Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы межмикробных взаимоотношений симбионтов при формировании микросимбиоценоза (обзор литературы) 14
1.1. Антагонистическая активность доминантной микрофлоры и ее регуляция 14
1.2. Модификация биологических свойств микроорганизмов в их ассоциации 23
1.3. Роль сигнальных молекул в межвидовых и внутривидовых взаимоотношениях микроорганизмов 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе 50
2.2. Методика определения состояния микробиоценоза кишечника 51
2.3. Методы выделения и идентификации микроорганизмов 53
2.4. Методы изучения биологических свойств бактерий и грибов 55
2.4.1. Изучение антилизоцимной активности микроорганизмов 55
2.4.2. Определение антилактоферриновой активности микроорганизмов 57
2.4.3. Определение антикомплементарной активности микроорганизмов 59
2.4.4. Определение антикарнозиновой активности бактерий 60
2.4.5. Методика определения «антиинтерфероновой» активности бактерий и грибов 61
2.4.6. Методика определения антицитокиновой активности микроорганизмов 62
2.4.7. Метод изучения биопленкообразования микроорганизмов 63
2.4.8. Определение антагонистической активности бактерий 64
2.4.9. Метод определения бактериоциногенной активности микроорганизмов 65
2.4.10. Определение гемолитической активности микроорганизмов 66
2.4.11. Методика определения липолитической активности микроорганизмов 66
2.4.12. Выявление ДНК-азной активности микроорганизмов 67
2.4.13. Выявление плазмокоагулазной активности микроорганизмов 67
2.4.14. Выявление лизоцимной активности микроорганизмов 67
2.4.15. Методика определения антибиотикочувствительности исследуемых культур бактерий 68
2.4.16. Методы изучения биоритмов микроорганизмов (на примере ростовых свойств) 69
2.5. Методы изучения влияния препаратов алкилоксибензолов на биологические свойства микроорганизмов 69
2.6. Методы изучения взаимного влияния бифидобактерий и микроорганизмов-симбионтов на их биологические свойства 71
2.7. Метод определения «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека 73
2.8. Метод изучения популяционной структуры микроорганизмов 75
2.9. Методы статистической обработки полученных результатов 75
Глава 3. Микросимбиоценоз кишечника человека - биологическая система, его видовая структура и системообразующий фактор 77
Глава 4. Характеристика межмикробных взаимоотношении пары «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека 121
Глава 5. Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека 155
Глава 6. Некоторые механизмы адаптации микросимбионтов при ассоциативном симбиозе человека 196
6.1. Влияние микробных ауторегуляторов-адаптогенов на популяцию доминантных и ассоциативных микросимбионтов 196
6.2. Антицитокиновая активность микроорганизмов 209
6.3. Регулирующее воздействие ассоциативных микросимбионтов на суточную динамику ростовых и персистентных свойств микроорганизмов 217
6.3.1. Суточная динамика роста/размножения микроорганизмов в микросимбиоценозе 218
6.3.2. Суточная динамика антилизоцимной активности микроорганизмов в микросимбиоценозе 224
6.3.3. Суточная динамика биопленкообразования микросимбионтов при их взаимодействии в микросимбиоценозе 231
Заключение 246
Выводы 262
Список литературы 264
Приложение 301
- Модификация биологических свойств микроорганизмов в их ассоциации
- Микросимбиоценоз кишечника человека - биологическая система, его видовая структура и системообразующий фактор
- Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека
- Влияние микробных ауторегуляторов-адаптогенов на популяцию доминантных и ассоциативных микросимбионтов
Введение к работе
Актуальность проблемы. В концепции ассоциативного симбиоза, включающей три вектора («хозяин – доминант»; «хозяин – ассоциант»; микросимбиоценоз), одним из наименее изученных является микросимбиоценоз, функционирующий как полимикробное сообщество одновременно взаимодействующее с организмом хозяина, и определяющее, в конечном итоге, его функциональное состояние. При заселении биотопов человека между микроорганизмами складываются различные взаимоотношения, которые определяются качественной и количественной характеристикой микробного пейзажа (Несвижский Ю.В. и др., 1997). Популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения – конкурентные или кооперативные, при заселении различных биотопов макроорганизма формируют специфический «микросимбиоценоз» (Проворов Н.А., 2001; Бухарин О.В. и др., 2006). Под микросимбиоценозом понимается открытая саморегулирующаяся система, представленная совокупностью популяций микроорганизмов аутохтонных и аллохтонных видов, находящихся в сложных взаимосвязях, исход которых определяет гомеостаз хозяина.
Как любая живая система – микросимбиоценоз является как открытой системой, где микросимбионты осуществляют обмен веществ и энергии с окружающей средой, так и самоуправляемой, саморегулирующейся системой, перерабатывающей информацию для поддержания своей структуры и управления процессами метаболизма (Новосельцев В.Н., 1978).
Микробиота желудочно-кишечного тракта по праву является уникальной моделью для изучения межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе, поскольку является динамической равновесной системой организма хозяина и населяющей его доминантной и ассоциативной микрофлорой. В кишечнике человека доминантную микрофлору представляют бифидобактерии, которые занимают одно из лидирующих по численности положений среди представителей индигенной микрофлоры (Gomes A.M.P., Malcata F.X., 1999; F., J.-R., 2003), формируя колонизационную резистентность хозяина за счет продукции антимикробных субстанций и стимуляции факторов врожденного и приобретенного иммунитета хозяина против патогенов (Deplancke B. et. al., 2002; Macfarlane S. et. al., 2002).
Вторжение посторонней (чужеродной) ассоциативной микрофлоры может нарушить гомеостаз хозяина за счет изменения межмикробных взаимоотношений в микросимбиоценозе, что приводит к формированию хронических очагов персистирующей инфекции.
Как известно, взаимоотношения между микросимбионтами при формировании микросимбиоценоза базируются на различных каналах связи, включающие: клеточные взаимодействия (Kolenbrander P. E., 2000; Palmer R. J. et. al., 2001), генетический обмен (Li J. et. al., 2001) и выработка сигнальных метаболитов (Кrisanaprakornkit S. et. al., 2000; Fong K. P. et. al., 2001; Burgess N. A.et. al., 2002).
Однако открытым остается вопрос о механизмах межмикробных взаимоотношений доминантных бактерий с ассоциантами. Не выяснены основные физиологические функции микрофлоры, определяющие системообразующий фактор микросимбиоценоза. Как удается представителям индигенной микрофлоры распознать «чужеродную информацию» ассоциантов, нарушающих гомеостаз инфицированного хозяина при ассоциативном симбиозе? Наконец, какова роль регуляторных сигнальных метаболитов микросимбионтов, участвующих в поддержании колонизационной резистентности организма?
Указанные моменты и предопределили тематическую направленность наших исследований, которые могли бы способствовать раскрытию патогенетических механизмов межмикробных взаимоотношений в микросимбиоценозах организма человека и изысканию новых подходов к поиску препаратов пригодных для борьбы с персистирующей патогенной микрофлорой.
Цель и задачи исследования
Цель исследования - изучить механизмы регуляторных взаимодействий микросимбионтов, определяющие функционирование микросимбиоценоза дистального отдела толстого кишечника человека.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Выявить информативные биологические характеристики микроорганизмов («биомишени» их взаимодействия) в условиях ассоциативного симбиоза человека и определить системообразующий фактор формирования микросимбиоценоза по информативным биологическим параметрам микросимбионтов.
-
Охарактеризовать взаимодействия микроорганизмов в системе «доминант-ассоциант» под контролем важнейших биологических характеристик адаптации микросимбионтов.
-
Разработать способ определения «свой-чужой» на основе особенностей взаимодействия доминантных и ассоциативных микросимбинтов в микросимбиоценозе дистального отдела толстого кишечника человека.
-
Изучить роль мембранотропных ауторегуляторов в формировании адаптивных реакций микроорганизмов в микросимбиоценозе дистального отдела толстого кишечника человека.
-
Оценить распространенность и выраженность способности микроорганизмов взаимодействовать с про- и противовоспалительными цитокинами.
-
Определить хронобиологические особенности взаимодействия микроорганизмов в микросимбиоценозе под контролем их ростовых свойств и персистентных характеристик.
Новизна исследования. Сформулировано определение, согласно которому, микросимбиоценоз – единая динамическая система, обладающая выраженной способностью к ауторегуляции и аутостабилизации, состоящая из многовидовых консорциумов микроорганизмов, образующих симбиотические связи между собой и макроорганизмом с целью создания благоприятных условий для своей жизнедеятельности и оказывающих непосредственное влияние на состояние здоровья организма хозяина.
Установлено, что рост/размножение, биопленкообразование и антилизоцимная активность, как базовые физиологические характеристики адаптации микроорганизмов при ассоциативном симбиозе человека, наиболее значимы в функционировании микросимбиоценоза, определяя его системообразующий фактор.
Показана универсальность персистентных признаков микросимбионтов, включая биопленкообразование, что определяет использование их в качестве «биомишени» как для исследования межмикробных взаимоотношений в условиях микросимбиоценоза, так и для изучения и отбора биопрепаратов, пригодных для борьбы с патогенами.
Регуляторная функция экзометаболитов бифидофлоры при взаимодействии с ассоциантами основана на их плейотропном действии: способности в зависимости от их концентрации либо изменять рост/размножение условно-патогенных микроорганизмов, либо модифицировать их персистентные свойства, стимулируя основные физиологические функции у представителей нормофлоры, и угнетая у микроорганизмов, характерных для дисбиоза кишечника человека.
Рассмотрение межмикробных взаимоотношений с позиции ассоциативного симбиоза выявило способность доминантной микрофлоры (бифидобактерий) модифицировать персистентный потенциал ассоциантов, отражая их взаимодействие внутри микросимбиоценоза и с организмом хозяина.
Экспериментально выявлен феномен микробного распознавания «свой – чужой» на основе оппозитных (усиление/подавление) взаимодействий на ростовые и персистентные свойства пары микросимбионтов («доминант – ассоциант») в условиях микросимбиоценоза. Разработанный алгоритм микробного распознавания в микросимбиоценозе кишечника человека позволил построить математическую модель, с помощью которой была осуществлена как межвидовая, но и внутривидовая дифференцировка «своих» и «чужих» штаммов микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант».
Определено влияние мембранотропных эндогенных метаболитов (гомологов алкилоксибензолов) на диссоциацию популяции индигенных бактерий биотопа дистального отдела толстого кишечника человека, как один из механизмов адаптации доминантной микрофлоры к стрессовым воздействиям (изменение условий их окружения в микросимбиоценозе). Обнаруженная видонеспецифичность алкилоксибензолов - свидетельство возможности их использования микроорганизмами как во внутривидовых, так и в межвидовых взаимоотношениях симбионтов в условиях микросимбиоценоза.
Впервые определена антицитокиновая активность (АЦА) микроорганизмов и выявлена ее регуляторная роль в отношении как про- так и противовоспалительных цитокинов. Более высокие значения АЦА были характерны для доминантов (бифидобактерий и лактобацилл), в сравнении с ассоциантами, что может обуславливать адаптацию представителей нормофлоры в организме хозяина.
Изменение ритмометрических показателей микроорганизмов при воздействии экзометаболитов ассоциантов – показатель адаптивной реакции микрофлоры в условиях микросимбиоценоза.
Практическая ценность работы. Получены новые данные, расширяющие теоретические представления о симбиотических взаимодействиях доминантов с ассоциантами в микросимбиоценозе дистального отдела толстого кишечника человека. Эти материалы позволяют использовать важнейшие физиологические функции выживания микроорганизмов не только для исследования механизмов формирования микросимбиоценоза, но и для отбора препаратов пригодных для коррекции дисбиотических изменений биотопов.
Полученный штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК № 278 – продуцент ингибитора лизоцима (Патент РФ на изобретение № 2321632, опуб. 10.04.2008) используется в качестве тест культуры при изучении межмикробных взаимодействий в микросимбиоценозе и оценке влияния препаратов на персистентный потенциал патогенов в работе научно-исследовательских лабораторий.
Разработана математическая модель микробного распознавания микросимбионтов с использованием в качестве тестовых культур бифидобактерий (штаммов B. longum), может быть использована для дифференциации «своих» и «чужих» видов микроорганизмов при ассоциативном симбиозе человека.
Определение популяционной структуры микроорганизмов под действием биотических и абиотических факторов пригодно для изучения межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе человека, а также для отбора и тестирования различных препаратов в экспериментальных исследованиях.
Результаты работы по изучению влияния алкилоксибензолов на популяции микроорганизмов можно использовать для решения прикладных задач биотехнологии с целью повышения эффективности культивирования и сохранения производственных штаммов пробиотических бактерий.
Представленные данные - составная часть темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в различных биологических системах» (№ гос. регистрации 0120.0 600145) и «Лекарственная регуляция персистентного потенциала микроорганизмов» (№ гос. регистрации 0120.0 853339); программы Президиума РАН №21 «Фундаментальные науки – медицине» «Механизмы формирования и регуляция ассоциативного симбиоза человека» (09-П-4- 1007); целевой программы интеграционных проектов УрО РАН «Выявление биомишеней и разработка способов регуляции персистентного потенциала микроорганизмов» (09-И-4-3001).
Фундаментальные результаты диссертационного исследования включены в итоговые отчеты УрО РАН и Отделения биологических наук РАН (2007-2010 гг.)
Положения, выносимые на защиту
-
Системообразующий фактор микросимбиоценоза, обеспечивающий выживание (функционирование) микросимбионтов при ассоциативном симбиозе человека включает комплекс биологических характеристик микросимбионтов - ростовые свойства, антилизоцимную активность и биопленкобразование.
-
Феномен микробного распознавания «свой – чужой» на основе оппозитных (усиление/подавление) взаимодействий пары «доминант – ассоциант», под контролем их ростовых и персистентных свойств, позволяет осуществлять межвидовую и внутривидовую дифференцировку «своих» и «чужих» штаммов микросимбионтов, определяя важнейший механизм функционирования микросимбиоценоза.
-
Адаптационные механизмы функционирования микросимбиоценоза контролируются низкомолекулярными внеклеточными метаболитами бактерий (гомологами алкилоксибензолов), антицитокиновой активностью микрофлоры и синхронизацией ритма базовых физиологических функций микросимбионтов, определяющих их «динамическую адаптацию».
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на I - V Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (2002 - 2007 гг.) (г. Москва); III - V Российской научной конференции “Персистенция микроорганизмов» (2003 - 2009 гг.) (г. Оренбург); 4-й и 6-й Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» (Москва, 2003, 2005 гг.,); международном конгрессе «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развитии медицины» (Москва, 2006 г.); международной конференции «Новые технологии в военно-полевой хирургии и хирургии повреждений мирного времени» (С-Пб., 2006 г.); VI Всеармейской международной конференции «Инфекция в хирургии мирного и военного времени (Москва, 2006 г.); I, II Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010 гг); X и XII Международном конгрессе по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMD по антимикробной терапии (Москва, 2008, 2010 гг); Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микологии (X - XIII Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2007 - 2010 гг.).
Разработка «штамм бактерий Klebsiella pneumonia № 278 – продуцент ингибитора лизоцима» экспонирована на Х Московском международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва, 7-10 сентября 2010 г.) и удостоена серебряной медали (О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ, из них 19 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография и 2 патента РФ. Изданы 2 пособия для врачей.
Объем и структура диссертационной работы
Модификация биологических свойств микроорганизмов в их ассоциации
В последнее время наблюдается рост исследований, рассматривающих не только антагонистические взаимоотношения между различными микроорганизмами (Ryan, Dow, 2008), но и охватывающих другие аспекты возможных микробных взаимодействий (Shank, Kolter, 2009). Проявление антагонистической активности микрофлоры далеко не единственное следствие межвидовых взаимоотношений микросимбионтов, хотя зачастую его проще всего наблюдать. Помимо антагонизма и других типов реагирования микробов при совместном культивировании выявляют, как новые сигнальные молекулы, так и ранее неизвестные функции уже существующих индукторов, представляющих несомненный интерес в области микробиологии и медицины (Shank, Kolter, 2009).
В последние годы изучение различных аспектов межвидовых взаимодействий микроорганизмов выявило наличие множества новых сигнальных молекул, симбионтных партнеров и фенотипических изменений микрофлоры в условиях ассоциативного симбиоза (Несвижский и др., 1997; Бухарин и др., 2007а; Takahashi, 2003; Tong et. al., 2007, 2008).
Взаимоотношения между микроорганизмами при ассоциативном симбиозе базируются на различных каналах связи между микросимбионтами, включающих: клеточные взаимодействия (адгезия, коагрегация, рецепторные распознавания) (Kolenbrander, 2000; Palmer et. al., 2001; Palmer, Diaz, Kolenbrander, 2006; Kolenbrander et al., 2002), генетический обмен (горизонтальный перенос генов, обмен плазмидами) (Li et. al., 2001) и выработка сигнальных метаболитов (регуляторных пептидов, молочной кислоты и других химических соединений) (Krisanaprakornkit et. al., 2000; Fong et. al., 2001; Burgess et. al., 2002).
Клеточные взаимодействия при формировании микробных консорциумов хорошо изучены на примере микрофлоры ротовой полости.
Известно, что в данном биотопе идентифицировано около 700 видов бактерий, при этом для каждого из них определены место, функция, а также последовательность колонизации. Вначале бактерии колонизируют поверхность зубной эмали либо посредством специальных поверхностных белков адгезинов и агглютининов, либо опосредованно — за счет фрагментов погибших бактериальных клеток или секретируемых белков типа статерина. К рецепторам на поверхности «ранних колонистов» присоединяются другие виды бактерий («поздние колонисты») за счет специфических адгезинов. Последовательность присоединения бактерий строго ранжирована. От видового состава бактерий на зубной поверхности существенно зависят возможные заболевания (Kolenbrander et. al., 2002).
Известно, что коагрегация P. gingivalis со стрептококками увеличивает способность колонизировать поверхность зубной эмали каждого из участников этих симбиотических взаимоотношений (Kolenbrander et. al., 2002). Исследования, проведенные на модели взаимоотношений Т. denticola и P. gingivalis, F. nucleatum и Т. forsythia, показали, что микроорганизмы, не способные к биопленкообразованию в монокультуре in vitro, включаются к микробные биопленки, образованные симбионтной флорой (Sharma et. al., 2005; Vesey, Kuramitsu, 2004).
В настоящее время накоплено достаточно материалов, свидетельствующих о наличии генетического обмена между микроорганизмами при их ассоциативных взаимоотношениях. (Kuramitsu, Trapa, 1984; Davison, 1999). Вероятность данного типа взаимодействия обусловлена тесным соседством симбиотических микроорганизмов. Секвенирование генома P. gingivalis выявило наличие в «островах патогенности» процентное содержание G+C пар, отличающихся от остальной части хромосомы, что свидетельствовало о передаче P. gingivalis специфических генетических последовательностей от других микроорганизмов (Curtis, Hawley, Aduse-Opoku, 1999; Tribble et. al., 2007).
Обмен плазмидами между участниками различных микробных сообществ организма человека представляет собой серьезную медико-биологическую проблему, в связи с формированием полиантибиотикорезистентности микрофлоры. Потенциальными механизмами генетического обмена в микробных сообществах могут быть коньюгация, трансформация и трансдукция. Исследования в этом направлении выявили существование генетических механизмов передачи материала у S. gordonii, S. mutans и Т. denticola (Kuramitsu, Trapa, 1984; Yeung, 1999; Li et. al., 2001). Способность бактерий производить многочисленные вторичные метаболиты оказалась генетически детерминированой. Причем фенотипические признаки проявлялись у микрофлоры в меньшей степени при культивировании в лабораторных условиях и возрастали в естественной среде обитания (Oh et. al., 2005; Gross, 2007).
He менее интересна индукция производства вторичных метаболитов у микроорганизмов при межвидовых взаимодействиях. Описано выявление новых вторичных метаболитов, индуцированных непосредственным контактом клеток морских бактерий и грибов (Oh et. al., 2005, 2007). Представлены данные относительно индукции аминогликозидов с новой структурой кольца, возникающей в результате конкурентных взаимодействий у совместно культивируемых R. fascians с S. padanus (Kurosawa et. al., 2008). Предполагается, что это явление возникает за счет горизонтального переноса генов ДНК актиномицетов, а не вследствие диффузии малых микробных молекул (Kurosawa et. al., 2008). Полученные результаты - свидетельство новых возможных механизмов межвидовых взаимодействий бактерий в природе, приводящих не только к фенотипическим, но и к генотипическим изменениям микроорганизмов.
Актуальным направлением исследований межмикробных взаимодействий является выявление вторичных метаболитов симбионтной микрофлоры и изучение их регуляторной функции при ассоциативном симбиозе. С одной стороны, фенотипические изменения микробных популяций и изучение биомодуляции между микроорганизмами свидетельствуют, что представители микрофлоры могут общаться с помощью малых микробных молекул, а с другой - данные микробные молекулы могут быть использованы в качестве индукторов новых метаболитов-посредников в результате межвидового взаимодействия симбионтов при ассоциативном симбиозе. Таким образом, изучение микробных отношений открывает возможности выявления новых молекул, осуществляющих посредническое взаимодействие микроорганизмов.
При изучении метаболитов микросимбионтов показано, что они могут обладать плейотропным эффектом и в субингибиторной концентрации выступают в качестве сигнальных молекул при регуляции внутри- и межвидовых взаимоотношений микроорганизмов (Fajardo, Martinez, 2008): снижают экспрессию генов SOS-ответа (Mesak, Miao, Davies, 2008), уменьшают биопленкообразование (Starner et. al., 2008), влияют на ростовые свойства (Kolenbrander et. al., 2002), а также изменяют выраженность вирулентных свойств у разных видов бактерий (Linares et. al., 2006; Skindersoe et. al., 2008) и т.д.
Выявлено, что продукция вторичных метаболитов микроорганизмами может изменять окружающую среду таким образом, что она становится не пригодной для существования других видов бактерий. Однако недавние исследования показали, что F. nucleatum и P. intermedia, чувствительные к кислоте, способны защищаться от низких значений рН среды, используя глутаминовую и аспарагиновую кислоты в качестве субстратов для ферментативной реакции, генерируя аммиак (Takahashi, 2003), что способствует формированию среды с более нейтральным рН даже в присутствии молочнокислых бактерий и брожении углеводов (Takahashi, 2003).
Преобладание S. /nutans в биоценозе связано со способностью преобразовывать сахар в молочную кислоту, в большей степени, чем другими стрептококками (Loesche et. al., 1975; Tong et. al., 2007). С другой стороны, S. sanguinis продуцирует перекись водорода, неспецифический антимикробный фактор, антагонистически воздействующий на S. mutans, у которого отсутствуют эффективные системы защиты от данного токсичного продукта (Higuchi, 1984; Carlsson, Edlund, 1987; Kreth et. al, 2005). Кроме того, S. oligofermentas способен утилизировать молочную кислоту, вырабатываемую 5і. /nutans, за счет деятельности фермента лактат-оксидазы и образовывать перекись водорода (Tong et. al., 2007, 2008). Таким образом, синтез молочной кислоты 5 . mutans можно расценивать как потенциально антагонистический сигнал против себя в условиях сосуществования в биоценозе вместе с S. oligofermentas. Известно, что увеличение численности S. sanguinis и S. oligofermentas в микробиоте связано с более низким уровнем S. mutans и других пародонтопатогенных микроорганизмов, что способствует увеличению колонизационной резистентности биотопа и осуществлению защитной функции организма хозяина (Hillman, Socransky, Shivers, 1985). Молочная кислота, продуцируемая S. mutans, хорошо усваивается членами семейства Veillonella (Mikx, van der Hoeven, 1975; Kolenbrander et. al., 2002), являющимися ранними колонистами зубной поверхности (Palmer, Diaz, Kolenbrander, 2006).
Микросимбиоценоз кишечника человека - биологическая система, его видовая структура и системообразующий фактор
Проблема симбиоза - одна из важнейших в современной биологической науке. Симбиоз как форма сосуществования неродственных организмов представляет собой фундаментальное явление, характеризующее состояние живой природы. Рассмотрение инфекции как результата отношений паразит-хозяин, позволяет считать инфекционный процесс модельной системой ассоциативного симбиоза (Бухарин О.В., 2010). Изучение различных симбиотических систем выявило их многокомпонентный статус: макропартнер - хозяин (человек, животные, растения, микроорганизмы), своеобразный центр формирования специализированных сообществ микроорганизмов (обязательное наличие), стабильный доминантный микросимбионт с его разнонаправленным характером влияния на макропартнера и ассоциативные микросимбионты, поддерживающие или разрушающие симбиоз в целом (Бухарин О.В., 2006). Установлено, что в составе конкретной симбиотической системы, доминантные и ассоциативные микросимбионты формируют достаточно устойчивые микросимбиоценозы, которые отличаются не только многокомпонентностью, но и разнообразным содержанием входящих в них представителей микрофлоры. Естественно, что при заселении биотопов человека между микроорганизмами складываются определенные взаимоотношения, которые влияют на качественную и количественную характеристику того или иного микробного пейзажа (Несвижский Ю.В., 1997).
Микросимбиоценоз кишечника по праву относят к одному из наиболее сложных по составу. На чрезвычайную сложность населяющей человека и животных микрофлоры указывает тот факт, что в 1 грамме содержимого слепой кишки определяется более двух биллионов микроорганизмов, представителей 17 различных семейств, 45 родов, свыше 400 видов (Bordello S.P.,1986; Шендеров Б.А., 1998).
В литературе описаны некоторые схожие с микросимбиоценозом понятия, такие так «консорциум», «микрофлора», «микробиоценоз», «микробоценоз» и «микробном».
Известно, что консорциум - это совокупность различных взаимозависимых организмов, выступающих как единое целое при использовании определенного субстрата (Фирсов Н.Н., 2006). Однако данное определение, отражая взаимосвязь микроорганизмов, не рассматривает её как живую систему и не учитывает влияние микрофлоры на организм хозяина. Кроме того, при взаимодействии микроорганизмов взаимозависимость не является обязательным условием, поскольку между микробами могут складываться не только синергидные, но и антагонистические (прямые, и опосредованные) типы взаимоотношений (Ваксман З.А., 1947; Шиллер И.Г., 1952; Бухарин О.В., 1999; Meghrous J. et.al., 1990; Bernet-Camardet M.F. et.al., 1993., Gibson G.R.,Wang X., 1994).
Связь микроорганизмов с биотопом отражает термин «микрофлора» -совокупность разных типов микроорганизмов, населяющих какую-либо среду обитания (Гиляров М.С., 1986). Однако, на наш взгляд, данный термин также не соответствует понятию «микросимбиоценоз», поскольку, не предполагает взаимодействие микроорганизмов между собой и влияние их на состояние макропартнера.
Важным дополнением к формулировке термина «микросимбиоценоз», на наш взгляд, является включение в него понятия популяционной организации сообществ микроорганизмов, поскольку свойством микробной популяции является гетерогенность, которая обуславливает адаптацию к меняющимся внешним условиям на уровне всей популяции (колонии, биопленки и др.). Известно, что всякая внутренне гетерогенная система обладает дополнительным резервом устойчивости. Специфику популяционно-коммуникативного направления четко выразили В.В. Высоцкий и Г. А. Котлярова (1999), предложившие рассматривать «бактериальную популяцию как морфологически и физиологически непрерывно изменяющуюся и саморегулирующую многоклеточную систему, обладающую высоким приспособительным потенциалом, направленным на сохранение вида».
Рассмотрение совокупности микроорганизмов с позиции популяции включено в понятие «микробиоценоз» и тождественный ему термин «микробоценоз» означающие совокупность популяций разных видов микроорганизмов, обитающих в определенном биотопе (напр., в полости рта, в водоеме) (Фирсов Н.Н., 2005). Однако, в данном случае, определение «микробиоценоза» («микробоценоза) также не рассматривается в позиции биологической системы и влияния на макропартнера.
Кроме того, в последнее десятилетие появился новый термин «микробном», предложенный нобелевским лауреатом Дж. Ледербергом (2000) и означающий совокупность всех видов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания и их геномов.
Приступая к работе, мы обратили внимание, что в доступных источниках литературы встречается термин «микросимбиоценоз» (Бурмистрова А.Л., 1997), однако определение данного понятия отсутствует. В связи с этим мы предприняли попытку сформулировать определение микросимбиоценоза.
При формулировке определения микросимбиоценоза, в первую очередь, было учтено, что он является живой системой. Как любая живая система микросимбиоценоз является:
открытой системой, обменивающейся с окружающей средой веществом и энергией.
самоуправляемой, саморегулирующейся системой, т.е. обменивающейся со средой информацией и способной перерабатывать эту информацию для поддержания своей структуры и управлением процессами метаболизма (Новосельцев Н.В., 1978).
Согласно определению, система (биологическая) - некоторая совокупность взаимодействующих элементов, которая образует целостный биологический объект (Новосельцев Н.В., 1978). В своей работе П. К. Анохин (1973) подчеркивает, что системой можно назвать только комплекс избирательно вовлеченных компонентов, у которых взаимодействие и взаимоотношения принимают характер взаимосодействия компонентов на получение фокусированного полезного результата.
Главной чертой каждой биологической функциональной системы является ее динамичность, несмотря на достаточную стабильность структуры (Анохин П.К., 1973; Маглыш С.С., 2001; Шамилева И.А., 2004). Структурные образования, составляющие функциональные системы, обладают исключительной мобилизуемостью. Именно это свойство систем и дает им возможность быть пластичными, внезапно менять свою архитектуру в поисках запрограммированного полезного результата (Анохин П.К., 1973).
Функциональная система всегда гетерогенна. Она состоит из определенного количества узловых механизмов, каждый из которых занимает свое собственное место и является специфическим для всего процесса ее формирования (Анохин П.К., 1973). Гетерогенность клеток присуща микробным популяциям и в работах С. Г. Смирнова (1985, 2004) рассматривается как «кластер» клеток в микробных колониях, каждый из которых несет свою функцию в рамках целого. К примеру, кластер покоящихся «резервных» клеток готов «в любой нужный момент для популяции вступить в процесс интенсивного роста и деления» (Олескин А.В., 2001; Смирнов С.Г., 2004). Однако, несмотря на гетерогенность слагающих ее индивидуальных клеток, микробная популяция рассматривается в рамках популяционно-коммуникативного направления как единая развивающаяся система, характеризующаяся интегральными свойствами, отсутствующими у отдельных частей микробной популяции (Олескин А.В., 2001). Признание того факта, что микроорганизмы связаны друг с другом сложными системами межклеточных взаимоотношений, привело к необходимости изучения «языка» на котором они «разговаривают друг с другом». В настоящее время исследователи выделяют три канала, или способа, передачи информации между микроорганизмами (Николаев Ю.А., Плакунов В.К., 2007): 1) механический (контактный) (Олескин А.В., 2000); 2) коммуникативный, опосредованный физическими полями, иначе называемый дистантным взаимодействием (Казначеев, 1981), митогенетическим излучением (Гурвич А.Г., 1945), вторичным биогенным излучением (Кузин A.M., 1997) или физическим сигналом (Matsuhashi М. et. al., 1995); 3) химический (посредством химических соединений) (Хохлов А.С., 1988; Kell et. al., 1995; Kaprelyants A.S. et. al., 1999). Наиболее изученным остается химический способ коммуникации, тогда как первых два - мало исследованы.
Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека
В настоящее время актуальным направлением исследований межмикробных взаимодействий является определение индукции метаболитов симбионтной микрофлоры в ассоциации и изучение их регуляторной функции при функционировании симбиоценоза. Таким образом, изучение микробных отношений открывает возможности выявления новых молекул, осуществляющих посредническое взаимодействие микроорганизмов.
Проведенные предварительные эксперименты по влиянию доминантов на ассоцианты наводят на мысль, что в регуляции межмикробных взаимоотношений при функционировании микросимбиоценоза важную роль играют микробные метаболиты, оказывающие регуляторное действие на биологические свойства микросимбионтов. К сходным выводам пришли Shank А. Е. and Kolter R. (2009), которые связывали регуляторные взаимодействия микроорганизмов с составом экзометаболитов микрофлоры, а именно, с наличием в супернатанте «сигнальных» молекул. С одной стороны, фенотипические изменения микробных популяций и изучение биомодуляции между микроорганизмами свидетельствуют, что представители микрофлоры могут общаться с помощью малых микробных молекул, а с другой - данные микробные молекулы могут быть использованы в качестве индукторов новых метаболитов-посредников в результате межвидового взаимодействия симбионтов при ассоциативном симбиозе.
Вот почему полученные результаты по взаимодействию микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» характеризовали лишь тенденцию изменений изучаемых признаков при прямом воздействии экзометаболитов доминантов на ассоцианты. В связи с этим, был изменен алгоритм эксперимента, при котором определение влияния экзометаболитов бифидобактерий на рост/размножение, антилизоцимную активность и биопленкобразование микроорганизмов проводили после предварительного соинкубирования культур бифидобактерий с супернатантами микросимбионтов. Проведение такого рода экспериментов было основано на предположении, что в условиях микросимбиоценоза экзометаболиты ассоциантов способны модифицировать биологические свойства бифидобактерий, индуцируя у них выработку вторичных экзометаболитов, что способствует изменению взаимодействия бифидофлоры с микросимбионтами и может оказаться полезным при микробном распознавании «свой-чужой».
Известно, что способность распознавать «свое» и «чужое» является важнейшим фундаментальным свойством иммунной системы (Ройт А., 1991), обеспечивающим наилучшую приспособляемость и самоидентификацию организма человека в окружающей среде (Лапин С. В., Тотолян А. А. 2006). Иммунный ответ, который является единым процессом, входящим в патогенез инфекционной болезни, реализуется функциональными звеньями гуморального и клеточного иммунитета, а также факторами неспецифической резистентности. С помощью специализированных популяций лимфоцитов организм человека способен различать «свое» и «чужое» (осуществлять иммунный ответ), распознавать чужеродные антигены, продуцировать специфические антитела, а также осуществлять специфически направленные цитотоксические реакции. Результатом перечисленных событий является нейтрализация и уничтожение чужеродного антигена (Галактионов В.Г., 1997).
Исходя из этого, внедрение микроорганизма в организм хозяина, его выживание будет зависеть не только от результата распознавания бактерий иммунной системой человека, но и от итога взаимоотношений с уже существующей (индигенной) микрофлорой данного биотопа, что может привести к различным исходам инфекции (Бухарин О. В., 2007). В микросимбиоценозе кишечника человека имеются постоянно присутствующие (индигенные) виды бактерий, среди которых основное место занимают бифидо- и лактобактерии (доминанты), поддерживающие баланс микрофлоры пищеварительного тракта (Шендеров Б.А., 1998; Duffy L.C., 1993).
Учитывая данные о патофизиологических особенностях функции индигенной флоры и существующий прямой и распространенный контакт огромной массы бактерий и вирусов с иммунокомпетентными органами ЖКТ, их функциональное взаимодействие, очевидно, имеет глубокие корни и генетически детерминировано. Структуры слизистых оболочек ЖКТ, выполняющие пограничные функции, и симбиотическая микрофлора, заселяющая эти слизистые, филогенетически и онтогенетически являются функциональным единством и частью врожденной иммунной t системы (Беляев И.М., 1997).
Исходя из вышесказанного, предполагается, что микроорганизмы, в частности представители доминантной микрофлоры, способны также участвовать в распознавании «свой-чужой», являясь первой линией обороны в биотопе дистального отдела толстого кишечника человека.
Исходя из концепции ассоциативного симбиоза, где в условиях микросимбиоценоза взаимодействуют доминантная и ассоциативная микрофлора, исследования были проведены в парах «доминант-ассоциант». В качестве ассоциантов, при изучении взаимодействия микросимбионтов, было использовано 16 штаммов микроорганизмов, являющихся типичными представителями микрофлоры кишечника человека при дисбиозе: гемолитические (гем «+»), лактозонегативные (лак «-») Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Candida albicans (no 4 штамма каждого вида). В качестве типичных представителей бактерий, составляющих микросимбиоценоз при эубиозе кишечника человека, были использованы 8 культур Enterococcus faecium и негемолитические (гем «-») лактозопозитивные (лак «+») Е. coli (по 4 штамма каждого вида). Кроме того, в качестве доминантных микроорганизмов использовали »штаммы 157 Bifidobacterium spp. (В. bifidum, В. longum и В. adolescentis) по 3 культуры каждого вида. При изучении взаимодействия микросимбионтов на I этапе были получены супернатанты (СН) ассоциантов из бульонных культур микроорганизмов, которые соинкубировали в питательном бульоне с культурами доминантов (рис. 22). На II этапе из этих культур доминантов получали СН, который соинкубировали в питательном бульоне с культурами ассоциантов, у которых на III этапе определяли ростовые свойства (рост/размножение, PC), способность к образованию биопленок (БПО) и антилизоцимную активность (АЛА) фотометрическим методом на фотометре ELx808 (BioTek, США). В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо СН микроорганизмов использовали эквивалентное количество питательного бульона.
Внесение в среду культивирования субингибиторных концентраций экзометаболитов ассоциантов не увеличивало численность Bifidobacterium spp., что позволило заключить, что последующее влияние метаболитов доминантов на микросимбионты не было связано с изменением численности бифидобактерий, а являлось следствием изменения их функциональной активности.
При оценке влияния бифидобактерий на рост/размножение ассоциантов в предварительных экспериментах и после предварительного соинкубирования бифидобактерий с микросимбионтами выявлены различные типы взаимодействий микроорганизмов в паре «доминант ассоциант», характер которых зависел от видовой принадлежности микросимбионтов (рис. 23). Проведенные эксперименты позволили выявить способность доминантов в ответ на воздействие супернатантов ассоциантов более четко усиливать или угнетать эффекты влияния бифидофлоры на физиологические функции ассоциантов.
Влияние микробных ауторегуляторов-адаптогенов на популяцию доминантных и ассоциативных микросимбионтов
У представителей нормофлоры в первоначальных экспериментах под влиянием экзометаболитов Bifidobacterium spp. угнетение биопленкообразующей активности микроорганизмов встречалось реже (в среднем в 16,7±6,2 % случаев) (р 0,05), чем у видов микросимбионтов, характерных для дисбиоза кишечника (рис. 27). Для данной ассоциации характерен был стимулирующий эффект влияния экзометаболитов бифидобактерий на БПО 33,3±7,8 % культур непатогенных эшерихий и 50±8,3 % штаммов энтерококков (р 0,05). У 33,3 - 50 % изолятов Е. coli и Е. faecium изменение биоплёнкообразования под действием экзометаболитов Bifidobacterium spp. не происходило.
При проведении исследований по разработанному алгоритму (с предварительным соинкубированием доминантов с супернатантами ассоциантов) наблюдалось увеличение распространенности стимулирующего эффекта влияния бифидобактерий на БПО культуры Е. faecium с 50±8,3 % до 72,2±8 % (р 0,05) и штаммов лактозопозитивных негемолитических Е. coli с 33,3±7,8 % до 80,5±6,6 % (р 0,05). Кроме того, происходило исчезновение ингибирующего эффекта влияния бифидобактерий на непатогенные энтерококки и кишечные палочки.
Таким образом, эффект влияния бифидобактерий на образование биопленок ассоциантами, зависел, как и в случае ростовых свойств, от их (ассоциантов) видовой принадлежности. Предварительное соинкубирование бифидобактерий с экзометаболитами энтерококков и лактозопозитивных эшерихий, являющихся типичными представителями нормальной микрофлоры кишечника человека, приводило к усилению их активности образования биопленок в данных сериях эксперимента. Напротив, усиление ингибирующего эффекта бифидобактерий на культуры стафилококков, лактозонегативных кишечных палочек, клебсиелл и дрожжевых грибов (представителей микрофлоры, характерной для дисбиоза кишечника), регистрировалось после предсоинкубирования Bifidobacterium spp. с данными видами ассоциантов.
Кроме того, анализ данных, полученных in vitro, позволил определить различную активность влияния доминантов на ассоциантов, зависящую не только от вида ассоциативной микрофлоры, но также и от вида бифидобактерий.
Установлено, что штаммы В. longum и В. adolescentis, при предварительном соинкубировании с супернатантами ассоциантов, в последующем, в одинаковой степени влияли на биопленкообразование ассоциантов, характерных для дисбиоза биотопа дистального кишечника человека, ингибируя БПО микроорганизмов в 100 % случаев (»рис. 28). Исключение составили штаммы В. bifidum, которые. после предсоинкубирования сохраняли стимулирующий и ингибирующий тип влияния на ассоцианты в 2,1±2 % случаев.
В отношении ассоциантов, представителей нормофлоры, более активными оказались штаммы В. longum, которые чаще, чем другие виды бифидобактерий стимулировали образование биопленок эшерихий и энтерококков. Выраженность «ответа» бифидобактерий (по распространенности основного эффекта влияния на ассоцианты) на присутствие в среде супернатантов Е. faecium и лактозопойитивных негемолитических Е. coli убывала в ряду В. longum (83,3±5,4 %) В. adolescentis (75±6,2 %) В. bifidum (70,8±6,5 %).
Сходная закономерность была отмечена и при определении влияния супернатантов бифидобактерий (предварительно обработанных супернатантами ассоциантов и без таковой) на антилизоцимную активность микросимбионтов.
В первоначальных экспериментах супернатант бифидобактерий чаще (в 27,8 % - 77,7 % случаев) оказывал подавляющий эффект на антилизоцимную активность микроорганизмов, характерных для дисбиоза дистального отдела толстого кишечника человека (рис. 29). Так, ингибирование роста/размножения S. aureus было отмечено в 27,8±7,4 % случаев, лактозонегативных гемолитических Е. coli и Klebsiella spp. в 77,7±6,9 % случаев, грибов рода Candida в 61,1 ±8 % случаев (р 0,05).
Предварительное соинкубирование доминантов с супернатантами ассоциантов приводило к увеличению ингибирующего эффекта влияния бифидобактерий на антилизоцимную активность культур S. aureus с 27,8±7,4% до 97,2±2,7 % (р 0,05), лактозонегативных гемолитических Е. coli с 77,7±6,9 % до 91,7±4,6 % (р 0,05), К. pneumoniae с 77,7±6,9 % до 97,2±2,7 % (р 0,05)и С. а/6/сагас61,1±8%до91,7±4,6%(р 0,05). ,
Напротив, в первоначальных экспериментах, угнетение антилизоцимной активности микроорганизмов, представителей нормофлоры под влиянием экзометаболитов Bifidobacterium spp. встречалось реже (в 5,6 - 25 % случаев) (р 0,05), чем у видов микросимбионтов, характерных для дисбиоза кишечника (рис. 30). Кроме того, был отмечен стимулирующий эффект влияния экзометаболитов бифидобактерий у 50±8,3 % культур непатогенных эшерихий и 66,7±7,8 % штаммов энтерококков (р 0,05). У 25 - 27,7 % изолятов Е. coli и Е. faecium изменение антилизоцимной активности под действием экзометаболитов Bifidobacterium spp. не происходило.
Проведение исследований по разработанному алгоритму (с предварительным соинкубированием доминантов с супернатантами ассоциантов) приводило к увеличению стимулирующего эффекта влияния бифидобактерий на АЛА культур Е. faecium с 66,7±7,8 % до 8d,l±5,7 % (р 0,05) и штаммов лактозопозитивных негемолитических Е. coli с 50±8,3 % до 91,7±4,6 % (р 0,05). Кроме того, происходило исчезновение ингибирующего эффекта влияния бифидобактерий на непатогенные энтерококки и кишечные палочки. ,.
Таким образом, эффект влияния бифидобактерий на образование биопленок ассоциантами, зависел, как и в случае ростовых свойств и і биопленкообразования, от их (ассоциантов) видовой принадлежности. Предварительное соинкубирование бифидобактерий с экзометаболитами энтерококков и лактозопозитивных эшерихий, являющихся типичными представителями нормальной микрофлоры кишечника человека, приводило к усилению антилизоцимной активности Е. faecium и лактозопозитивных негемолитических Е. coli. Напротив, отмечено усиление ингибирующего эффекта бифидобактерий на культуры стафилококков, лактозонегативных кишечных палочек, клебсиелл и дрожжевых грибов (представителей микрофлоры, характерной для дисбиоза і кишечника), которое выявлялось после предварительного соинкубирования Bifidobacterium spp. с данными видами ассоциантов.
Проведенные исследования позволили установить различную активность влияния доминантов на ассоциантов, зависящую не только от вида ассоциативной микрофлоры, но также и от вида бифидобактерий.
Выявлено, что штаммы В. bifidum, В. longum, и В. adolescentis после предварительного соинкубирования с супернатантами ассоциантов ингибировали антилизоцимную активность ассоциантов, характерных для дисбиоза кишечника человека, соответственно в 91,7±3,9 % случаев, і 97,9±2 % случаев и 93,7±3,5 % случаев (рис. 31). Индифферентный эффект влияния бифидобактерий на АЛА ассоциантов сохранялся в 2,1 - 8,3 % случаев.
В отношении ассоциантов, представителей нормофлоры, более активными оказались штаммы В. longum, которые чаще, чем другие виды бифидобактерий стимулировали образование биопленок эшерихий и энтерококков.
