Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Современные представления о факторах, участвующих в формировании микрофлоры влагалища 16
1.2. Методы лабораторной оценки вагинальной микрофлоры. Прямые методы оценки микробиоценоза влагалища 45
1.3. Генетически обусловленная предрасположенность к инфекционным заболе
ваниям 52
Глава 2. Материалы и методы 68
2.1 Характеристика обследованных групп женщин 68
2.2. Методы исследования 71
Глава 3. Алгоритм формирования лабораторного заключения 86
Глава 4. Характеристика качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста 93
4.1. Микробиоценоз влагалища у клинически здоровых женщин: критерии нормы при использовании метода ПЦР-РВ 94
4.2. Оценка микробиоценоза влагалища у женщин с различной инфекцион но-воспалительной патологией влагалища 109
ГЛАВА 5. Особенности микробиоценоза влагалища у беременных женщин 157
5.1.Структура, качественный и количественный состав микробиоценоза влага лища во время беременности 157
5.2. Анализ закономерностей изменений микробиоценоза влагалища в зависи мости от исходного состояния в течение беременности 165
5.3.Факторы, влиящие на состояние микробиоценоза влагалища у беременных в I триместре 174
ГЛАВА 6. ВИЧ-инфекция как фактор, влияющий на состав вагинальной микрофлоры 181
6.1. Особенности качественного и количественного состава микробиоценоза влагалища у
ВИЧ-инфицированньк женщин репродуктивного возраста вне беременности 183
6.2. Состояние микробиоценоза влагалища у ВИЧ-инфицированных беремен
ных 197
ГЛАВА 7. Полиморфизмы генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и состояние микробиоценоза влагалища 213
7.1. Частота выявления аллельных вариантов генов системы цитокинов у женщин репродуктивного возраста с сохранной нормофлорой 214
7.2. Полиморфизм генов системы цитокинов и персистенция Ureaplasma spp. в составе вагинального микробиоценоза 217
7.3. Полиморфизмы генов системы цитокинов, количество Ureaplasma spp. в вагинальном отделяемом и клиническая характеристика обследованных женщин 220
7.4. Полиморфизмы генов системы цитокинов и видовой состав вагинальных лактобацилл 225
Заключение 231
Выводы 238
Практические рекомендации 239
Список литературы
- Методы лабораторной оценки вагинальной микрофлоры. Прямые методы оценки микробиоценоза влагалища
- Алгоритм формирования лабораторного заключения
- Оценка микробиоценоза влагалища у женщин с различной инфекцион но-воспалительной патологией влагалища
- Анализ закономерностей изменений микробиоценоза влагалища в зависи мости от исходного состояния в течение беременности
Введение к работе
Актуальность исследования
В настоящее время идет активное формирование предиктивной, персонифицированной медицины, которая позволила бы минимизировать лекарственное вмешательство в организм человека, ограничиться корректируюшими мероприятиями, а при необходимости назначить строго индивидуальную терапию с учетом всех особенностей организма пациента. Смена медицинской парадигмы подразумевает изменение диагностического и клинического подходов к выявлению различных заболеваний, изучение с новых позиций особенностей функционирования организма, раннюю, доклиническую диагностику.
Современная клиническая лаборатория позволяет проводить комплексные, многофакторные, мультиплексные исследования. Основной проблемой по- прежнему остается внедрение таких технологий в практическую медицину, поиск их места среди уже существующих диагностических алгоритмов и создание нормативной базы по их применению.
Одним из примеров такого современного комплексного подхода к изучению микробных сообществ является исследование микробиоценоза влагалища.
В настоящее время влагалище принято рассматривать как экосистему, обладающую уникальным комплексом механизмов, обеспечивающим его резистентность по отношению к чужеродным микроорганизмам и обеспечивающим репродуктивное здоровье женщины. Вагинальная среда контролирует специфическую по составу микрофлору влагалища, а микрофлора, в свою очередь, формирует вагинальную среду (1997; Буданов П.В., 2005; Priestlly CFJ, Yamamoto T, 2009). Совокупность микроорганизмов, обитающих в этой анатомической нише, принято именовать микробиоценозом влагалища, при этом качественный и количественный состав микрофлоры носит индивидуальный характер (Уварова Е.В., 2002; Vasquez A., 2002; Verstraelen H., 2009). Нормальная флора влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста представлена преимущественно видами рода Lactobacillus. Защитная функция лактобацилл реализуется несколькими путями, главным их свойством является способность продуцировать молочную кислоту и перекись водорода (Eschenbach D.A., 1989; Hawes S.E., 1996). !Установлено, что некоторые виды лактобацилл обладают пониженной способностью к реализации защитных функций (Hiller S.L.; 1992; Pavlova S.I., 2002; Verhelst R., 2005).
Однако в составе микробиоценоза влагалища могут присутствовать и другие бактерии-продуценты молочной кислоты, которые принято расценивать как условно-патогенные агенты (Megasphaera spp., Leptotrichia spp.), а некоторые однозначно ассоциируют с бактериальным вагинозом (Atopobium vaginae) (Плахова К.И., 2007; Rodroguez J.M., 1999; Fredericks D.N., 2005). Кроме перечисленных микроорганизмов в формировании вагинальной микробиоты принимают участие несколько десятков видов условно-патогенных облигатно-анаэробных и факультативно- анаэробных микроорганизмов, количество и роль которых в развитии патологии влагалища оценивают по-разному (Zhou X., 2004). К ассоциантам микробиоценоза влагалища относят генитальные условно-патогенные микоплазмы и грибы рода Candida, которые могут существовать при кислой рН влагалища и не вступают в конкуренцию с лактобациллами (Савичева А.М., 2004; Babula O., 2003).
Возможности лабораторной оценки микробиоценоза влагалища до настоящего времени были ограничены применением микроскопического, бактериологического методов и ПЦР в качественном варианте. Каждый из этих методов, несмотря на наличие определенных плюсов, имеет значительные недостатки, которые не позволяют с их помощью проводить комплексный анализ микрофлоры влагалища (Савичева А.М., 2008).
Появление ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР- РВ) открыло принципиально новые возможности для комплексной оценки микробных сообществ влагалища. Помимо идентификации большинства представителей нормофлоры и условно-патогенных участников вагинального микробиоценоза, данный метод позволяет определить абсолютное количество всех выделенных микроорганизмов и оценить соотношение между нормофлорой и условно-патогенными микроорганизмами (УПМ). ПЦР-РВ позволяет также проводить геноти- пирование основных видов вагинальных лактобацилл.
Развитие дисбиотических процессов во влагалище связывают с определенными изменениями преимущественно в местном иммунитете, накоплены убедительные данные об изменении содержания ряда цитокинов в вагинальном секрете при патологических процессах во влагалище (Witkin S.S., 1987; Giraldo P., 1999; Ghosh M., 2009; King A.E., 2009). Полагают, что эти изменения объясняют трудности лечения хронически протекающих, рецидивирующих вагинальных инфекций. Накоплены данные о наличии полиморфных аллелей генов, контролирующих экспрессию цитокинов, с которыми связывают изменение реактивности индивидуума (Barton P.T., 2003; Genc M.R., 2004; Novak R.M., 2007; Han J.H., 2010). Однако подлинные механизмы этих процессов недостаточно изучены, а данные о корреляции между наличием определенных генотипов и изменениями в микробиоценозе влагалища отсутствуют. Определение полиморфизмов генов, отвечающих за экспрессию цитокинов, также возможно проводить с помощью ПЦР-РВ.
Таким образом, возможности метода ПЦР-РВ на современном этапе открывают перед исследователями ряд перспектив. Становится возможным получение комплексного описания здоровья человека и, в частности, состояния иммунной системы (генетические особенности), количественной оценки экспрессии генов (фенотипические особенности), описания взаимодействия макроорганизма с микроорганизмами, его окружающими (нормофлорой, условно-патогенной и патогенной флорой), а также проведения генотипирования микроорганизмов.
Широкое распространение технологии ПЦР-РВ на территории России позволяет считать метод универсальным и активно использовать в рутинной диагностике, что дает преимущества при внедрении в практику новых пакетов лабораторных исследований. Сегодня в России уже предлагаются пакеты исследований в формате ПЦР-РВ для оценки условно-патогенной микрофлоры влагалища, для генотипирования отдельных видов лактобацилл, для определения полиморфизмов генов ряда цитокинов. Таким образом, на единой технологической платформе становится возможным проведение комплексного изучения состояния влагалища как целостной экосистемы, в функционировании которой принимают участие как микроорганизмы, так и сам макроорганизм.
Однако внедрение ПЦР-РВ, как любого нового метода, в работу практических лабораторий требует всестороннего анализа возможностей его применения. Необходим сравнительный анализ диагностической ценности ПЦР-РВ с рутинными методами лабораторной диагностики, в том числе микроскопическим и бактериологическим. Первоочередной задачей является формирование группы клинически здоровых женщин, так как без определения критериев нормы невозможно интерпретация результатов у пациенток с инфекционно-воспалительной патологией влагалища. Как правило, именно создание группы нормы требует тщательного отбора. Не менее важно изучение микробиоценоза у пациенток с различной патологией влагалища с учетом данных других лабораторных методов. Это позволит скорректировать существующие классификации патологических вариантов микробиоценоза влагалища с учетом возможностей ПЦР-РВ.
Таким образом, необходимо обследование различных по возрасту, иммуно- инфекционному и репродуктивному статусу групп женщин методом ПЦР-РВ для получения комплексного описания микробиоценоза влагалища и выявления факторов, определяющих его формирование и нормальное функционирование.
Цель исследования:
Разработка критериев оценки результатов комплекса методов лабораторной диагностики микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста, включающих современные технологии молекулярно-биологического анализа.
Задачи работы:
-
Изучить микробиоценоз влагалища с использованием метода ПЦР-РВ у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста вне беременности и беременных.
-
Определить видовой состав лактобацилл и их значение в формировании вагинальной микрофлоры у женщин с нормальным и промежуточным состояниями микробиоценоза влагалища.
-
Дать комплексную оценку состояния вагинальной микрофлоры при помощи ПЦР-РВ у женщин с воспалительными заболеваниями влагалища, связанными с условно-патогенной микрофлорой.
-
Изучить состояние микробиоценоза влагалища у ВИЧ-инфицированных женщин во время и вне беременности.
-
Определить частоту встречаемости полиморфных аллелей генов, отвечающих за экспрессию основных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, у женщин с нормоценозом и пограничными состояниями вагинальной микрофлоры.
-
Определить микробные и иммуно-генетические факторы, способствующие персистенции условно-патогенных микоплазм в составе вагинальной микробиоты у женщин с нормоценозом.
7. Разработать алгоритм диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища, вызванных условно-патогенными микроорганизмами у пациенток репродуктивного возраста, с использованием ПЦР-РВ.
Научная новизна
Впервые проведена комплексная оценка качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза с помощью метода ПЦР-РВ у женщин репродуктивного возраста во время и вне беременности. Показано, что различные варианты абсолютного или условного нормоценоза влагалища у практически здоровых женщин во время беременности представляют собой микробные сообщества, устойчивые к внешним воздействиям, как по видовому составу, так и по количественному соотношению разных видов микроорганизмов.
По результатам исследования микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ установлено, что в формировании дисбиотических нарушений вагинальной микрофлоры у женщин репродуктивного возраста в отсутствие безусловных патогенов ведущая роль принадлежит ассоциациям облигатно-анаэробных микроорганизмов.
Показано, что персистенция Ureaplasma spp. и Candida spp. в диагностически значимых количествах характерна для микробиоценоза влагалища с преобладающей нормофлорой, в то время как Mycoplasma spp. персистирует в условиях доминирования облигатно-анаэробных микроорганизмов в составе вагинальной микробиоты.
Определена частота встречаемости шести видов лактобацилл, обитающих во влагалище женщин репродуктивного возраста с преобладающей нормофлорой в составе микробиоценоза (на примере популяции г.Екатеринбурга). Установлено, что доминирующими видами являются L.crispatus и L.iners (43,9% и 38,6% соответственно).
Впервые определена частота носительства полиморфизмов генов провоспа- лительных и противовоспалительных цитокинов у пациенток, состояние микробиоценоза влагалища которых соответствовало критериям абсолютного или условного нормоценоза.
Показана взаимосвязь между видовым составом нормофлоры, наличием условно-патогенных микоплазм в составе вагинальной микробиоты и индивидуальным генетическим профилем женщин. Установлено, что наличие «про- воспалительного генотипа» коррелирует с присутствием L.crispatus в качестве доминирующего вида лактофлоры во влагалище и отсутствием Ureaplasma spp. в диагностически значимом количестве, а «противовоспалительный генотип» достоверно чаще ассоциируется с присутствием уреаплазм и L.iners в качестве доминирующего вида лактобацилл.
Показано, что микробиоценоз влагалища у ВИЧ-инфицированных женщин репродуктивного возраста как во время, так и вне беременности характеризуется преобладанием облигатно-анаэробных микроорганизмов и персистенцией
Mycoplasma spp.Установлено, что на фоне антиретровирусной терапии у ВИЧ- инфицированных женщин происходит восстановление соотношения между нор- мофлорой и условно-патогенными микроорганизмами.
Практическая значимость работы
Разработан принципиально новый комплексный подход к диагностике дисбиотических нарушений микрофлоры влагалища на базе единой технологической платформы (ПЦР-РВ).
В результате клинической испытаний набора реагентов «Фемофлор» (производства ООО «НПО ДНК-Технология») для количественной ПЦР в реальном времени показана высокая диагностическая ценность тест-системы для оценки микробиоценоза влагалища у всех категорий женщин репродуктивного возраста.
Пересмотрена классификация состояний микробиоценоза влагалища с учетом возможностей метода ПЦР-РВ.
Разработаны критерии нормы и определены референсные интервалы содержания отдельных групп микроорганизмов в составе вагинальной микрофлоры при оценке вагинального микробиоценоза методом ПЦР-РВ для женщин репродуктивного возраста.
Разработан алгоритм клинико-лабораторного обследования пациенток с патологией влагалища. Определена область применения метода ПЦР- РВ в диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища, ассоциированных с условно-патогенной микрофлорой, у женщин репродуктивного возраста.
Разрабатана классификация вариантов лабораторных заключений о состоянии микробиоценоза влагалища при исследовании методом ПЦР-РВ.
Предложен комплексный подход для оценки индивидуальных генетических особенностей функционирования системы цитокинов с учетом разнонаправленно сти их эффектов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
-
Определяющей характеристикой нормального микробиоценоза влагалища у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста является количественное соотношение между нормофлорой и облигатными анаэробами, которое характеризуется присутствие лактобацилл в количестве более 80% от общей бактериальной массы и доминированием среди них L.crispatus. Состояние абсолютного и условного нормоценоза во время беременности представляет собой устойчивую систему, на которую экзогенные факторы, в том числе и лекарственная терапия, не оказывают существенного влияния.
-
Микроскопическая картина мазка вагинального отделяемого у пациенток с клиническими признаками патологии влагалища в подавляющем большинстве случаев либо неинформативна, либо не позволяет оценить степень тяжести дисбиоза, в то время как с помощью ПЦР-РВ удается установить этиологию патологического процесса более чем в 80% случаев.
-
Установлено, что в формировании дисбиоза вагинальной микрофлоры у женщин репродуктивного возраста ведущая роль принадлежит ассоциациям облигатно-анаэробных микроорганизмов, при этом структура и состав микробиоценоза влагалища значительно различаются у пациенток с не специфическим вагинитом, бактериальным вагинозом и дисбиозом не- уточненной этиологии.
-
Видовой состав лактобацилл и количество Ureaplasma spp. в составе вагинального микробиоценоза коррелируют с определенными сочетаниями нормальных и мутантных генов про- и противовоспалительных цитокинов. Установлено, что отсутствие субъективных признаков патологии влагалища у пациенток при наличии Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/ мл достоверно чаще сочетается с «противовоспалительным» генотипом организма-хозяина, что может свидетельствовать в пользу относительной толерантности местного иммунитета к персистентной инфекции.
-
Микробиоценоз влагалища ВИЧ-инфицированных женщин характеризует высокая частота дисбиотических нарушений, носительство Mycoplasma spp. и Candida spp. в диагностически значимых количествах при отсутствии клинических признаков патологии влагалища. У ВИЧ- инфицированных женщин, получающих антиретровирусную терапию, отмечается увеличение доли нормофлоры и уменьшение количества генитальных микоплазм в составе вагинальной микробиоты.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологи, кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета, кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии ФПК и ПП ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России.
Метод оценки биоценоза влагалища с помощью количественной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени внедрен в следующих лечебных учреждениях г.Екатеринбурга: ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздравсоцразвития России, ООО «Медико-фармацевтический центр «Гармония», ФБГУ Екатеринбургский клинико-диагностический центр, ООО Медицинский центр «Шанс».
Проведена клиническая апробация тест-системы Фемофлор с целью оценки диагностической чувствительности и специфичности теста для различных групп пациенток. По результатам клинической апробации написана серия статей и разработан алгоритм интерпретации результатов лабораторного исследования микробиоценоза влагалища с помощью теста «Фемофлор».
По результатам работы разработаны и утверждены методические рекомендации для врачей акушеров-гинекологов, дерматовенерологов и врачей клинической лабораторной диагностики.
Апробация работы
Основные результаты работы представлены на: межрегиональной научно- практической конференции «Современные технологии и методы лабораторной диагностики в дерматовенерологии» (Екатеринбург, 2008); всероссийской телеконференция «Новый способ лабораторной диагностики урогенитальных инфекций. Проблемы и пути решения» (Москва—Санкт-Петербург—Ростов-на-Дону—Екатеринбург—Новосибирск—Казань—Хабаровск, 2008); второй междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» в рамках Второго Международного медицинского Форума «Индустрия здоровья» (Москва, 2009); I Конгрессе акушеров-гинекологов Урала с международным участием «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2009); городской научно-практической конференции «Патология вульвы, влагалища и шейки матки: междисциплинарная проблема» (Екатеринбург, 2010); городской научно-практической конференции «Бактериальный вагиноз — современный подход к диагностике и лечению» (Екатеринбург,
-
-
-
; IV Региональном научном форуме «Дитя и мать», 2010); VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010» (Москва, 2010); I международной конференции «Инфекции и инфекционный контроль в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2011); всероссийской конференции «Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине» (Москва, 2011); IV междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (Москва, 2011), конгрессе «Мать и Дитя» (Геленджик,
-
.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 31 научная работа, в том числе 15 публикаций в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы
Методы лабораторной оценки вагинальной микрофлоры. Прямые методы оценки микробиоценоза влагалища
Когда лактобациллы перестают доминировать во влагалище, их место занимают другие микроорганизмы. Чаще всего происходит чрезмерное размножение облигатных анаэробов, включая хорошо известную Gargnerella vaginalis, а также недавно описанный Atopobium vaginae [54,159]. В результате развивается бактериальный вагиноз (БВ) [1, 2, 3, 6, 37, 143, 145, 358]. Реже в составе вагинального микробиоценоза начинают преобладать стрептококки (в том числе группы А и В), бифидумбактерии, энтеробактерии [193, 368].
Доказано негативное влияние БВ на репродуктивное здоровье женщины. С ним связывают невынашивание беременности и преждевременные роды, увеличение риска инфицирования другими возбудителями ИППП и ВИЧ [143, 144, 369]. Интенсивные исследования пока еще не позволили окончательно установить причины возникновения и особенности индивидуального течения БВ. Следует признать, что на сегодняшний день накоплено недостаточно сведений об индивидуальной вариабельности микробиоценоза влагалища и особенностях изменения бактериальной флоры в разные периоды жизни женщины.
Однако у некоторых женщин репродуктивного возраста вагинальная экосистема нормально функционирует и в отсутствие лактобацилл. Описаны случаи, когда доминирующими бактериями в составе вагинального микробиоценоза были лактат-продуцирующие Atopobium vaginae, Megasphaera spp., Leptotrichia spp. [159,162, 173). Таким образом, поддержание кислой среды, необходимой для защиты от размножения патогенных микроорганизмов, могут осуществлять не только лактобациллы, но и другие бактерии-продуценты молочной кислоты. Возможно, что в ситуации, когда лактобациллы по неизвестным пока причинам теряют свои лидирующие позиции в вагинальной экосистеме, их место занимают другие бактерии, способные вырабатывать молочную кислоту. Некоторые из них, в частности Megasphaera и Leptotrichia, способны выделять специфически пахнущие метаболиты. Соответственно неприятный запах вагинальных выделений у женщин с отсутствующей лактофлорой может быть обусловлен этими доминирующими в микробиоценозе бактериями. Открытым остается вопрос, следует ли расценивать такие состояния как БВ, особенно, если клинические признаки патологии влагалища отсутствуют? Другие представители нормальной микрофлоры влагалища Развитие молекулярно-биологических технологий позволило существенно расширить представления о видовом разнообразии вагинальной микрофлоры, так как появилась возможность выявления и типирования трудно культивируемых и некультивируемых бактерий. В течение последних лет были проведены исследования в странах Северной Америки, Африки и Европы микробиоценоза влагалища у женщин с БВ и клинически здоровых, с помощью использования метода амплификации и секвенирования 16s р-РНК генов бактерий было обнаружено, что в состав микрофлоры влагалища женщин с БВ и клинически здоровых могут входить как Lactobacillus, так и Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Eubacterium spp., Megasphaera spp., Leptotrichia spp., Bifidobacterium spp., Prevotella, Sneatia spp., Mobiluncus spp., Corynebacterium spp., Bacteroides spp., Clostridium spp. [122, 168, 183,378]. Также было показано значительное видовое разнообразие лактобацилл, о чем было сказано выше [142,297]. Выявление вновь открытых микроорганизмов, ассоциированных с БВ, предоставляет новые возможности для диагностики, что требует внедрения количественных амплифика-ционных методов в практическом здравоохранении. Однако для понимания роли отдельных представителей вагинального микробиоценоза необходимо проведение более масштабных исследований с включением в них не только «крайних» состояний вагинальной микрофлоры (нормы и БВ), но и женщин с дисбиотичес-кими нарушениями неясного генеза и разной степени выраженности.
Отдельную проблему представляют генитальные микоплазмы и грибы рода Candida, которые не являются участниками микробиоценоза влагалища в полном смысле, так как их доля не бывает значительной [11,43,72]. В то же время Candida spp. и Ureaplasma spp. прекрасно чувствуют себя в кислой среде влагалища и не конкурируют с лактобациллами за питательный субстрат. Современные пред ставлення допускают наличие этих микроорганизмов во влагалище в количествах менее 104 ГЭ/мл. Однако у части клинически здоровых женщин Candida spp. и Ureaplasma spp. выявляют в больших количествах. Большинство исследователей склоняются к точке зрения, что наличие или отсутствие клинических проявлений воспалительного процесса во влагалище при персистенции уреаплазм и Candida spp. обусловлены индивидуальными особенностями вагинального иммунитета.
Candida spp. устойчива к кислой среде влагалища и обнаруживается у 10-20% женщин репродуктивного возраста. Концентрация этого микроорганизма низкая, поэтому носительство в большинстве случаев оказывается бессимптомным. Тем не менее, в ситуации локального иммунодефицита (в результате полового контакта или местной аллергической реакции) создаются благоприятные условия для размножения грибов Candida spp. и трансформации их в более инвазивные формы [40]. В результате у пациентки развивается клиника острого вагинита.
Облигатные патогены (Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoea, Mycoplasma genitalium) — наличие этих микроорганизмов даже в небольших количествах вызывает серьезные заболевания урогенитально-го тракта. Оценка количества присутствующих микроорганизмов в данном случае практически не имеет клинического значения и при использовании прямых методов исследования предпочтение отдается качественным (ответ «ДА/НЕТ») методам с максимальной чувствительностью. На сегодняшний день наиболее целесообразным скрининговым методом выявления патогенной микрофлоры безусловно являются молекулярно-генетические методы, использующие технологию амплификации [59, 61, 71).
Условно-патогенная микрофлора (УПМ) - представлена широким спектром Грам+ и Грам-бактерий и несколькими видами грибов, которые могут присутствовать в норме во влагалище. В связи с этим разделение большинства пред ставителей микрофлоры влагалища на нормофлору и УПМ является достаточно условным.
Само по себе присутствие какого-либо вида из их числа (например, Gardnerella vaginalis или Candida albicans) не несет практически никакой диагностической информации. Попытки качественного определения данных микроорганизмов с помощью различных методов, имеющих различную чувствительность, часто приводят к противоречивым результатам и плохо согласуются с клиническими данными.
Причиной этого являются колебания численности различных микроорганизмов на фоне большой вариабельности общей обсемененности влагалища. Теперь стало очевидным, что различные тесты (ИФА, качественная ПЦР-диагностика), высоко значимые при заболеваниях, вызванных облигатными патогенами, не обеспечивают адекватную этиологическую диагностику при инфекциях, вызванных УПМ.
Патогенные свойства УПМ проявляются лишь при условии нарушения механизмов врожденного и приобретенного иммунитета и снижении местной колонизационной резистентности макроорганизма. Кроме того современная диагностика должна учитывать возможную этиологическую роль широкого спектра микроорганизмов, а не только какого-либо конкретного возбудителя, как при диагностике ИППП . Сегодня, применительно к УПМ, все чаще используется термин «дисбиотические нарушения» или «дисбиоз» в отличие от ИППП.
Алгоритм формирования лабораторного заключения
Микроскопию вагинального отделяемого, окрашенного метиленовым синим и по Романовскому-Гимзе, провели всем без исключения обследованным женщинам. Всего было изучено 1807 образцов.
При оценке микроскопической картины принимали во внимание количество и тип эпителиальных клеток, количество лейкоцитов, характер микрофлоры. Классификацию микробиоценоза влагалища по результатам микроскопического исследования проводили в соответствии с рекомендациями Кира Е.Ф. (2001).
1. Нормоценоз, характеризующийся доминированием лактобацилл, отсутствием грамотрицательной микрофлоры, спор и мицелия дрожжеподобных грибов, наличием единичных лейкоцитов и «чистых» эпителиальных клеток, соответствующих фазе менструального цикла.
2. Промежуточный тип характеризуется умеренным или сниженным количеством лактобацилл, наличием кокков. Обнаруживаются лейкоциты, моноциты, макрофаги, эпителиальные клетки. Является пограничным типом, часто наблюдается у здоровых женщин, редко сопровождается субъективными жалобами и клиническими проявлениями.
3. Дисбиоз влагалища, выражающийся в незначительном количестве или полном отсутствии лактобацилл, обильной полиморфной грамотрицательной и грамположительной палочковой и кокковой микрофлорой; наличием «ключевых клеток». Количество лейкоцитов вариабельно, отмечается отсутствие или незавершенность фагоцитоза.
4. Вагинит (воспалительный тип мазка) - полимикробная картина мазка с большим количеством лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, отмечается выраженный фагоцитоз. При обнаружении гонококков, трихомонад, мицелия, псевдогифов, спор выставляется соответствующий этиологический диагноз. В случае отсутствия этиологически значимых микроорганизмов при таком вари анте микроскопической картине пациенткам ставят диагноз неспецифического вагинита. Количественная ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени для оценки микробиоценоза влагалища
Для оценки микробиоценоза влагалища методом ПЦР-РВ использовали набор реагентов Фемофлор (ООО "НПО ДНК-Технология", Москва). Всего было изучено 1807 вагинальных образцов.
Набор реагентов Фемофлор предназначен для выявления ДНК условно-патогенных микроорганизмов, ДНК лактобацилл и геномной ДНК человека (в качестве контроля взятия биологического материала). Данное исследование предназначено для исследования качественного и количественного состава микробиоценоза урогенитального тракта.
Принцип метода основан на использовании процесса амплификации ДНК, заключающемся в повторяющихся циклах: температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой.
Набор реагентов Фемофлор включает: смесь для ПЦР-амплификации, специфичную для всех бактерий (общая бакмасса), смесь, специфичную для нор-мофлоры (Lactobacillus spp) и смеси, специфичные для условно-патогенных микроорганизмов. В наборе реагентов Фемофлор в одну из пробирок со смесью для амплификации добавлен внутренний контрольный образец (ВК), предназначенный для оценки эффективности протекания полимеразной цепной реакции. Одна из пробирок содержит смесь для амплификации геномной ДНК человека, предназначенная для контроля взятия клинического материала.
В реакционную смесь для проведения ПЦР введены ДНК-зонды, каждый из которых несёт флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации.
ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации ДНК общей бакмассы, лактобацилл и большинства условно-патогенных микроорганизмов, помечены флуоресцентными метками FAM, ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации внутреннего контрольного образца, контроля взятия материала и микоплазмы генитальной, помечены HEX. Пробирки для амплификации различных мишеней объединены в стрип по 8 пробирок. Использование двух флуоресцентных красителей (FAM и HEX) позволяет сократить количество пробирок, так как позволяет одновременно регистрировать результаты двух разных реакций амплификации, одновременно проходящих в одной пробирке.
После прохождения амплификации, по показателю индикаторного цикла программно рассчитывается количество общей бакмассы, лактобацилл и каждого из условно-патогенных микроорганизмов. По их соотношению можно судить о состоянии микробиоценоза. Для исключения ложноотрицательных результатов учитывается показатель амплификации геномной ДНК человека, (контроль взятия биологического материала).
Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенных прослойкой из парафина. Смешение слоев и превращение их в реакционную смесь происходит только при плавлении парафина, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки.
В определенные пробирки (см. Таблица 6) добавлен олигонуклеотид, меченный ROX. Он используется программным обеспечением прибора ДТ-96 как маркер определения положения стрипа в плашке.
Оценка микробиоценоза влагалища у женщин с различной инфекцион но-воспалительной патологией влагалища
Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического пакета SPSS Statistics версии 17.0 и свободно распространяемого продукта WINPEPI версия 9.7. Исследуемые выборки не подчиняются закону нормального распределения. В качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки — верхний и нижний квартили, указанный в виде 5%, 25%,75% и 95% процентилей. Для построения классификационной функции был использован дискриминантный анализ. Непосредственная оценка эффективности модели была получена с помощью расчета численного показателя площади под кривой (AUC) с помощью метода трапеций.
Визуализацию распределения параметров в группах проводили с помощью соответствующих частотных гистограмм. Для качественных переменных рассчи тывались абсолютные и относительные (процентные) величины. Минимальный размер выборки был рассчитан с помощью номограммы Альтмана. Для оценки достоверности различий в группах применяли непараметрические критерии: х2, точный критерий Фишера (ср), критерий Манна-Уитни (z), критерий Вилкоксона (Z). Причинно-следственные связи определялись в ходе корреляционного анализа Спирмена (rs). Статистически значимыми считали различия между сравниваемыми рядами с уровнем вероятности 95% (р 0,05). При составлении диагностической таблицы применялся последовательный анализ, разработанный А. Вальдом. Для расчета чувствительности, специфичности прогностических признаков, прогностической ценности положительного результата теста, отрицательного результата теста выстраивалась четырехпольная таблица с последующим определением показателей.
Появление тест-системы Фемофлор для оценки качественного и количественного состава вагинальной микрофлоры методом ПЦР-РВ потребовало разработки четкого алгоритма формирования лабораторных заключений по результатам исследования с целью предоставления врачам клинической оценки полученных данных.
В первую очередь при анализе результатов исследования следует обращать внимание на качество биоматериала, поступающего в лабораторию и, как следствие, на контроль пре-аналитического этапа.
При исследовании 727 образцов, полученных врачами-клиницистами для проведения клинических испытаний набора реагентов Фемофлор, было проанализировано количество эпителиальных клеток человека, попавших в каждый образец. Для этого в наборе реагентов Фемофлор предусмотрен анализ контроля взятия материала (КВМ). Значения КВМ колебались в пределах от 0 ГЭ/образец до 105 7 ГЭ/образец, что свидетельствовало о неоднородности взятия материала разными врачами и неоднородности взятия материала от образца к образцу одним и тем же врачом. Для стандартизации оценки взятия биоматериала было предложено ввести в анализ линию отсечки для КВМ. Для выбора линии отсечки провели анализ таблицы частот и определили, каким образом значения КВМ распределены в выборке.
Значение КВМ меньше 104 ГЭ/образец свидетельствует о недостаточном количестве эпителиальных клеток человека, попавших в пробу. Низкое значение КВМ следует интерпретировать как нарушение процедуры взятия биоматериала, что может повлечь за собой некорректную оценку исходного соотношения нормальной и условно-патогенной микрофлоры.
Относительный показатель нормофлоры представлял собой разницу логарифмов полученных для ОБМ и нормофлоры. При величине данной разницы 1 расценивали снижение нормофлоры как значительное. Относительный показатель УПМ представлял собой разницу логарифмов нормофлоры и конкретного микроорганизма и в норме должен быть не менее 3.
По результатам клинических испытаний тест-системы Фемофлор на образцах вагинального отделяемого, полученных от женщин репродуктивного возраста, как клинически здоровых, так и с различной инфекционно-воспалительной патологией влагалища был предложен иной метод анализа результатов лабораторного заключения, позволяющий учитывать взаимное содержание (доли) нормофлоры и УПМ. Было изучено 727 образцов вагинального отделяемого (35 из них было исключено из исследования из-за неадекватного значения контролдя взятия материала) от 282 условно здоровых женщин и 410 пациенток с инфекционно-воспалительной патологией влагалища. С целью расчета долевого содержания нормофлоры и УПМ рассчитывали сумму всех выделенных микроорганиз мов, к анализу принимали только те пробы, в которых сумма абсолютных количеств всех выделенных микроорганизмов была сопоставима с абсолютным количеством ОБМ. Долю нормофлоры рассчитывали как процентное отношение абсолютного ее количества к сумме всех выделенных микроорганизмов. Соответственно долю УПМ рассчитывали как процентное отношение их абсолютного количества к сумме всех выделенных микроорганизмов.
Для объективной оценки состояния микробиоценоза влагалища по результатам ПЦР-РВ с помощью дискриминантного анализа была разработана линейная модель, включающая доли нормофлоры и УПМ (облигатных и факультативных анаэробов. Было установлено, что содержание норфорлоры более 80%, а УПМ менее 20% в составе микробиоценоза специфично для состояния вагинальной микрофлоры у клинически здоровых женщин — нормоценоза. Снижение доли нормофлоры менее 20% и увеличение доли УПМ более 80%) в составе микробиоценоза специфично для выраженных инфекци-онно-воспалительных заболеваний влагалища, ассоциированных с УПМ — выраженного дисбиоза. Для оценки способности предложенной модели выявлять нормоценоз была построена ROC-кривая. Площадь под ROC-кривой составила 0,907 (0,817-0,997), р=5,9х10Л Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как отличную. В качестве отсечки принято значение классификационной функции, соответствующее максимальной сумме чувствительности и специфичности. Значение cut-off составило -1,111. Значения классификационной функции значения cut-off классифицировались как нормоценоз. Для выбранного значения cut-off диагностическая чувствительность данного исследования для выявления дисбио-тических состояний составляет 88,7%о, специфичность — 89,6% .Для оценки способности предложенной модели выявлять выраженный дисбиоз была построена ROC-кривая. Площадь под ROC-кривой составила 0,904 (0,745-1,000), р=4,0х10"
Анализ закономерностей изменений микробиоценоза влагалища в зависи мости от исходного состояния в течение беременности
Вагинальный микробиоценоз представляет собой сложную динамическую систему, находящуюся в каждый отдельный момент времени в равновесном состоянии, обусловленном множеством эндогенных и экзогенных факторов (следует уточнить, что понятия нормы и равновесия не являются тождественными).
Состояние этой системы зависит от возраста, репродуктивного поведения и акушерско-гинекологического анамнеза, гормонального статуса, использования заместительной гормональной терапии и комбинированных оральных контрацептивов (КОК), антибиотикотерапии, наличия экстрагенитальной патологии. Также следует учитывать влияние социокультурных факторов, таких как национальные традиции, использование средств интимной гигиены и ношение тесной обтягивающей одежды, интимный пирсинг и другие травмирующие косметические процедуры в области гениталий. Реклама определенного стиля жизни существенно изменила представление самой женщины о норме применительно к состоянию вульвы и влагалища. Как следствие изменилась практика использования части женщин средств интимной гигиены, широкое распространение приобрело самостоятельное применение вагинальных антисептических, антибактериальных и антимикотических средств.
Тем не менее, понятие нормы применительно к микробиоценозу влагалища это медицинская категория, основанная прежде всего на четких представлениях о количественном и качественном составе вагинальной микрофлоры .
Современные молекулярно-биологические методы исследования позволяют оценить и уточнить как качественную, так и количественную структуру микробиоценоза влагалища. Однако для их внедрения в практическое здравоохранение особо пристального внимания требует определение нормальных и патологических характеристик вагинальной экосистемы у различных групп женщин
В силу различных медико-социальных причин именно определение критериев клинического здоровья женщин вызывает наибольшие затруднения у врачей акушеров-гинекологов и дерматовенерологов. Тем не менее, клинически здоровыми с точки зрения состояния влагалища женщину признают при соблюдении следующих условий: 1. Отсутствие субъективных признаков патологии влагалища (жалобы на патологические бели, зуд, жжение во влагалище). 2. Отсутствие объективных признаков патологии влагалища (выявление патологических белей, гиперемии слизистой влагалища при осмотре в зеркалах). 3. Нормоценоз по результатам микроскопического исследования. 4. Отсутствие облигатно-патогенных микроорганизмов (трихомонад, гонококков, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium).
Однако результаты исследования микробиоценоза влагалища, получаемые методом ПЦР-РВ, не всегда укладываются в привычные представления о норме и потому требуют дополнительного осмысления и встраивания в традиционные клинико-диагностические схемы. Поскольку результаты микроскопического исследования и исследования методом ПЦР-РВ в значительной части случаев не совпадают, то у клинически здоровых женщин возможно выявление иных вариантов микробиоценоза влагалища, кроме как абсолютный нормоценоз. Это не означает, что эти пациентки будут однозначно нуждаться в назначении лечения. Однако результатом анализа структуры микробиоценоза влагалища у клинически здоровых женщин возможно станет рекомпозиция представлений о норме и патологии применительно к микробиоценозу влагалища. Поэтому очень важно понимать, какие варианты микробиоценоза влагалища и с какой частотой могут быть выявлены у клинически здоровых женщин при использовании ПЦР-РВ в различные возрастные периоды и с различным репродуктивным статусом. Для решения этой задачи были обследованы 460 клинически здоровых женщин, которые были разделены на две подгруппы в зависимости от их репродуктивного статуса:
230 клинически здоровых женщин репродуктивного возраста вне беременности в возрасте 19-45 лет (средний 30± 4,9), обратившихся к гинекологу с целью профилактического осмотра или предгра-видарной подготовки. Следует заметить, что включение пациенток позднего репродуктивного возраста (36-45 лет) в группу обследуемых производили только в том случае, если у женщин отсутствовали признаки угасания репродуктивной функции (присутствовали регулярные менструации, отсутствовали УЗИ-признаки истощения яичников, показатели гормонального статуса также отвечали нормам репродуктивного возраста).
230 клинически здоровых беременных женщин. В группу клинически здоровых женщин репродуктивного возраста вне беременности вошли 230 беременных женщин в возрасте 19-33 лет (средний 27± 3,2), в том числе 140 женщин в 1 триместре (4-12 недель беременности), 50 во II триместре (13-28 недель беременности), 40 женщин — в III триместре (29-36 недель беременности).
Структура микробиоценоза влагалища по результатам ПЦР-РВ у женщин репродуктивного возраста вне беременности
Структура микробиоценоза влагалища по результатам ПЦР-РВ у женщин данной группы представлена на Рисунке 6.
Критериям абсолютного нормоценоза состояние микробиоценоза влагалища соответствовало у 128 (55,7%) женщин, условного нормоценоза — у 74 (32,2%) женщин. В 68,9% случаев относительный нормоценоз был обусловлен присутствием уреаплазм в количестве 104 ГЭ/мл, в 25,7% — Candida spp., в 5,4% одновременно выявляли уреаплазму и кандиду (см. рисунок 7).
У 55 (23,9%) из 230 клинически здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста были выявлены уреаплазмы в количестве более 104 ГЭ/мл. 9%
Грибы рода Candida в количестве более 104 ГЭ/мл выявляли у 23 (10%) женщин. Полученные данные показали, что у части женщин присутствие этого микроорганизма в значительных количествах не приводит к появлению симптомов урогенитального кандидоза. Поскольку кандиды существуют в тех же условиях, что и лактобациллы, они не чувствительны к изменению рН и не конкурируют с нормофлорой, поэтому их интенсивное размножение не приводит к уменьшению количества лактобацилл. Таким образом, интерпретацию результатов метода ПЦР-РВ необходимо проводить очень осторожно, важно учитывать клинические данные конкретной пациентки.
Дисбиоз вагинальной микрофлоры был мало характерен для клинически здоровых женщин репродуктивного возраста: только у 7 (3%) женщин состояние микробиоценоза влагалища соответствовало критериям выраженного дисбиоза и у 21 (9,1%) - умеренного дисбиоза. С другой стороны, полученные данные свидетельствуют о том, что каждая 10-я клинически здоровая женщин имела патологический вариант микробиоценоза влагалища, что позволяет отнести ее в группу риска по развитию воспалительных осложнений во время беременности или при инвазивных гинекологических манипуляциях. Возникает закономерный вопрос о правильности отнесения этих женщин в группу нормы изначально. Следует предполагать, что отсутствие клинических проявлений дисбиоза влагалища было обусловлено пониженной индивидуальной реактивностью у пациенток. С другой стороны необходимо помнить, что субъективна не только собственная оценка своего состояния женщиной, но и оценка врача. Настораживает тот факт, что не было выявлено микроскопических маркеров дисбиоза у этих пациенток. Для того, чтобы разобраться в причинах этого явления, изучили структуру дисбиозов у женщин данной группы (см. рисунок 8).
Похожие диссертации на СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА
-
-
-
