Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Патологии, вызываемые бластоцистами 11
1.2. Экология бластоцистоза 19
1.3. Морфофункциональная организация бластоцист 25
1.4. Нормальный микробиоценоз кишечника и его нарушения 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 45
ГЛАВА 3. Клиническая характеристика обследованных больных.. 60
3.1. Выделение клинических изолятов простейших B.hominis.. 60
3.2. Характеристика кишечного микробиоценоза здоровых людей 64
3.3. Микроэкологическая характеристика кишечного биоценоза людей при бластоцистозе 68
3.4. Характеристика кишечного микробиоценоза людей, ин-вазированных бластоцистами 72
3.5. Пространственная структура и иерархия экологических групп в кишечном микробиоценозе здоровых людей и инвазированных бластоцистами 75
ГЛАВА 4. Биологические свойства простейших B.hominis 83
4.1. Морфологическая организация бластоцист. 83
4.2. Культуральные свойства простейших B.hominis 90
4.3. Патогенность клинических изолятов бластоцист 92
4.4. Энтеротоксическая активность простейших B.hominis 95
ГЛАВА 5. Экспериментальная модель бластоцистоза 102
5.1. Воспроизведение кишечного бластоцистоза 102
5.2. Изменение микрофлоры кишечника при экспериментальном бластоцистозе 106
5.3. Количество лейкоцитов в периферической крови у экспериментальных животных 112
5.4. Морфологические изменения толстой кишки опытных животных при экспериментальном бластоцистозе 115
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 118
ВЫВОДЫ 130
ЛИТЕРАТУРА 131
- Выделение клинических изолятов простейших B.hominis..
- Морфологическая организация бластоцист.
- Воспроизведение кишечного бластоцистоза
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время широкое распространение получила «новая» протозойная инфекция - бластоцистоз, обусловленная паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocystis hominis (F.RReinthaler et al, 1988; C.H.Ziert et al., 1988; Н.А.Чайка, 1992).
Исследованиями C.H.Zierdt et al. (1967, 1978, 1988, 1991) была впервые установлена протозойная природа B.hominis, определена их таксономия, получены указания на возможную этиологическую роль этих микроорганизмов в возникновении оппортунистической инфекции - бластоци-стоза у лиц с иммунной недостаточностью, названное болезнью Зиердта-Гаравелли (Н.А.Чайка, 1992).
В России протозойная природа бластоцист была подтверждена Л.М.Беловой (1992) и Т.В.Сахаровой (1999). Однако, эти исследования проводились авторами на основании обследований различных видов диких и домашних животных. В отечественной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные изучению распространения бластоцист у людей (Н.П.Торопова, Н.А.Сафронова с соавт., 1998).
До недавнего времени B.hominis не рассматривались как этиологический фактор патологических состояний человека. Более того, некоторые исследователи вообще сомневались в патогенных потенциях B.hominis и считали бластоцитоз не заболеванием, а безвредным транзиторным носи-тельством непатогенных микроорганизмов (A.M.Johnson et al., 1989; C.H.Zierdt., 1991). Заболевания, вызванные B.hominis, обычно рассматривали как экзотические протозойные инфекции, связанные с путешествиями в тропические и субтропические страны (E.K.Markell, M.P.Udkow,1986; Н.А. Чайка, 1992; P.Lendry et al., 1997).
В то же время, и в странах с умеренным климатом поражения кишечника, обусловленные B.hominis, вовсе не так уж редки, как об этом думали совсем недавно. В настоящее время эти паразиты обнаружены не только в Африке и Азии, но и в Европе, Северной и Южной Америке, Австралии, то есть расселение В. hominis можно считать всесветным (R.Mercado et al., 1991; I.Kobayashi et al., 1995). В последние годы накопилось достаточное количество эпидемиологических и клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих как потенциальную, так и реальную этиологическую роль B.hominis в патологии человека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма. Основными клиническими проявлениями бластоцистоза являются диарея и абдоминальные боли. Заболевание развивается по типу энтерита, энтероколита или колита (P.L.Garavelli et al., 1991; O.Cirioni et al., 1999).
Многочисленные сообщения убедительно свидетельствуют об этиологическом и патогенетическом значении бластоцист в развитии диарейно-го синдрома. Так, например, проведенное в 1986 году в Югославии целенаправленное паразитологическое исследование подтвердило высокую частоту обнаружения бластоцист при хронических заболеваниях, когда диарей-ный синдром имел рецидивирующее течение и продолжался не менее одного месяца (J.Logar et al., 1994; C.Camli et al., 1999).
Особенно актуальной проблема бластоцистоза становится в связи с резким увеличением числа ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, так как у иммунокомпрометированных людей B.hominis легко вызывают хронические поражения пищеварительной системы (J.M.Llibre et al., 1989; O.Brandonisio et al., 1999; K.N.Prasad et al., 2000).
Естественным резервуаром бластоцист являются, вероятно, животные, так как нередко обнаруживаются у птиц и млекопитающих, особенно у человекообразных обезьян (M.Soledad Gomez, et al., 1996; A.Duda et al., 1998), они же часто являются источником заражения человека.
Способность реализовывать патогенность B.hominis убедительно доказана при интрацекальном введении паразитов экспериментальным животным, а также в опытах на безмикробных морских свинках (B.P.Philips, C.H.Zierdt, 1976; E.Markell et al., 1986). У всех животных развивалась не только колонизация, но и инвазия кишечника бластоцистами, сопровождающиеся диареей.
В настоящее время накоплен большой фактический материал о роли микрофлоры в жизнедеятельности человека (О.В.Чахава с соавт., 1982; В.Ф.Коляденко с соавт., 1988; С.И.Сытник, 1992). Известно, что наружные покровы и слизистые оболочки организма с первых мгновений жизни обсеменяются микроорганизмами, численность и разнообразие которых определяется множеством факторов внутренней среды организма и внешнего окружения. Несмотря на это, существуют индивидуальная и анатомическая специфичность состава микроорганизмов, населяющих конкретный биотоп. Она является залогом динамической стабильности микрофлоры и способствует поддержанию надлежащего уровня барьерных функций кожи и слизистых оболочек (В.С.Крамарь, 1966, 1971; И.М.Миронов с соавт., 1986; Г.И.Гончарова с соавт., 1987; И.А.Бочков с соавт., 1991).
Современные представления о микрофлоре как о совокупности микробиоценозов (С.И.Сытник, 1991) требуют поиска биоценотических подходов к ее оценке. Несмотря на образование новой науки микроэкологии, рассматривающей надорганические уровни организации бактерий, реализация ее принципов характеристики микробных экосистем кишечника ограничивается популяционным уровнем и редко затрагивает изучение микробных сообществ и биоценозов. К тому же имеющиеся сообщения не затрагивают влияния простейших на микроэкологию кишечника.
Анализ литературы, посвященной B.hominis и вызываемым ими заболеваниям, свидетельствует о превалировании работ, носящих эпидемиологический характер. До настоящего времени остаются не изученными
многие биологические свойства бластоцист, том числе, определяющие их патогенно сть, а также их действие на микробиоценоз кишечника. Само заболевание до сих пор остается известным лишь узкому кругу специалистов.
Вышеизложенное свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения биологических свойств B.hominis, а также механизмах их воздействия на макроорганизм.
ЦЕЛЬ: Определение биологических свойств простейших Blastocystis hominis и их влияния на микроэкологию кишечника.
ЗАДАЧИ:
Выявить частоту встречаемости B.hominis в кишечнике больных и практически здоровых людей;
Изучить структурные особенности морфологических форм бластоцист и их соотношение в исследуемом материале;
Исследовать выраженность патогенных свойств клинических изо-лятов B.hominis;
Выявить наличие энтеротоксической активности бластоцист;
Дать экологическую оценку микрофлоры кишечника в норме и при патологии пищеварительного тракта.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:
Впервые показана высокая степень инвазивности простейшими В. hominis больных с патологией органов пищеварения.
Определена степень патогенности клинических изолятов B.hominis, выраженность которой коррелировала с тяжестью вызываемого ими кишечного бластоцистоза.
Выявлено наличие у патогенных бластоцист энтеротоксической активности, подтвержденной:
дилатацией изолированных сегментов тонкой кишки кроликов;
наличием в них экссудата, нередко с примесью слизи и крови;
- патоморфологическими изменениями стенок зараженных сегмен
тов.
Установлено, что вакуолярные формы бластоцист вызывают экспериментальный кишечный бластопистоз, сопровождающийся:
развитием внешних признаков инфекционного процесса;
увеличением количества лейкоцитов в периферической крови;
дисбиотическими изменениями микрофлоры толстой кишки;
патоморфологическими изменениями толстой кишки.
Дана сравнительная характеристика экологической оценки микробиоценоза кишечника в норме и при инвазии бластоцистами, свидетельствующая об их участии в нарушении биоценотических связей.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:
Высокая выявляемость B.hominis при таких заболеваниях, как язвенная болезнь, хронический гастрит и хронический гепатит (В, С) позволяет рассматривать бластоцисты как этиопатогенетический ко-фактор развития данных патологий, что предполагает возможную эффективность применения антипротозойных препаратов в их лечении.
Высокая выявляемость бластоцист при заболеваниях пищеварительного тракта диктует необходимость широкого внедрения в практику лабораторий практического здравоохранения исследований по выделению и идентификации данных простейших.
Различная степень выраженности патогенных свойств клинических изолятов B.hominis свидетельствует о неоднозначности их участия в развитии патологического процесса, что следует учитывать при диагностических исследованиях.
Результаты исследований позволяют совершенствовать процесс преподавания по курсу биологии, медищшской микробиологии и смежных дисциплин.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Простейшими Blastocystis hominis инфицировано 68,75% обследованных с хроническими заболеваниями органов пищеварения. Существенных различий в инфицированности между мужчинами и женщинами, а также взрослыми и детьми не обнаружено.
В клиническом материале и в культуре выявлены вакуолярные, реже гранулярные формы, амебоидные клетки обнаружены только в культуре.
Клинические изоляты B.hominis имели патогенные свойства различной степени выраженности, что свидетельствует об их неодинаковой этиологической значимости в развитии патологического процесса.
Blastocystis hominis обладают энтеротоксической активностью, что, по-видимому, является чрезвычайно важным фактором в развитии кишечного бластоцистоза.
5. Инвазия кишечника бластоцистами сопровождается глубокими
изменениями микробиоценоза данного биотопа, что выражается увеличе
нием частоты встречаемости транзиторной микрофлоры на фоне снижения
доминирования и флористической значимости основных симбионтов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы работы были доложены на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы педиатрии и детской хирургии» (Ульяновск, 2000), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам (Москва, 2000), Научно-практической конференции "Новые технологии в медицине" (Ульяновск, 2000), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно - нарушенных
территорий» (Ульяновск, 2000), Второй российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орел, 2001), XXXVI научно - практической конференции, посвященной 200-летию Ульяновской ОКБ №1 (Ульяновск, 2001), Заседании областного отделения всероссийского общества эпидемиологов и микробиологов, Ульяновск, 2002.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.
ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 147 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Библиография содержит 181 источник, из них 50 отечественных и 131 иностранных. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 21 рисунком.
Выделение клинических изолятов простейших B.hominis
Для решения поставленных задач нами проведено клинико-лабораторное обследование больных с заболеваниями органов пищеварения. Наблюдение проводилось с 1998 по 2002 гг. в бактериологических лабораториях областной клинической больницы №1, городской больницы №1, больницы скорой медицинской помощи г. Ульяновска.
При выполнении работы было обследовано 240 человек, из них 160 человек находились на стационарном лечении с диагнозами: язвенная болезнь (19,37%), хронический гастрит (15,62%), хронический холецистит (7,5%), цирроз печени (6,87%), желчно-каменная болезнь (9,38%), опухоль ободочной кишки (0,63%), синдром раздраженной кишки (11,25%), неспецифический язвенный колит (12,5% ), хронические гепатиты (В, С) (15,62%) и синдром оперированного желудка (1,25%).
Контрольную группу составили 80 практически здоровых лиц обоего пола в возрасте от 3 до 45 лет (табл.5). Все наблюдаемые лица этой группы до начала обследования проходили клинический осмотр и анкетирование. Критерием отбора служило отсутствие хронических и острых заболеваний на момент обследования, длительность проживания в городе не менее 10 лет, отрицание использования антибактериальных препаратов в течение последних 3-х лет.
Анализ возрастного состава показал, что среди обследованных (160 человек) 50% составили дети (80 человек) , взрослые в возрасте от 30 до 40 лет - 29,4% (47 человек) и старше 40 лет - 20,6% (33 человека).
Морфологическая организация бластоцист
Амебоидная форма бластоцист встречалась только в препаратах (6,3%) из длительно хранящихся культур, что видимо связано с изменяющимися свойствами питательной среды (изменение рН среды, окислительно-восстановительного потенциала и др.). Эта форма характеризуется наличием 1-2 псевдоподий, видимо участвующих в поступательном движении. Размеры клеток варьировали от 5 до 16 мкм, каждые из них имели одно, два ядра.
Микроскопические исследования фекалий после формалин эфирного осаждения по Ритчи в модификации Аллена-Ридли показали наличие цист. Они имели округлую форму, размером 2-5 мкм. При окраске раствором Люголя цисты окрашивались в светло-коричневый цвет.
Таким образом, изучение морфологических особенностей бластоцист выявило наличие в клиническом материале вакуолярной и гранулярной форм, а так же цист этих простейших, что согласуется с данными C.Zierdta et al, (1967), Т.В.Сахаровой (1997).
В клиническом материале преобладали вакуолярные формы. На их долю приходилось 84,5%. Такие же результаты были получены Н.А.Чайкой (1992). Характерной особенностью вакуолярной формы бластоцист являлось наличие центрального тела, функции которого до настоящего времени обсуждаются. Нами установлено, что простейшие в которых центральное тело занимало более 90% всей клетки составили 24,73%; 70% - 68,8% клетки и менее 70% - 6,45% от общего количества ва-куолярных форм, что подтверждается работами Mac Queen (1994).
Отмечено большое количество многоядерных особей. Исследования показали преобладание фрагментированных ядер над плотными. Это хорошо было видно при окраске по Романовскому, что согласуется с данными Т.В.Сахаровой (1997). Выявлено полярное расположение ядер бластоцист, что свидетельствует о синхронности протекающего в клетке процесса митоза. Аналогичные результаты получены у Mac Pherson D., Mac Queen W (1994). В препаратах, также как Т.В.Сахарова (1997), мы наблюдали делящиеся бластоцисты, имеющие гантелевидную форму.
Гранулярная форма бластоцист также обнаруживалась, как в фекалиях (15,5%), так и в культурах (22,7%), однако в препаратах, приготовленных из культуры эта форма встречалась чаще. Клетки имели сферическую форму, содержали большое количество гранул. Согласно данным литературы размеры этой формы варьируют от 6,5 до 25 мкм (C.Zierdt, 1983). В наших исследованиях диаметр клеток также составлял от 7 до 15 мкм.
Амебоидные формы бластоцист нами обнаружены только в культуре (6,3%), причем при хранении культуры, количество амебоидных форм увеличивалось, что отмечено в работах Т.В.Сахаровой (1997). Однако нам не удалось обнаружить у амебоидных форм центрального тела, на наличие которых указывают H.Mac Cleur et al. (1998).
Воспроизведение кишечного бластоцистоза
Анализ литературы указывает на то, что B.hominis заражены люди всех возрастов (R.A.Devera et al., 1997). По данным (RGaravelli, 1990) бла-стоцисты обнаруживают у пациентов в возрасте от 15 до 86 лет, другие исследователи нашли бластоцисты даже у детей в возрасте 8 лет (R.A.Devera et al., 1998; Z.Rivero-Rodriguez et al., 2000; H.Arienti., 2000).
Собственные исследования показали, что из 160 больных у ПО (68,75%) в фекалиях были обнаружены бластоцисты. Инфицированность бластоцистами у обследованных с различными заболеваниями была неодинакова. Наибольшее количество бластоцист определялось в фекалиях больных язвенной болезнью (22,72%), хроническим гастритом (16,36%) и хроническим гепатитом (15,45%).
Данные о распределении больных бластоцистозом по возрасту и полу противоречивы (K.C.Kain et al.,1987). По данным Н.А.Чайки (1992) у мужчин B.hominis обнаруживаются чаще, чем у женщин, а взрослые болеют бластоцистозом реже, чем дети. Анализ возрастного состава обследованных нами пациентов (160 человек) показал, что 50% из них составили дети (80 человек), взрослые в возрасте от 30 до 40 лет - 29,4% (47 человек) и старше 40 лет - 20,6% (33 человека). Среди взрослых 55% приходилось на лица мужского пола (44 человека) и 45% - женского пола (36 человек). Как видно существенных различий в инфицированности между мужчинами и женщинами, а также взрослыми и детьми нами не обнаружено.
При выявлении B.hominis в каждом случае необходимо провести параллельное бактериологическое исследование. Это позволит исключить или, напротив, подтвердить диагноз смешанной (двойной) инфекции с участием ротавирусов или энтеропатогенных бактерий. В наших исследованиях из всех инфицированных детей в 23,6% случаях (26 человек) наряду с бластоцистами в фекалиях обнаруживались лямблии.
Литературные данные и результаты собственных исследований свидетельствуют, что бактериальная колонизация представляет собой сложное многофакторное явление. Изучение бактериальной обсемененности кишечника 240 человек позволили выявить характерные закономерности внутрибиотического распределения микроорганизмов, а также дать сравнительную экологическую интерпретацию микробиоценозов практически здоровых людей и инвазированных бластоцистами. Следующим этапом нашей работы явилось изучение микробной флоры 80 практически здоровых людей в возрасте от 3 до 45 лет. При микроскопическом и культураль-ном исследовании фекалий, зараженность бластоцистами в данной группе составила 5% (4 человека), что значительно ниже аналогичного показателя у людей с патологиями желудочно-кишечного тракта. Проведенные исследования дали основание считать, что микрофлора практически здоровых людей стабильна и представлена в основном бифидо- (100%), лактобакте-риями (100%), эшерихиями (100%) и бактероидами (65%), обсеменность которых составила- 9,3±0,1 КОЕ/г, 8,8+0,6 КОЕ/г, 7,4±0,3 КОЕ/г и 10,3+0,1 КОЕ/г, соответственно. Довольно часто в микрофлоре здоровых людей регистрировались условно-патогенные бактерии: энтерококки (17,5%), энте-робактерии (21,25%), грибы рода Candida (27,5%) и стафилококки (20%). Однако обсемененность этими микроорганизмами была весьма незначительной и средняя арифметическая величина составила lg 3,9+0,1 КОЕ/г.
С целью определения влияния простейших B.hominis на микробиоценоз кишечника, изучена микрофлора людей с патологиями желудочно-кишечного тракта, инфицированных бластоцистами. Установлено резкое уменьшение количества бифидобактерий (до 74,5%) , лактобацилл (до 80%). В большинстве наблюдений в формировании микробиоценоза принимали активное участие условно-патогенные бактерии. Среднее содержаниє условно-патогенных энтеробактерий в кишечнике больных, инфицированных бластоцистами определено как lg 6,47±0,1 КОЕ/г. Довольно часто, регистрировались дрожжеподобные грибы рода Кандида (28,8%), при этом средняя арифметическая величина обсемененности была весьма значительной (lg 6,3±0,7 КОЕ/г).
Необходимо отметить, что при патологии желудочно-кишечного тракта, отягощенного инфицированием простейшими B.hominis высев стафилококков был намного выше и составлял - lg 5,7+0,1 КОЕ/г. Энтерококки обнаруживались у 64 обследованных (58,2%) этой группы в максимальном количестве lg 7,7+0,5 КОЕ/г испражнений.
