Введение к работе
Актуальность темы исследования
Внедрение инновационных технологий в микробиологическую диагностику расширяет наши познания в области медицинской микроэкологии. Впервые исследования микрофлоры влагалища у женщин были проведены А.Додерлейном в 1892 году. До середины XX века вагинальный микроценоз считался однородным и представленным, в основном, Lactobacillus acidophilus - «палочками Додерлейна». К девяностым годам прошлого столетия было показано, что нормальный микроценоз гениталий женщин репродуктивного возраста неоднороден и представлен как Lactobacillus spp. - 95-98%, так и большой группой условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) – Staphylococcus spp., E.coli, G.vaginalis, C.albicans с частотой выявления 10-50% (Анкирская А.С., 1999; Черкасов С.В. 1998).
У здоровых женщин доминирующими видами микробиоты влагалища являются лактобактерии, преобладающее количество которых, по мнению большинства исследователей, определяет высокий уровень противомикробной защиты (Радзинский В.Е., 2007; Кочеровец В.И., 2012).
Видовая идентификация лактобактерий долгое время была трудновыполнимой задачей из-за невозможности преодоления методических сложностей при изучении их биологических свойств. Более века морфологические свойства лактобактерий оставались единственным критерием их родовой идентификации. В 80-х годах прошлого века прогресс в технологиях позволил выполнить работы, выявившие фенотипическое разнообразие штаммов лактобактерий. Опыт применения биохимических панелей от различных производителей показывал, что данная методика трудоемка, длительна и малодостоверна (Муравьева В.В., 1997; Brolazo E.M., 2011). Несмотря на все недостатки, морфологические и биохимические методы идентификации лактобактерий до последнего времени оставались единственными критериями при определении видовой принадлежности этих микроорганизмов.
Альтернативой классической биохимической идентификации явились методы молекулярно - генетического типирования, а в последнее время прочную нишу стала занимать масс-спектрометрия, в частности MALDI TOF MS (Матрично-Активированной Лазерной Десорбции/Ионизации времяпролетная масс-спектрометрия), основанная на регистрации белковых спектров микроорганизмов, которые уникальны для семейств, родов и видов микроорганизмов (Говорун В.М., Ильина Е.Н., 2009).
Развитие лабораторной техники, молекулярно-биологических и генетических методов исследования позволило установить высокую гетерогенность бактерий рода Lactobacillus и их широкое видовое разнообразие, достигающее сотни видов. Молекулярно-биологические методы открывают новые возможности в развитии представлений не только о составе микроценоза влагалища в норме и при патологии, а также позволяют обоснованно определить, какие же виды лактобактерий могут быть перспективными в качестве исходного сырья для производства биопрепаратов.
Степень разработанности темы
В последние два десятилетия в связи с методологическими прорывами в клинической микробиологии открылись новые возможности для более углубленного анализа микробной экологии влагалища (Ворошилина Е.С., 2010; Ferris M.J., 2007; Jakobson T., 2007; Hernandez-Rodrguez C., 2011), многие вопросы которой остаются неизученными и являются предметом дискуссий. Задачи, связанные с разработкой и внедрением в рутинную практику микробиологических лабораторий новых эффективных подходов по идентификации, характеристике и типированию представителей микробиоты влагалища и клинически-значимых патогенов, являются актуальными и своевременными.
Лактобактерии представляют интерес как объект изучения для разработки пробиотических препаратов, продуктов функционального питания, способов коррекции микробиотических нарушений, так как, обладая многогранными биологическими свойствами, они играют важную роль в обменных и регуляторных процессах организма человека (Глушанова Н.А, 2003).
Возможность видовой идентификации лактобактерий позволит ближе подойти к пониманию механизмов развития оппортунистических вагинальных инфекций, установить корреляцию между видовым составом этих микроорганизмов и инфекционной патологией и станет новым шагом в разработке стратегий диагностики и лечения оппортунистических урогенитальных инфекций.
Цель исследования
Определить видовой состав лактобактерий, представленных в отделяемом влагалища у беременных женщин с нормоценозом и оппортунистическими инфекциями, с помощью бактериологического, масс-спектрометрического и молекулярно-генетического методов исследования.
Задачи исследования
-
Провести сравнительное изучение микроценоза влагалища у беременных женщин с помощью комплексного микробиологического исследования (микроскопия мазка, культуральное исследование) и молекулярно-генетического метода количественной ПЦР.
-
Сравнить результаты видового типирования лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища беременных женщин, методами MALDI TOF MS и количественной ПЦР.
-
Определить частоту выявления лактобактерий при различных состояниях микробиоты влагалища у беременных женщин.
-
Выявить особенности видового состава лактобактерий у беременных женщин при вагинитах различной этиологии (бактериальный вагиноз, аэробный вагинит, кандидозный вагинит) в сравнении с нормоценозом.
-
Изучить антибиотикочувствительность различных видов лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища.
Научная новизна
На популяции российских беременных женщин впервые проведено комплексное микробиологическое и молекулярно-генетическое исследование микробиоты влагалища с видовой идентификацией лактобактерий. Показано наличие в составе микробиоты влагалища 18 видов лактобактерий, ведущими из которых являются L.crispatus, L.iners, L.jensenii и L.gasseri.
Получены новые данные о видовом составе лактобактерий, представленных в микробиоте влагалища беременных женщин с нормоценозом и оппортунистическими инфекциями, расширяющие представление о формировании микробиоценозов.
Определена частота встречаемости различных видов лактобактерий во влагалище беременных женщин с преобладанием вида L.crispatus (63,2±12,6%) при нормоценозе и L.iners (84,6%; ДИ 95%: 67,8-96,1) при бактериальном вагинозе. Установлено большее видовое разнообразие лактобактерий при бактериальном вагинозе в сравнении с нормоценозом.
Исследование антибиотикочувствительности клинических штаммов лактобактерий, выделенных из влагалища беременных женщин, выявило вариабельную чувствительность различных видов лактобактерий к АБП, что может вести к селективному подавлению роста или, напротив, к увеличению уровня отдельных видов в общем пуле лактобактерий в зависимости от схемы антибактериальной терапии.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенной работы позволили усовершенствовать микробиологическую (культуральную и молекулярно-генетическую) диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища. Полученные новые данные о частоте встречаемости различных видов лактобактерий при вагинитах в сравнении с нормоценозом, позволяют теоретически обосновать перспективы использования определенных видов лактобактерий в качестве исходного сырья для производства пробиотических препаратов. При изучении морфо-фенотипических свойств лактобактерий, выявлена их морфологическая мимикрия, что ограничивает возможности микроскопического метода для качественной оценки микрофлоры влагалища.
Разработанный алгоритм микробиологического обследования беременных женщин дает возможность комплексно оценить состояние микрофлоры влагалища с целью своевременной коррекции дисбиотических нарушений и/или назначения адекватной антимикробной терапии. Определена область клинического применения метода количественной ПЦР и комплексного микробиологического исследования в диагностике инфекций влагалища.
При изучении морфологии колоний и клеток, выделенных культур лактобактерий, создана цифровая библиотека слайдов с изображением колоний и микропрепаратов клеток, предназначенных для углубленного изучения биологических свойств лактобактерий и информационного обеспечения коллекционной работы.
Методология и методы иследования
Работа выполнялась в период с марта 2010 года по июль 2012 года на базе лаборатории микробиологии и лаборатории молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России, бактериологической лаборатории и отделения патологии беременности родильного дома ГБУЗ «Городская клиническая больница № 36 ДЗ г.Москвы». Проведено комплексное микробиологическое исследование влагалищного отделяемого 155 беременных женщин во II- III триместре в возрасте от 18 до 40 лет, с использованием трех методов: микроскопического, культурального и метода количественной ПЦР.
В результате проведенной работы выделено 722 культуры лактобактерий. По результатам масс-спектрометрического типирования с ислючением повторных идентификаций получено 267 штаммов лактобактерий.
Для обработки и анализа социально – демографического статуса беременных разработана учетно – отчетная штрих-кодируемая «Индивидуальная регистрационная форма», содержащая клинико-анамнестические данные о пациентках.
Поступивший в лабораторию биоматериал и все результаты, полученные в ходе исследования, регистрировались в рабочих журналах, в «Системе микробиологического мониторинга «Микроб-2» и в специально разработанной форме «Протокол ведения микробиологического исследования».
Микроскопическое исследование вагинального отделяемого
Для приготовления мазков отделяемое влагалища забирали с заднего свода влагалища стерильным ватным тампоном (Medical Wire, Англия) и переносили на предметные стекла. Окраску по Граму и метиленовым синим осуществляли набором реагентов по общепринятой методике в соответствии с приложенной к наборам инструкцией (ЗАО «ЭкоЛаб»).
Микроскопическое исследование проводили с учетом: состояния вагинального эпителия, лейкоцитарной реакции и состава микрофлоры.
Количественный и качественный состав микрофлоры оценивали по 4-х-бальной системе с использованием критериев Nugent R.P. (1991) в модификации Анкирской А.С., Муравьевой В.В. (2011). Для определения выраженности лейкоцитарной реакции эмпирически была разработана собственная бальная шкала в зависимости от наличия сегментоядерных лейкоцитов и лимфоцитов в поле зрения.
Культуральное исследование вагинального отделяемого с определением антибиотикочувствительности выделенных УПМ
Клинический материал для культурального исследования забирали до проведения мануального обследования - с заднего свода влагалища стерильными ватными тампонами в две пробирки с транспортной угольной средой Amies (Medical Wire, Англия). Первичный посев с полуколичественной оценкой роста микроорганизмов осуществляли на 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью (Сonda, Испания; ЭкоЛаб, Россия), маннит-солевой агар (Сonda, Испания), среду Эндо, энтерококкагар и агар Сабуро (ФГУН «ГИЦПМ и Б» г.Оболенск). Все посевы культивировали при температуре 36С в течение 24-48 часов.
Для выделения лактобактерий клинический материал, взятый во вторую пробирку с транспортной средой, засевали на чашки Петри с селективными питательными средами отечественных (Лактобакагар, ФГУН «ГИЦПМиБ» г.Оболенск) и иностранных производитей (агар MRS, Conda, Испания) с последующим культивированием в условиях СО2 инкубатора и анаэростате (Jouan, Франция) при температуре 36С в течение 48 часов. На основе эмпирических исследований была проведена полуколичественная оценка микробного роста. Идентификацию выделенных УПМ и определение чувствительности по уровню МПК к антибактериальным препаратам выполнено на полуавтоматическом бактериологическом анализаторе AutoScan-4 (Siemens, США).
Контроль качества проводили с применением контрольных штаммов Microtrol (Becton Dickinson, США) – P.aeruginosa (ATCC 27853), E.coli (ATCC 25922), S.aureus, (ATCC 25923), E.faecalis (ATCC 29212).
Биохимическая идентификация культивированных лактобактерий
Видовую принадлежность штаммов лактобактерий определяли биохимическим методом с помощью панелей быстрой идентификации анаэробных бактерий (Rapid Anaerobe ID) на анализаторе AutoScan-4 (Siemens, США) и карт для идентификации анаэробных бактерий Vitek2 ANC на анализаторе Vitek2Compact (BioMerieux, Франция).
Для проведения контроля качества использовались контрольные штаммы Microtrol (Becton Dickinson, США) Clostridium perfringens (ATCC 13124).
Масс-спектрометрическое типирование вагинальных лактобактерий и других труднодиагностируемых микроорганизмов
Видовую идентификацию Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Actinomyces spp., и др., в том числе и 722 культур лактобактерий, осуществляли методом масс-cпектрометрического анализа с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI TOF MS AutoFlex III c программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 (Bruker Daltoniсs, Германия).
Программное обеспечение Maldi BioTyper 3,0 проводит идентификацию микроорганизмов и расчет коэффициента достоверности (Score). Уровень достоверности идентификации выше 2,0 свидетельствует о точной видовой идентификации, уровень достоверности от 1,7 до 2,0 – о точной идентификации до рода. Для каждого результата идентификации приводится ссылка на NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Молекулярно-генетическое исследование микроценоза влагалища методом количественной ПЦР
Исследование биоценоза влагалища проводили, используя тест-систему «Фемофлор-16» (ООО «НПО ДНК-Технология») в детектирующем амплификаторе ДТ-96, согласно инструкции производителя (ООО «НПО ДНК-Технология»).
Молекулярно-генетическое типирование лактобактерий
Для оценки видового состава лактобактерий провели определение общего количества Lactobacillus spp. и генотипирование шести видов лактобактерий (L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.johnsonii, L.vaginalis) в исходном материале методом количественной ПЦР (ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени) с использованием тест-системы для научного применения (OOO «НПО ДНК-Технология», Москва).
Методы оценки состояния микроценоза влагалища
Оценку состояния микроценоза влагалища проводили в соответствии с медицинской технологией «Интегральная оценка состояния микробиоты влагалища. Диагностика оппортунистических вагинитов» (Анкирская А.С., Муравьева В.В., 2011) и методом «Способ диагностики дисбаланса микробиты человека и степени его выраженности» (Липова Е.В. с соавторами, 2009).
Комплексная микробиологическая оценка состояния микроценоза влагалища включала интегральную оценку результатов микроскопии (состояние вагинального эпителия, лейкоцитарная реакция, разнообразие морфотипов) и культуральной диагностики с видовой идентификацией и количественной оценкой роста микроорганизмов. По результатам этой диагностики женщины (n=155) разделены на 7 групп в зависимости от «микробиологического диагноза»: нормоценоз (Н), бактериальный вагиноз (БВ), аэробный (неспецифический) вагинит (АВ), кандидозный вагинит (КВ), бессимптомное носительство грибов (БНГ), мезоценоз (М) и цитолитический вагиноз (ЦВ).
В основу «Способа диагностики дисбаланса микробиоты человека и степени его выраженности» положена комплексная количественная оценка биоты «некультивационным» методом (ПЦР в режиме реального времени) с проведением сравнительного анализа количества конкретных представителей нормо – и условно-патогенной биоты с общим количеством микроорганизмов для выявления дисбаланса биоты и степени её выраженности. Классификация состояния микробиоты методом количественной ПЦР включает: нормоценоз, дисбаланс I (умеренный), дисбаланс II (выраженный). Дисбаланс в зависимости от этиологической структуры может быть анаэробный, аэробный, смешанный.
На основании комплексной количественной оценки биоты методом количественной ПЦР беременные общей группы (n=155) были разделены на 7 групп: нормоценоз, умеренный (аэробный, анаэробный, смешанный) дисбаланс, выраженный (аэробный, анаэробный, смешанный) дисбаланс.
Определение чувствительности лактобактерий к АБП
Определение чувствительности лактобактерий к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом в соответствие с МУ 2.3.2.2789-10.2.3.2. «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Исследовали чувствительность к 12 АБП: ампициллин, гентамицин, цефазолин, цефотаксим, эритромицин, клиндамицин, левофлоксацин, ципрофлоксацин, тетрациклин, триметоприм/сульфаметоксазол, метронидазол, с использованием коммерческих дисков с антибиотиками (BioRad, Франция).
Всего изучено 123 штамма лактобактерий, из них L.crispatus – 21 штамм, L.iners – 68 штаммов, L.jensenii – 16 и L.gasseri – 18 штаммов.
Статистическая обработка полученных данных выполнялась в программе Microsoft Excel, в программе микробиологического мониторинга «Микроб-2» и включала построение гистограмм для визуальной оценки характера распределения, оценки точности и надежности относительных величин частоты и оценки значимости различия относительных величин частоты в независимых выборках по t- критерию Стьюдента.
Клинический материал предоставлен врачом отделения патологии беременности родильного дома ГБУЗ «ГКБ №36 ДЗ г.Москвы» Ягодкиной М.А., молекулярно-генетические исследования проведены сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова» Минздрава России (зав.лабораторией - Трофимов Д.Ю.).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При сравнительной оценке микроценоза влагалища беременных женщин с помощью комплексного микробиологического исследования и метода количественной ПЦР значимых различий в оценке состояния микроценоза не выявлено (p >0,05).
-
Ведущими видами лактобактерий в общей группе беременных были L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri. Метод MALDI TOF MS позволил провести видовую идентификацию лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища беременных женщин. Методом количественной ПЦР выявлен вид L.iners, некультивируемый на селективных питательных средах для лактобактерий.
-
Лактобактерии обнаружены во влагалище у всех обследованных беременных женщин: L.crispatus - ведущий вид при нормоценозе, L.iners в высоком титре обнаружен у большинства беременных женщин с бактериальным вагинозом. В группах женщин с кандидозным и аэробным вагинитами значимой разницы в видовом составе лактобактерий не обнаружено.
Степень достоверности и апробация результатов
При обследовании 155 беременных женщин использован комплекс инновационных общеклинических и специальных методов исследования: комплексное микробиологическое исследование микроценоза влагалища, биохимическая идентификация культивированных лактобактерий, с использованием современных бактериологических анализаторов, масс-спектрометрическое типирование вагинальных лактобактерий и других труднодиагностируемых микроорганизмов, с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI TOF MS AutoFlex III c программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 (Bruker Daltoniсs, Германия), молекулярно-генетическое исследование микроценоза влагалища с видовым типированием лактобактерий методом количественной ПЦР. Достаточный объем выборки анализируемых групп, и адекватная статистическая обработка результатов свидетельствует о достоверности полученных результатов. Научные положения документированы таблицами, рисунками, диаграммами.
На основании результатов проведенной работы разработан алгоритм микробиологического обследования беременных женщин, который используется в практической работе клинических отделений и отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова» Минздрава России и внедрен в практическую работу бактериологической лаборатории и отделения патологии беременности родильного дома ФГБУ «Городской клинической больницы № 36 ДЗ г.Москвы».
Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке лекционного материала на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов и на семинарах, проводимых в ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова» Минздрава России.
Диссертация апробирована на заседании апробационной комиссии ФГБУ «Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, протокол № 7 от 24 июня 2013 г.
Результаты работы представлены, доложены и обсуждены на российских и международных конференциях и конгрессах: VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Москва, 17-20 января 2012 г.; Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика – в эпицентре женского здоровья», Москва, 20-23 марта 2012г.; XIV Международном конгрессе по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID, Москва, 23-25мая 2012г.; XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя», Москва, 25-28 сентября 2012г.; VII Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Москва, 21-24 января 2013г.; 23rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Germany, 27-30 April 2013; XV Международном конгрессе по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID, Москва, 22-24 мая 2013г.
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи – в рецензируемых изданиях, 7 – в материалах конференций.
Диссертация изложена на 159 страницах компьютерного набора и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, перспективы дальнейшей разработки темы. Работа иллюстрирована 26 рисунками, 12 таблицами и 19 фотографиями. Список литературы содержит 225 источников, из них 62 отечественных и 163 зарубежных авторов.
