуолярная и гранулярная, имеющие значительные структурные отличия. Вакуолярные формы бластоцист обнаруживались в 73,16 %, гранулярные - в 22,06 % случаев, в 4,78 % препаратов встречались обе формы бластоцист. Следует отметить, что при культивировании бластоцист на питательных средах соотношение их форм несколько менялось. Так, при культивировании на среде Suresh в течение 72 часов, гранулярные формы обнаруживались чаще - в 32,72 % препаратов, имело место уменьшение встречаемости вакуолярных форм - в 57,35 % препаратов. Однако преобладающими формами простейших как в препаратах из фекалий, так и из культуры оставались вакуолярные. При длительном культивировании в культуре появлялись амебоидные формы, которые обнаруживались 4,78 % препаратов, приготовленных из культуры. Отмечалось сочетание вакуолярной и гранулярной форм в 2,94 % случаях, вакуолярной и амебоидной форм - в 0,73 % и гранулярной и амебоидной форм - в 1,1 % случаев. Одновременно все три формы простейших встречались в 0,37 % препаратов (рис. 8).
Микробный пейзаж кишечника при различных формах заболевания
Бластоцистоз относится к числу заболеваний, обострение клинических проявлений которого можно связать с сезонными колебаниями погоды (Kain etal, 1987).
Отмечено, что наибольшая обращаемость больных за медицинской помощью наблюдается в декабре, марте, апреле и несколько меньшая в летний период. Поэтому, в соответствии с сезонностью, бластоцистные инвазии характеризуются следующими формами: смешанная, летняя, зимняя, весенне-осенняя, осенне-зимняя, осенняя, весенняя, недифференцированная, весенне-зимняя (рис. 20).
Результаты исследования микрофлоры кишечника в зависимости от форм заболевания представлены в таблице 15.
Анализ микроэкологии кишечника при различных формах бластоцистоза выявил следующую картину. При смешанной форме изменение облигатной микрофлоры микропейзажа кишечника незначительно отличалось от таковых у здоровых лиц (табл. 15).
Уровень содержания бактерий рода Bifidobacterium и Lactobacillus составил lg 8,2±0,2 КОЕ/г (Ig 9,4±0,1 КОЕ/г в контроле; р 0,05) и lg 8,0±0,3 КОЕ/г соответственно (lg 8,9+0,6 КОЕ/г в контроле; р 0,05). По сравнению с контрольной группой наблюдалось значительное снижение содержания микроорганизмов рода Bacteroides (рис. 21 а) - lg 8,4 ±0,2 КОЕ/г (lg 10,1 ±0,1 КОЕ/г; р 0,05).
Следует отметить, что для больных со смешанной формой заболевания являлось характерным снижение содержания кишечной палочки с нормальными ферментативными свойствами до значения lg 6,8 + 0,2 КОЕ/г по сравнению с группой здоровых лиц (lg 7,3 ± 0,3 КОЕ/г). Наряду с этим, у 45 (50,56 %) больных этой группы высевали гемолитические штаммы кишечной палочки (lg 3,3 ± 0,7 КОЕ/г).
Дисбиотические сдвиги в составе облигатной нормофлоры кишечника при смешанной форме сопровождались также выделением бактерий условно-патогенной группы (рис. 21 б). Отмечалось наличие ассоциаций нескольких видов условно-патогенных микроорганизмов. Содержание протей и клебсиелл составило lg 3,4+0,3 КОЕ/г (lg 3,4±0,3 КОЕ/г в контроле) и Ig 3,5 ±0,7 КОЕ/г (Ig 3,3 + 0,5 КОЕ/г в контроле) соответственно. Однако, для больных с данной формой заболевания была отмечена избыточная колонизация дрожжеподобными грибами рода Candida - lg 4,6 ± 0,2 КОЕ/г и энтерококками - lg 6,8 ± 0,1 КОЕ/г.
Частота обнаружения стафилококков не отличалась от группы здоровых лиц - lg 3,8 ±0,3 КОЕ/г. Уровень содержания клостридий был незначительным - lg 5,8 ± 0,5 КОЕ/г.
Анализ результатов изучения микрофлоры кишечника обследованных при летней форме заболевания показал, что дисбиотические сдвиги затрагивали как аэробный, так и анаэробный компоненты кишечного биоценоза (рис. 22 а). При комплексном анализе содержания облигатной микрофлоры было обнаружено, что бифидобактерии, лактобактерии и бактероиды высевались достоверно реже (lg 7,9±0,6КОЕ/г, lg 7,6 ±0,3 КОЕ/г и lg 8,3 + 0,8 КОЕ/г соответственно). Однако, количество обнаруженных эшерихий не отличалось от контрольной группы (lg 7,2+0,2 КОЕ/г). При летней форме заболеваний показатели содержания кишечных палочек с гемолитическими свойствами были самыми низкими (lg 1,9 ±0,1 КОЕ/г). Они были обнаружены лишь у 9,7 % больных.
Значительно чаще в данной группе больных выделяли представителей условно-патогенной микрофлоры (рис. 22 б): Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Candida, Proteus. Так, обращает на себя внимание значительное увеличение уровня содержания энтерококков по сравнению с контрольной группой лиц. Средняя плотность колонизации данных микроорганизмов в кишечнике больных с летней формой составила lg 5,9±0,3 КОЕ/г (lg 3,0 + 0,5 КОЕ/г у здоровых лиц).
Показатели обсемененности стафилококками по сравнению с контрольной группой были повышены - lg 5,0 + 0,6 КОЕ/г (lg 4,2±0,4 КОЕ/г у здоровых). Для протей было характерно возрастание их количества в микропейзаже обследованных больных (lg 4,6±0,2 КОЕ/г, а в контроле - ]g 3,4 + 0,3 КОЕ/г). Дрожжеподобные грибы рода Candida в фекалиях больных составляли - lg 4,4±0,1 КОЕ/г. Klebsiella обнаружены в количестве - lg 5,1 ± 0,5 КОЕ/г (lg 3,3 + 0,5 КОЕ/г у здоровых людей).
Корреляция антиинтерфероновой активности с показателями потагенности Blastocystis hominis
Ранее нами было показано, что бластоцисты обладают разным уровнем патогенности. В связи с этим было проведено изучение зависимости патогенности В. hominis и наличием у них АИА.
В ходе исследований все изученные штаммы бластоцист, выделенные у больных, инфицированных бластоцистами в соответствии с уровнем их патогенности были поделены на 4 группы. У простейших каждой их этих групп определяли антиинтерфероновую активность (табл. 22).
Из таблицы видно, что патогенность бластоцист значительно увеличивалась у штаммов с высокими показателями патогенности. Так, у бластоцист с менее выраженными патогенными свойствами (lg LD50 2,7±0,1 - 3,2±0,3) АИА обладали 6 штаммов из 8, уровень антиинтерфероновой активности у них составил 0-1,0 ед. и лишь у двух 1,1 - 2,0 ед. У бластоцист 2 группы (Ig LD50 3,3±0,1 - 3,7±0,2) слабой антиинтерфероновой активностью обладали 17 штаммов, а более высокой (1,1-2,0 ед.) - 14 штаммов. При повышении патогенности возрастала АИА, так у бластоцист 3 группы с патогенностью lg LD50 3,8±0,3 - 4,3±0,2 антиинтерфероновая активность была выявлена у 47 штаммов. Из них низкий 177 уровень (0-1,1 ед.) АИА обнаружен у 18 изолятов, средний (1,1-2,0 ед.) у 18 и высокий уровень (2,1-3,0 ед.) у
11 штаммов. У штаммов с наибольшей патогенностыо (lg LD50 4,4±0Д - 5,2±0,3) данная активность была еще более выражена. Из 16 изолятов АИА обладали все штаммы простейших. Среди них отмечалась наибольшее количество бластоцист, имеющих наиболее высокие значения антиинтерфероновой активности.
Полученные данные свидетельствуют о том, что антиинтерфероновая активность более выражена у бластоцист, обладающих высокой патогенностью,
Таким образом, антиинтерфероновая активность широко представлена у простейших В. hominis, изолированных у больных, инфицированных бластоцистами. Показатели АИА у бластоцист были неодинаковы. Доля штаммов с низкими значениями АИА составила 62,74 %, со средним уровнем - 38,23 % и с высоким уровнем АИА -18,63 %.
Бластоцисты, выделенные у больных, обладали разными уровнями антиинтерфероновой активности. Наиболее высокие показатели АИА отмечались у бластоцист гранулярной и амебодноЙ форм.
Уровень антиинтерферонового признака коррелировал с показателями патогенносте бластоцист.
Антибиотикорезистентность является одной из важнейших характеристик патогенности микроорганизмов (Смирнова, Сиченко, 1989; Машковский, 2000). В связи с этим, следующим этапом нашей работы явилось изучение чувствительности к антипротозойньш препаратам бластоцист, выделенных у больных с разной продолжительностью заболеваний, а также в зависимости от их стадии - обострение или ремиссия, В качестве антипротозойных препаратов были изучены метронидазол, тинидазол и орнидазол.
Результаты проведенных исследований показали, что в период обострения заболеваний желудочно-кишечного тракта чувствительностью к тинидазолу обладало 52,4 %, а к метронидазолу - 47,8 % изолятов бластоцист. К этим препаратам обнаружено наибольшее количество чувствительных штаммов (58 и 53 соответственно). Менее эффективным оказался орнидазол (рис. 35 а), только 24 штамма (21,6 % изолятов) проявили к нему чувствительность
С целью более полной характеристики чувствительности бластоцист к антипротозоиным препаратам использовали определение минимальной ингибирующей дозы (Zierdt et al., 1983). Для тинидазола и орнидазола она составила 10 3мг/мл, а к метронидазолу бластоцисты были чувствительны даже при разведении 10"4 мг/мл.
В зависимости от величины показателей минимальной ингибирующей концентрации антипротозойных препаратов, все изученные штаммы разделили на чувствительные, умеренно-устойчивые и устойчивые (табл. 23). 10 2 мг/мл и устойчивыми, если рост прекращался при концентрации 1 мг/мл,
Анализ полученных результатов показал, что наибольшее количество чувствительных штаммов выявлено к тинидазолу. Умеренно-устойчивые бластоцисты были обнаружены к данному препарату лишь в 27 % (30 штаммов), а устойчивые - в 20;7 % случаев (23 штамма).
Чувствительность бластоцист к метронидазолу незначительно отличалась от результатов, полученных при изучении предыдущего препарата. Так, 53 штамма (47,8 %) простейших проявили чувствительность к концентрации препарата 10"3-104 мг/мл, 35 штаммов (31,3 %) - умеренную устойчивость. Резистентным к концентрации метронидазола 1 мг/мл оказалось такое же количество штаммов, как и при использовании тинидазола - 23 (20,7 %).
Результаты исследования чувствительности бластоцист к орнидазолу отличались выраженной устойчивостью простейших к данному препарату. Чувствительность к нему была выявлена только у 24 штаммов (21,6 %), но числу умеренно-устойчивых (34,2 %) и устойчивых культур (45 %) данный химиопрепарат превосходил все остальные (рис. 35 б).
Количественные показатели нейтрофилов
В связи с тем, что нейтрофильные гранулоциты играют ведущую роль в механизмах реализации неспецифической резистентности организма, была изучена динамика изменений их количественного содержания у кроликов контрольной и опытной групп. Результаты исследований, представленные в таблице 38 свидетельствуют, что у контрольных животных количество сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови составляло 28,5±0,38х109/л, через неделю после начала эксперимента количественное содержание сегментоядерных нейтрофилов снизилось в 7,1 раза (4,0±0,19х109/л). К концу второй недели от начала эксперимента количественное содержание сегментоядерных нейтрофилов составило 5,5±0,39х10% и в дальнейшем нарастало до шестой-восьмой недели от начала опыта, причем показатели колебались в пределах 12,4+0,60-13,3±0,7х109/л. К десятой неделе началась вторая волна снижения количества сегментоядерных нейтрофилов и показатель составил 6,5±0,51х109/л, с дальнейшим незначительным подъемом к двенадцатой неделе (8,6+0,36x10%) и к четырнадцатой неделе (7,84±0,43х109/л) от начала опыта. Все указанные показатели высоко статистически достоверно отличались от уровня контрольных групп (Р 0,001) (рис. 42 а). Аналогичным колебаниям подвергались показатели относительного количества полиморфноядерных нейтрофилов (табл. 39, рис. 42 б).
Таким образом, установлено, что при инвазии кроликов В. hominis уже к седьмому дню после начала эксперимента происходило выраженное снижение содержания нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови. Однако тот факт, что к четырнадцатой неделе не происходило выраженного снижения количества нейтрофильных гранулоцитов, позволяет предположить, что эти клетки не играли ведущей роли в формировании декомпенсированного вторичного иммунодефицитного состояния.
С целью изучения механизмов формирования нейтропении при экспериментальном бластоцистозе опытных животных было изучено содержание предшественников нейтрофильных гранулоцитов в миелограмме и определен индекс созревания нейтрофилов у контрольных и опытных кроликов.
Как показали проведенные исследования костного мозга, инвазия простейших В. hominis в течение двух недель в желудочно-кишечном тракте приводили к снижению индекса созревания нейтрофилов на 43 %, что составило 0,40±0,02 от исходного уровня (0,74±0,02) и было статистически высоко достоверным (Р 0,001). Через шесть недель индекс созревания нейтрофилов несколько увеличивался, но оставался ниже уровня контроля на 26 % (0,55+0,03) (Р 0,001). В последующие сроки наблюдений отмечалось дальнейшее достоверное уменьшение индекса: через восемь недель на 45,7 % (0,38+0,02), через десять недель на 71 % (0,2±0,02). На двенадцатой неделе зарегистрировано незначительное, статистически достоверное (Р 0,001) увеличение индекса созревания нейтрофилов- 0,44±0,02, однако этот индекс был ниже исходного уровня на 37 %. Повышение индекса было непродолжительным, и в последующие недели он снова начал снижаться.
Таким образом, результаты исследований показали, что простейшие В. hominis обладают непосредственным ингибирующим действием на процессы миелопоэза, а именно его нейтрофильного ростка, что и является причиной нейтропении периферической крови.
Учитывая определяющую роль лимфоцитов, как клеток-эффекторов иммунного ответа, с целью изучения динамики изменений иммунных показателей было исследовано содержание этих клеток в крови опытных животных в динамике эксперимента. Результаты исследований представлены в таблице 40.
Как видно из таблицы на первой неделе количество лимфоцитов у экспериментальных животных составило 18,7±0,8х109/л, что было в 2,4 раза более низким, чем у контрольных кроликов. На второй неделе абсолютное количество лимфоцитов периферической крови в экспериментальной группе составило 46,7±1,4х109/л, что достоверно не отличалось от показателя содержания лимфоцитов у контрольных животных. В дальнейшем произошло нарастание содержания абсолютного количества лимфоцитов в крови опытных кроликов. Так, на четвертой неделе содержание лимфоцитов в опытной группе превышало показатель контроля в 1,36 раза, на шестой неделе- в 1,7 раза, на восьмой неделе- в 1,85 раза, на десятой- в 2,3 раза. После десятой недели абсолютное количество лимфоцитов в периферической крови опытных кроликов начало снижаться к двенадцатой неделе 99,5±1,8х109/л, что было в 1,96 раза выше, чем у кроликов контрольной группы. К четырнадцатой неделе наблюдения достоверных различий между опытной и контрольной группами по этим показателям не было (рис. 43 а).
Динамика относительного количества лимфоцитов в целом повторяет динамику изменений абсолютного содержания лимфоцитов у опытных животных (табл. 41, рис. 43 б).
Таким образом, анализ динамики изменений общего количества лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов свидетельствует о том, что в первую неделю экспериментального бластоцистоза, вероятно, В. hominis оказывают ингибирующее действие на белый росток крови, что проявляется в абсолютной лейкопении, нейтропении и лимфопении. Это дает возможность предположить, что в основе этого процесса также лежит изменение компенсаторных механизмов под влиянием простейших В. hominis.
Начиная с шестой и по десятую неделю эксперимента, отмечается статистически достоверное увеличение общего количества лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов, что свидетельствует об адаптационной перестройке организма экспериментальных животных. Однако, в последующем происходит истощение адаптационных резервов и начиная с десятой недели развивается явление деадаптации.
Эти данные подтверждаются показателями лимфоцитарно-нейтрофильного индекса, который служит показателем для объяснения развития адаптационной реакции организма. Индекс вычисляется по процентному отношению содержания лимфоцитов к сегментоядерным нейтрофилам в лейкоцитарной формуле (табл. 42). Вычисление лимфоцитарно-нейтрофильного индекса у опытных и контрольных животных указывает, что первая неделя от начала введения бластоцист соответствует начальной фазе адаптации- ЛФ/СН=4,7±0,3 % (Р 0,001) с последующей активацией адаптационной реакции, пик которой приходится на десятую неделю от начала эксперимента. Индекс в это время составил 17,2±0,2 % (Р 0,001). В дальнейшем происходит истощение механизмов адаптации и лимфоцитарно-нейтрофильный индекс снижается (рис. 44 а).
