Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Особенности систематики дрожжеподобных грибов Candida albicans 11
1.2 Структурно - функциональная характеристика клетки Candida albicans 12
1.3. Цитологические особенности клетки в различных условиях роста...14
1.4. Морфология гриба Candida albicans 16
1.5. Распространение Candida albicans в природе 20
1.6. Кандиданосительство и кандидоз 21
1.7. Патогенез и клинические проявления 23
1.8. Адгезия и адгезины С. albicans 29
1.8.1. Рецепторы клеточной стенки 30
1.8.2. Адгезия к белкам экстрацеллюлярного матрикса 31
1.8.3. Маннановые адгезины и другие связывающие белки 37
1.9. Существующие модели in vitro для изучения адгезии штаммов 39
1.10. Антигены С. albicans 41
1.10.1. Динамика антигенной структуры 45
1.11. Экстракция компонентов клеточной стенки 46
Экспериментальная часть
Глава 2.Материалы и методы 48
2.1. Объекты исследований 48
2.1.1. Выделение и посев материала, количественный учет клеток С. albicans 49
2.1.2. Идентификация грибов С. albicans 50
2.2. Питательные среды 53
2.3. Растворы и реактивы 54
2.4. Аппаратура и техника измерений 56
2.4.1.Устройство амперометрического гтмуноферментного сенсора 57
2.5. Определение уровня адгезии штаммов С. albicans 58
2.5.1. Приготовление нитроцеллюлозной пленки. 58
2.5.2 Иммобилизация белков на нитроцеллюлозную пленку 59
2.5.3. Приготовление суспензии клеток С. albicans 59
2.5.4. Определение количества адгезировавшихся клеток 60
2.6. Влияние химических и биологических веществ на адгезию клеток С. albicans 60
2.6.1. Влияние трипсина и маннопротеидного антигена клеточной стенки С. albicans на адгезию клеток 60
2.6.2. Влияние экстракта мщелиальных грибов на адгезию клеток С. albicans 61
2.7. Обработка экспериментальных данных 62
2.8 Определение содержания количества антигена клетками С. albicans...62
2.8.1. Получение антигенов 62
2.8.2. Определение концентрации антигена С. albicans 63
Глава З.Результаты исследований и их обсуждение 65
3.1. Разработка модели адгезии С. albicans на нитроцеллюлозной пленке 65
3.1.1. Изучение связывания клеток гриба 67
3.1.2. Выбор условий проведенияпроцесса адгезии 70
3.1.3. Тестирование модели адгезии клиническими штаммами
С. albicans, выделенными из различных мест локализации 77
3.2. Сопоставление адгезивных характеристик штаммов как критерий оценки адекватности различных моделей адгезии 79
3.3. Изучение влияния трипсина и маннопротеидного антигена на адгезию клеток 81
3.4. Адгезивные свойства клинических штаммов с различной степенью чувствительности к противогрибковым препаратам 83
3.5. Использование модели на основе нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином для изучения адгезивных свойств штаммов Candida albicans при кандидозах различной локализации 87
3.5.1. Адгезивные свойства штаммов C.albicans выделенных с поверхности кожи 87
3.5.2. Адгезивные свойства штаммов C.albicans, выделенных со слизистых ротовой полости 91
3.5.3. Адгезивные свойства штаммов C.albicans выделенных со слизистых влагалища 93
3.5.4. Адгезивные свойства клинически незначимых штаммов C.albicans различной локализации ... 95
3.6. Адгезивные свойства штаммов С. albicans в микробных ассоциациях с мицелиальными грибами 99
3.7. Сопоставление адгезивных и антигенных свойств клинических штаммов - основных факторов патогенности С. albicans 105
Заключение 108
Выводы 112
Список литературы 114
- Особенности систематики дрожжеподобных грибов Candida albicans
- Адгезия к белкам экстрацеллюлярного матрикса
- Выделение и посев материала, количественный учет клеток С. albicans
- Разработка модели адгезии С. albicans на нитроцеллюлозной пленке
Введение к работе
Постановка проблемы, ее актуальность. В последнее время неуклонно увеличивается заболеваемость кандидозом, при этом наиболее частым возбудителем остается Candida albicans [14,34,36,56]. Показано наличие штаммов, обладающих выраженными дерматонекротическими, адгезивными и гемолитическими свойствами, и отличающихся по ряду биологических свойств от штаммов, выделенных от здоровых лиц. В то же время даже среди штаммов-комменсалов могут встречаться штаммы, способные, под воздействием определенных экзогенных или эндогенных факторов, вызывать широкий спектр поражений.
На практике потенциальную патогенность принято характеризовать наличием и проявлением факторов патогенности, основанных на физиологических особенностях грибковой клетки и характере ее взаимодействия с макроорганизмом, которые способствуют закреплению гриба в организме и развитию заболевания [12]. Многие современные тесты (начиная с «феномена ростовых трубочек», определения активности ферментов и, наконец, ГЩР), лишь идентифицируют С. albicans. Наиболее распространенным лабораторным критерием тяжести течения кандидоза является определение величины титров маннанового антигена клеточной стенки С. albicans, проявляющего выраженную сенсибилизирующую активность [34]. Однако, на сегодняшний день не выработано четких лабораторных критериев, позволяющих однозначно охарактеризовать патогенность штамма и разграничить кандидоз и кандиданосительство. Экспериментальное заражение животных для определения патогенности С. albicans в практических лабораториях не используется.
В связи с этим важным дополнением к установлению патогенности штамма является изучение взаимосвязи основных факторов патогенности грибов (адгезии, уровня антигенов) у различных клинических штаммов С. albicans с целью выяснения их соотношения при различных проявлениях кандидоза. В этом плане использование комплексного подхода может способствовать разработке единого лабораторного теста для определения уровня патогенности штамма С. albicans.
Известно, что любой инфекционный процесс начинается с адгезии возбудителя на клетках-мишенях. Все С. albicans обладают выраженной способностью прикрепляться к органическим и неорганическим субстратам. В настоящее время стало возможным измерять степень адгезии. Установлена четкая корреляция между способностью гриба к адгезии и его вирулентностью в эксперименте [141].
Таким образом, поскольку адгезия гриба к клеткам и тканям макроорганизма является первоначальной ступенью инвазии грибковых клеток и одним из основных факторов патогенности, приводящей к развитию кандидоза, было бы чрезвычайно интересно изучить адгезивные свойства клинических штаммов с целью выяснения их связи с особенностями проявления заболевания.
В этом плане представляет интерес разработка легко воспроизводимого метода определения адгезивной активности штаммов. Существующие в настоящее время модели адгезии из-за разнообразия условий существования штаммов, приводящей к выборочной экспрессии различных механизмов адгезии не являются абсолютно адекватными и удобными для исследования большого количества штаммов [25,31,34].
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение основных факторов патогенности (адгезии и уровня антигенов) у различных клинических штаммов С. albicans in vitro для выяснения их отношения при различных формах кандидоза. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Разработать новую модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов.
2. Исследовать адгезивные свойства штаммов, выделенных от больных с кандидозами различной локализации.
3. Изучить и сопоставить два различных по своему характеру факторов патогенности (адгезины и антигенная активность) с учетом конкретной локализации грибов.
4. Оценить влияние присутствия прочих патогенных и условно-патогенных грибов на адгезивные свойства С. albicans.
Научная новизна работы. Предложена доступная модель оценки адгезивной активности С. albicans на нитроцеллюлозных пленках с иммобилизованным гемоглобином. Используемая пленка имеет постоянные свойства, что позволяет проводить исследование большого количества штаммов в идентичных условиях, тем самым, делая возможной стандартизацию предлагаемого метода определения адгезивных свойств.
Впервые проведено сопоставление адгезивной и антигенной активности С.albicans in vitro на различных клинических штаммах, включая и музейный штамм. Исследования показали отличия в биологических и биохимических свойствах штаммов, в том числе, в зависимости от их мест локализации в макроорганизме. Выявлена корреляция между различными характеристиками вирулентных свойств кандид. Штаммы с высоким процентом адгезии содержали большое количество антигена в клетках.
Изучено влияние условий культивирования штаммов на экспрессию факторов патогенности. Подобраны оптимальные условия (состав среды культивирования, температура, рН среды инкубации и т.д.) для проведения эксперимента in vitro, наиболее приближенные к жизнедеятельности кандид в макроорганизме. Получены результаты об изменении адгезивной активности С. albicans под влиянием экстрактов из патогенных и условно-патогенных грибов..
Практическая ценность работы. Предложена доступная и легко воспроизводимая модель определения уровня адгезии штаммов дрожжеподобных грибов. Эту модель характеризуют постоянные свойства носителя, что позволяет определять адгезивные свойства большого количества штаммов в идентичных условиях, тем самым, делая возможной стандартизацию метода.
Использование предлагаемой модели помогает быстро дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы по проявляемому ими уровню адгезии к белкам (в частности, гемоглобину).
Использование комплексного подхода к изучению патогенных свойств штамма (адгезивной и антигенной активности), позволит систематизировать штаммы по их способности быстро колонизировать, инфицировать, и «избегать» защитные механизмы макроорганизма.
Результаты исследования могут быть использованы как один из критериев диагностики кандидоза и прогнозирования микотических осложнений у больных с иммунодефицитами.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана модель in vitro для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов с использованием иммобилизованного гемоглобина в качестве субстрата адгезии.
2. Выявлены значительные различия в адгезивных свойствах среди лабораторных и клинических штаммов С. albicans, выделенных от больных с различными формами кандидоза.
3. Адгезия и антигенная активность клинических штаммов С. albicans коррелирует между собой.
4. Разработан и рекомендуется к применению новый способ оценки патогенного потенциала клинических штаммов С. albicans.
Апробация работы.
Результаты работы докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматовенерологии. XXI век» (Казань, 2003), Научно-практической конференции по медицинской микологии (VIII Кашкинские чтения, С.-Петербург, 2005г.), IX Всероссийском Съезде дерматовенерологов (Москва, 2005г.), IV Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2006г.), IX Кашкинских чтениях (С.-Петербург, 2006г.), V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2007г.), X Кашкинских чтениях (С.Петербург, 2007г.), XVII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007г.), II Съезде микологов России (Москва, 2008г.).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 17 работ. Из них 4 статьи и 13 тезисов докладов на всероссийских конференциях.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 21 рисунков. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 164 источника (в том числе 130 иностранных автора).
Особенности систематики дрожжеподобных грибов Candida albicans
Одноклеточная организация всех дрожжеподобных грибов накладывает столь существенный отпечаток на их внешний облик и на методы работы с ними, что систематика дрожжей долгое время развивалась вполне независимо от систематики мицелиальных грибов. До середины XX в. все одноклеточные грибы рассматривались в качестве достаточно обособленной таксономической группы аскомицетов. В традиционной схеме все бесполые стадии и виды с неизвестной половой стадией списывались в формальный отдел Deuteromycota. Сейчас считается окончательно доказанным полифилитическое происхождение таких крупных дрожжевых родов, как Candida, их независимое возникновение среди аскомицетовых и базидиомицетовых грибов. Результаты молекулярно-генетических исследований избавляют от многих неточностей и ошибок, связанных с классификацией разных анаморф одной телеоморфы, морфологических вариантов одного вида, которыми грешила традиционная классификация, основанная на внешних признаках телеоморф. Род Candida - самый крупный среди дрожжевых грибов, включающий около 200 видов (более 20% всех известных видов дрожжей). Он представляет собой искусственную, филогенетически гетерогенную группу дрожжевых и дрожжеподобных организмов без полового размножения и каких-либо иных выразительных морфологических признаков [3]. В последнем издании определителя патогенных и условно патогенных грибов- [32]; все Candida относят к анаморфным дрожжам аскомицетового аффинитета.
Вид Candida albicans является наиболее ярким представителем данного рода. Возбудителя молочницы впервые описал Gruby в 1842 г., а в 1853 г. Robin дал ему название Oidium albicans. В последующие годы предлагались разные названия, и в 1923 г. Berkhout предложил дать данному возбудителю родовое имя Candida [34].
Дрожжевая клетка имеет все основные структуры, которые присущи любой эукариотической клетке, но в то же время она обладает особенностями, свойственными грибам, т. е сочетанием признаков как растительной, так и животной клеток: клеточная стенка у них ригидная, как у растений, но в клетке отсутствуют хлоропласты и накапливается гликоген, как у животных.
Такие структуры, как ядро с двойной мембраной, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и его производные, обнаруживаются в клетке во все периоды клеточного цикла. Существенные различия наблюдаются в ультраструктурной организации и поведении отдельных органелл в зависимости от возраста клетки, внешних условий, стадии онтогенеза.
На особенности патогенеза грибковых инфекций, несомненно, оказывает влияние строение грибной клетки, имеющее некоторое сходство с клетками растений [29, 34].
Цитоплазматическая мембрана, или плазмолемма, окружающая дрожжевую клетку, играет роль барьера проницаемости и контролирует транспорт веществ, в клетку и из неё. Мембрана представляет собой трехслойную структуру и состоит из двух слоев фосфолипидов, в которые погружены белковые молекулы. Кроме того, в состав мембраны входят ферменты, участвующие в биосинтезе клеточной стенки.
Дрожжевая клетка окружена ригидной структурой - клеточной стенкой, которая защищает протопласт от осмотического разрыва и придает клетке определенную форму.
Клеточную стенку долго рассматривали как почти инертную структуру, что обеспечивает жесткость и защиту в протопласте. Сегодня, как хорошо установлено, клеточная стенка является структурой неотъемлемо связанной в почти каждом аспекте биологии и патогенетики у С. albicans. Медиаторы клеточной стенки являются началом в физическом взаимодействии между микроорганизмом и окружающей средой, включая хозяина. На этом основании, клеточная стенка является средоточием многочисленных исследований в разъяснении основных биологических процессов и функциональных механизмов, регулирующих синтезы, организации и взаимодействие окружающей среды с этим комплексом макромолекулярной структуры [54].
Состоит клеточная стенка в основном из полисахаридов с небольшим включением других веществ - белков, липидов. Клеточная стенка С. albicans имеет глюкановый и маннановый слои. В гидролизате клеточной стенки С. albicans доминирует три моносахарида: D-глюкоза, D-манноза и N-a4eTmi-D-глюкозамин, из которых и построены основные полимеры клеточной стенки - (З(І-З)-глюкан, сс-маннан и хитин. Хитин аккумулируется, в основном, в почечных рубцах. Структурный основной компонент клеточной стенки, ответственный за ее ригидность - полисахарид Р-глюкан. Он образует микрофибриллярную сеть непосредственно вокруг цитоплазмотической мембраны. Структурные маннопротеиды, в комплексе с белками образуют аморфный внешний слой. Эти два слоя разделены промежуточным слоем с повышенным содержанием белков. Маннановые цепи обычно прикреплены к остаткам аспарагина или серина в белке. Маннан может использоваться клеткой в качестве резервного источника углерода, поэтому его содержание значительно колеблется в зависимости от условий роста.
Адгезия к белкам экстрацеллюлярного матрикса
Предполагается; что связывание С. albicans, в дрожжевой фазе с иммобилизованными: человеческими основными; мембранными гликопротеинами и эндотелиальными белками (ламинин; фибронектин, энтактин и вибронектин) происходит, по крайней; мере, частично; с помощью) интегриновых аналогов (или гомологов),: присутствующих на поверхности грибковых клеток--[48, 49, 64, 74, 85; 103, 104 137, 138].!
Ламинин - связывающие компоненты вносят вклад в патогенность участием; в адгезии к лигандам хозяина и?: закреплением; гриба в тканях хозяина,- поскольку ламинин является основным компонентом базальной мембраны, [154] . Имеются данные о связывании ламинина, к; трубкам прорастания на среде 199 [44]. С помощью- непрямой иммуннофлуоресценции установлено, что дрожжевые клетки; выросшие на среде Lee не связывались с ламинином. Помимо: этого связывание с ламинином уменьшалось при введении фибриногена, сывороточного альбумина или некоторых Сахаров, т.е. предполагается, что связывание не лектин-подобное.
Реакция с ламинином обнаруживалась только в.экстрактах интактных дрожжевых клеток. Имеются сообщения о двух полипептидах, связывающих ламинин с молекулярной массой 37 кДа (р37) и 67 кДа (р67) [113]. Причем р67 реагировал с конканавалином А, а р37 нет [50]. Размер этих компонентов сходен с человеческим высокоафинным ламининовым рецептором и антитела к нему использовали для анализа кандидозных протеинов [113]. Рецепторы гетерологично распределяются по клеточной поверхности, но не совместно друг с другом и зоны распределения их отличаются [114]. Рецептор р37 содержит коллаген-подобный домен и убиквитинтподобные
эпитопы, которые могут обладать структурными, регуляторными и связывающими мотивами. Рецептор р67 не содержит убиквитиновых участков, в этом могут быть их различия в функциях [142].
Недавно появилось сообщение, в котором показана, способность большого числа белков клеточной стенки связываться с ламинином [71]. Работа проведена с экстрактами без диализа и другой обработки, которая изменяет профиль белков экстрактов. Адгезия ингибируется некоторыми сахарами и пептидами, включая синтетический пептид из ламининовых р-цепей, хотя сам ламинин не был очень эффективен.
Фибронектин - связывающие компоненты. Начальное изучение адгезии клеток С. albicans к эндотелию предполагало роль фибронектина как наиболее яркого лиганда адгезии гриба [99, 105, 140,146]. Фибронектин — это большой (440 кДа) димерный гликопротеин, который циркулирует в плазме и является основной частью ЭЦМ. Идентифицированы различные функциональные домены этой молекулы, они включают связывающие домены для фибрина, коллагена, ДНК, клеток содержащих RGD-последовательности и гепарин.
Во многих лабораториях проводились исследования фибронектинового рецептора. Однако использование многими лабораториями различных методов исследования и разница, как в экспериментальных условиях, так и между штаммами приводило к получению отличий в результатах [126]. Обнаруженные различные значения, указывали на присутствие множественных адгезинов. Связывание ингибировалось маннаном и снижалось после протеолитической обработки поверхности клеток.
Первый рецептор показал, что связывание растворимого фибронектина к дрожжевым клеткам, насыщалось приблизительно 8000 точками связывания на клетку. Связывание было быстрым и не изменялось в 2-х часовом периоде. В дальнейшем изучении найдено два класса связывающих точек: малое количество (ок 5000 на клетку) с высокоафинным связыванием и большое количество (ок 30000 на клетку) с низкоафинным связыванием [106]. В изучение использовали широкий круг концентраций, что помогло облегчить определение двух классов связывания.
Различия обнаружились и по действию ионов, в частности кальция. В присутствии кальция связывание увеличивалось в 2-3 раза [88, 103]. Действие ионов кальция было более выражено при рН 7, при оптимуме связывания рН 6, чем при рН 4. В последующих работах связывание фибронектина увеличивалось с повышением концентрации кальция.
Различные мнения существуют и по идентификации фибронектиновых фрагментов, взаимодействующих с С. albicans, и по ингибиторам связывания [88, 99, 105]. В целом все наблюдения поддерживают множественность точек связывания, в особенности значимым является домен клеточного связывания [88]. Использование аффинной хроматографии для выделения фибронектин связывающих компонентов определило два связывающих белка с неизменной молекулярной массой 60 кДа и 105 кДа и два вида белка после частичной редукции с молекулярной массой 62 кДа и 72 кДа [104]. Белки присутствовали в клеточной мембране, в клеточной стенке, и трубках прорастания. Молекулы оказались маннопротеинами, на основе их способности к связыванию конканавалина А. Компонент 60 кДа проявляет перекрестную реакцию с антителами к человеческим интегриновым рецепторам для фибронектина, что дало возможность отнести их к интегринам. Так же, обнаруживались три основные реактивные единицы между 40-50 кДа и полидисперсной реактивностью около 143 кДа [71].
Выделение и посев материала, количественный учет клеток С. albicans
В качестве объектов исследований использовали штаммы С. albicans.
Непатогенный музейный штамм №4 C.albicans, полученный из коллекции музея ЦКВИ (г. Москва) и используемый на производстве при получении антигенных препаратов.
В исследовании использовали штаммы С. albicans, выделенные в микологической лаборатории КНИИЭМ, от- пациентов в возрасте от 1 до 56 лет, находящихся на амбулаторном лечении, с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции различной локализации (слизистых и кожных покровов). Всего протестировано 457 штаммов С. albicans.
Большую группу (130 штаммов) составили штаммы, выделенные с кожных покровов от больных с диагнозом «атопический дерматит», проходивших лечение в аллергологических центрах города Казани. Возраст больных - от 1 до 43 лет, причем доля больных в возрасте от 1 до 18 лет составляла 80%. 16 штаммов выделено у взрослых с диагнозом атопический дерматит (АД) с микотическим осложнением. 90 штаммов выделено от больных в возрасте от 3 до 54 лет с диагнозом микоз и кандидоз кожи. Причем, у многих больных в возрасте от 32 до 54 лет встречались хронические формы кандидоза (ХКК) и микоза кожи (ХМК).
Следующая группа штаммов была выделена со слизистых покровов ротовой полости и влагалища. В исследование были отобраны 90 штаммов от больных с подозрением на острую псевдомембранозную форму орофарингеального кандидоза, известного как молочница ротовой полости с поражениями как всех отделов полости рта и глотки, так и с частичными поражениями (щек, языка, зева и т.д.). Возраст больных составил от 1 до лет. 24 штамма; выдел єно от больных с диагнозом хроническая атрофическая форма кандидоза полости рта. Возраст больных данной группы составил; от 42: до 56 лет. У большинства больных отмечалось присутствие зубных; протезов. 6:штаммов. Є. albicans, выделили из ротовой; полости от больных; с диагнозом системный кандидоз.
33 штамма выделены от больных с диагнозом, вульвовагинальный кандидоз, как в острой стадии заболевания, так и в хронической" форме. Возраст, больных составил от 19 лет.
Также в исследовании изучены, 31 штамм С. albicans, выделенные от пациентов, прошедших успешный; курс лечения; антимикотическими; препаратами, в отсутствии клинических проявлений; 43 штамма- С albicans были выделены; от условно-здоровых лиц без клинических- признаков микологического заболевания.и отнесены к группе клинически не значимых., по мнению лечащего врача; или; миколога;--штаммов (колонизация, контаминация).
Штаммы грибов Є. albicans выделялись от больных и условно; здоровых лиц с і помощью стерильного тампона из гигроскопической1 ваты с последующим смывом дистиллированной водой. Затем тампон помещали в стерильную пробирку с 2; мл дистиллированношводы.
Материал со слизистых оболочек рта и; зева- брался вначале с внутренней поверхности щек, неба, губ, затем с языка, тщательно протирая, тампоном спинку и корень, а в заключение - круговым движением иззева.
Материал с кожных: покровов смывали по периметру наиболее свежих поражений, кроме того брался материал покрышки пузырьков и пустул [2].
Посев проводился на агаризованную среду Сабуро в две чашки Петри, причем в одну чашку добавлялся стрептомицин в количестве. 70 ед/мл среды.
Засеяные среды выдерживали в термостате при температуре 30 С в течение 48-72 часа. Производили расчет численности клеток С. albicans в смыве с 1 тампона в 1 мл дистиллированной воды.
Расчет численности дрожжевых клеток (п) в 1 мл исследуемого материала производили по формуле [2]: N = axb хс где а - среднее число колоний на одной чашке Петри, b = 10 при объеме посевного материала 0,1 мл, с - степень разведения экскрета (10, 100, 1000).
Применение специальных методик идентификации проводили после того, как на среде Сабуро получали колонии, отвечающие макро- и микроморфологическим признакам дрожжеподобных грибов С. albicans.
С. albicans на агаре Сабуро растет в виде блестящих кремово-белых колоний. Края колоний ровные, иногда слегка филенчатые. Размер колоний превышает 1 мм, в некоторых случаях достигают до 5-6 мм, так называемые гигантские колонии. Колонии имеют мягкую сметанообразную консистенцию.
Микроморфологические признаки грибов изучали при помощи светового микроскопа Микмед-6 (ОАО «ЛОМО», г.С.-Петербург). Для изучения морфологии клеток использовался метод «раздавленная капля». На хорошо вымытое и высушенное предметное стекло наносили каплю стерильной дестилированной воды и помещали в нее с помощью микробиологической петли культуру клеток исследуемого материала. Препарат покрывали покровным стеклом и исследовали сначала при малом увеличении 10x10, а затем при большом увеличении 10x40. При микроскопии колония состяла из округлых, овальных, почкующихся клеток размером 3-Ю мкм в диаметре. По переферии колоний встречались нити псевдомицелия. Однако при микроскопии многие культуры дрожжеподобных грибов имеют сходные параметры, поэтому в их идентификации используются иные, более сложные методы.
Проростковая проба, или тест на образование герминативных (проросткових, или зародышевых) трубок демонстрирующий рисунок 6, является основным методом идентификации грибов С. albicans. Колонию гриба вносили в пробирку с 0.5-1 мл стерильной сыворотки крови или средой №199 и инкубировали при 37С в течение 1.5-4 часов. После инкубации каплю содержимого пробирки помещали на предметное стекло и исследовали под световым микроскопом при увеличении 10x40. При микроскопировании отмечали образование дрожжевыми клетками филаментов (зародышевых трубок) — предшественников истинных гиф. Характерным для истинных герминативных трубок, образуемых грибами С. albicans, является отсутствие сужения в основании трубки, то есть в том месте, где она образуется из материнской клетки. Однако, 10-15% выделяемых от пациентов С. albicans неспособны к образованию зародышевых трубок [2, 34].
Разработка модели адгезии С. albicans на нитроцеллюлозной пленке
Влияния трипсина и маннопротеидного антигена клеточной стенки С. albicans проводили методом острого опыта [11].
В. 5 мл раствора трипсина (0.025 г трипсина растворяли в 5 мл дистиллированной воды) суспендировали клетки С. albicans и инкубировали 1 час при температуре 30 С. Затем биомассу отделяли от трипсина на центрифуге ТУ 5 - 375 в течение 10 минут, при 3000 g. Клетки гриба дважды отмывали от раствора трипсина 2-кратным объемом дистиллированной воды.
Клетки грибов суспендировали в 3 мл фосфатного буферного раствора с рН 5. После этого проводили определение адгезивных свойств как описано выше. В качестве контроля использовали клетки гриба, не обработанные трипсином и суспендированные в 3 мл фосфатного буферного раствора с рН 5.
Для изучения влияния маннопротеидного антигена клеточной стенки С. albicans на процесс адгезии к 1.5 мл раствора антигена (0.5 мг антигена растворяли в дистиллированной воды) добавляли 3.5 мл фосфатного буферного раствора с рН 5, куда затем помещали нитроцеллюлозную пленку с иммобилизованным белком. Инкубировали 1 час при температуре 30 С. Определение адгезии проводили, как описано выше. В качестве контроля использовали нитроцеллюлозную пленку с иммобилизованным белком без дополнительной обработки маннопротеидным антигеном клеточной стенки С. albicans. Опыты проводили в 3-5 биологических повторностях. Проведена статистическая обработка результатов. ...
Для определения влияния экстрактов мицелиальных грибов на адгезивную способность С. albicans, были взяты экстракты наиболее часто встречающихся грибов (TR, AsN, PCh).
Ингибирующее или стимулирующее действие экстрактов мицелиальных грибов на адгезивную способность клеток проводили методом острого опыта двумя способами.
1 вариант: Культуру клеток С. albicans раннего возраста засевали в жидкую питательную среду Сабуро, разлитую в пробирки по 3 мл с разной концентрацией (0.05, 0.1, 0.25, 0.5 мл) соответствующих экстрактов и в течение 48 часов культивировали при температуре 30С. Затем определяли уровень адгезии как описано выше. В качестве контроля исследовали культуру клеток С. albicans, выросшую без добавления экстрактов.
2 вариант: Экстракты разной концентрации (0.05, 0.1, 0.25, 0.5 мл) добавляли непосредственно во время опыта в пробирки с суспензией клеток и нитроцеллюлозной пленкой. Затем определяли уровень адгезии как описано выше.
Опыты проводили в четырех биологических повторностях.
Полученные данные были подвергнуты статистическому анализу методами вариационной статистики с использованием компьютерных программ «Microsoft Excel» и «Statistic for Windows». При обработке результатов исследования вычисляли значение средней величины и стандартную ошибку средней. Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Разброс показателей, отображенный в графиках, представлен с доверительным интервалом для р 0,05. Исследование взаимосвязи между отдельными показателями проводили с применением корреляционного анализа.
Для получения антигена С. albicans использовали методику получения антигенов по ВФС 42-93-88 [9,10], разработанную в лаборатории по разработке грибковых аллергенов Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии.
В колбы с жидкой питательной средой (200 мл), где присутствует экзогенный белок (БСА), как единственный источник азота, засевали штаммы С. albicans. Процесс выращивания проходил при рН 5.5, в течение 6 суток, температура культивирования +30С. По окончании культивирования измерялась оптическая плотность при длине волны 540 нм. Чистоту культуры контролировали микроскопированием нативных препаратов. Затем питательную среду вместе с культурой клеток центрифугировали (3000gxlOMHH) в течение 10 минут. Осадок, состоящий из клеток С. albicans высушивали и взвешивали. Затем клетки гриба помещали в стерильную ступку и растирали стерильным песком. После измельчения клеток в ступку добавили 5 мл стерильной дистилированнои воды, полученную кашицу перенесли в центрифужные пробирки и центрифугировали (3000gxl0MHH) в течение 10 мин. В надосадочной жидкости измеряли количество антигена содержащегося в клетках гриба. Расчет количества антигена производили по отношению к оптической плотности культуры. Все измерения велись по отношению к культуральной жидкости. Количество антигена грибов С. albicans, выделенного в среду во время роста грибов определяли следующим способом. Надосадочную жидкость состоящую из питательной среды после центрифугирования осаждали тремя объемами охлажденного спирта высшей очистки в течение суток при температуре +4С с дальнейшим центрифугированием (3000gxlOMHH) в течение 10 мин. Осадок высушивали и разводили 5 мл стерильной дистиллированной воды, затем определяли количество антигена. Опыты проводили в трех биологических повторностях.
