Введение к работе
Актуальность проблемы
Антагонизм широко распространен среди различных групп микроорганизмов и обусловлен продукцией различных антимикробных веществ. Образование антимикробных веществ, в частности белков, токсичных для других организмов, известно у головневых [Koltin Y., 1988], плесневых и других групп грибов [Mizutani М. et al., 1982], а также у бактерий [Konisky J., 1982; Блинкова Л.П., 2007]. Подобные антагонистические взаимоотношения обнаружены и у дрожжей [Bevan E.A. et al., 1963; Comitini F. et al., 2004; Paluszynski J.P. et al., 2007; Wang X., et al., 2007]. Белоксодержащие вещества с молекулярной массой от 10 кДа до 160 кДа, синтезируемые дрожжами и угнетающие или полностью подавляющие развитие штаммов других видов и даже родов, принято называть киллерными токсинами или микоцинами [Golubev W., 1998].
Так называемые штаммы-убийцы (киллеры) дрожжей, продуцирующие белковые токсины фунгицидного или фунгистатического действия, известны уже более 40 лет и особенно детально исследованы у сахаромицетов [Голубев В.И. и Чуркина Л.Г., 1990; Наумов Г.И. с соавт., 2005]. Штаммы, образующие микоцины, обнаружены среди многих родов клинически значимых дрожжей, в том числе Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hansenula [Young T.W., 1987; Starmer W.T. et al., 1987; Magliani W. et al., 1997; Golubev W., 1998; Schmitt M.J., 2002]. Наиболее распространенными в клинической практике являются дрожжи Candida albicans и Malassezia spp.
Дрожжи рода Malassezia относятся к представителям нормальной микрофлоры кожи человека и теплокровных животных. В человеческой популяции от 74 до 93% здоровых индивидуумов в возрасте от 14 до 60 лет являются носителями Malassezia spp. [Faergemann J., Fredriksson T., 1980; Арзуманян В.Г. с соавт., 2002; Zargari А. et al., 1994]. Однако у иммунокомпрометированных носителей дрожжи Malassezia ассоциированы с целым рядом заболеваний, таких как пестрый лишай [Faergemann J., 1979], атопический дерматит [Broberg A., 1995], фолликулит и другие. Есть данные о наличии антагонистической активности Malassezia spp. против дерматофитных грибов [Weary Р.Е., 1967]. Однако до сих пор не было установлено, являются ли Malassezia продуцентами киллерных токсинов и, если да, то каков их спектр действия и другие свойства.
Дрожжи C. albicans в норме населяют некоторые эпителиальные ткани человека – кишечник, вагинальный тракт [Seebacher S. et al, 1971; Анкирская А.С., 2001]. При снижении иммунитета популяция C. albicans значительно увеличивается и распространяется в нехарактерные локусы – ротовую полость, кожу, респираторный тракт [Нобл У.К., 1986, Арзуманян В.Г. с соавт., 2002]. Несмотря на высокую частоту встречаемости C. albicans в клинической практике, данные об антагонистической активности, сведения о распространенности явления, природе антагонистических субстанций и спектре их действия у этих дрожжей весьма немногочисленны [Philliskirk G. et al., 1975].
Популяции дрожжей родов Malassezia и Candida зачастую встречаются в одной и той же экосистеме – на коже человека. Так, например, порядка 20% больных атопическим дерматитом являются одновременно носителями дрожжей Malassezia и Candida на коже [Арзуманян В.Г. с соавт., 2002]. Как эти два рода дрожжей взаимодействуют между собой в реальных условиях, можно узнать, если смоделировать эту ситуацию в эксперименте.
Цель исследования:
Исследование способности продукции киллерных токсинов штаммами клинически значимых дрожжей Malassezia и C. albicans.
Задачи исследования:
-
Оценить наличие и спектр киллерной активности у штаммов дрожжей Malassezia и C. albicans из лабораторной коллекции НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН и выбрать штаммы-продуценты.
-
Изучить свойства киллерных токсинов наиболее активных штаммов.
-
Установить локализацию генетических детерминант киллерной активности у штаммов дрожжей Malassezia.
Научная новизна
Впервые показано наличие киллерной активности и спектра ее действия у дрожжей Malassezia. Установлено, что антагонистическая активность обусловлена комплексом, состоящим из гликолипидной и белковой (33 и 35 кДа) частей, каждая из которых активна против определенных видов дрожжей. Показано, что киллерная активность у дрожжей рода Malassezia детерминирована хромосомой.
Впервые оценен спектр киллерной активности у дрожжей C. albicans, которая обусловлена термолабильными и чувствительными к протеиназе белками с молекулярными массами 118 и 130 кДа.
Впервые выявлена взаимная фунгистатическая активность при одновременном заселении экспериментальной экосистемы равными по плотности популяциями дрожжей C. albicans и Malassezia.
Практическая значимость
В результате проведенных исследований были выявлены наиболее активные штаммы-продуценты киллерных токсинов среди дрожжей C. albicans и дрожжей рода Malassezia.
Разработана модификация метода оценки целостности цитоплазматической мембраны, позволяющая обойтись без микроскопии.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Изученные штаммы C. albicans в 100% случаев и 90% штаммов дрожжей рода Malassezia обладают киллерной активностью, направленной против дрожжей аско- и базидиомицетного аффинитета. Наиболее антагонистически активные штаммы-продуценты: M. furfur № 607 и C. albicans № 927.
-
Свойства токсинов штаммов-продуцентов сводятся к следующим:
Киллерный токсин M. furfur № 607 - комплекс, состоящий из термостабильной, нечувствительной к протеиназе гликолипидной и термолабильной, чувствительной к протеиназе белковой (33 кДа и 35 кДа) фракций и оказывающий дозозависимое воздействие.
Киллерный токсин C. albicans № 927 – термолабильные, чувствительные к протеиназе белки с молекулярными массами 118 кДа и 130 кДа, оказывающие дозозависимое воздействие.
3. Генетическая детерминанта, ответственная за киллерную активность дрожжей рода Malassezia, локализована в хромосомных генах.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, ноябрь 2001); на I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (2003); на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, ноябрь 2009); на VIII всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002). Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН 11 декабря 2009 года.
Объем и структура диссертации
