Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время наблюдается рост грибковых оппортунистических инфекций, среди которых значительную часть составляет кандидоз (Рахманова А.Г. и соавт., 2000; Елинов Н. П., 2001; Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001, Лебедева Т.Н., 2004; Лесовой В.С., Липницкий А.В. 2008), вызываемый, преимущественно, Candida albicans (Бурова С.А., Воинова Г.В., 1997; Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001, Лесовой В.С. и соавт., 2003; Cannon R.D.et al., 1995). Развитие инфекции зависит от вирулентности кандид, состояния колонизируемой ткани и выраженности иммунных реакций (Cannon R.D.et al., 1995). В то же время, остается открытым вопрос о пусковых механизмах кандидоза и взаимодействии различных звеньев иммунитета в ходе заболевания.
Достаточно хорошо изучен спектр факторов патогенности, которые обеспечивают адгезию и инвазию C.albicans (Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001, Tronchin G. et al., 1991; Chaffin W.Z. et al., 1998; Cannon R.D., Chaffin W.L., 1999).
Недавно представлены данные о формировании возбудителем биопленки – резистентной ассоциации C.albicans, состоящей из гифальных (мицелиальных) и дрожжевых элементов, а также об устойчивости клинических изолятов кандид к антагонистическому действию лактосодержащих пробиотиков (Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Добрица В.П., 2008). Более патогенной принято считать мицелиальную форму гриба (Odds F.S.,1988), однако не вполне ясно, что способствует ее большей вирулентности по сравнению с дрожжевой формой.
Первую линию защиты при кандидозной инвазии обеспечивают факторы слизистых оболочек и опсонофагоцитарные реакции (Махрова Т.В. и соавт., 2003; Гасанова Ф.М., Караев З.О., 2008; Challacombe S. J., 1994; Cannon R.D. et al., 1995; Vazquez-Torres, A. et al., 1997; Kozel, T. R., 1999; Peltroche-Llacsahuanga H. et al., 2000; Romani L.,2000;). Однако, несмотря на значительное число работ, посвященных адгезии и колонизации кандид на слизистых оболочках, недостаточно изучены механизмы регуляции адгезивной фазы инфекционного процесса и роль отдельных факторов слизистых оболочек. Существуют противоречивые данные о влиянии микрофлоры ( et al., 2008; Elahi S. et al., 2005; Diebel L.N. et al. , 1999; Nair R.G., Samaranayake L.P., 1996; Holmes A.R., 1995; Bagg J., Silverwood R.,1986; Kennedy M.J., Volz P.A., 1985) и действии эффекторов воспаления (Симбарская М.Л. и др., 2008) на адгезивные реакции кандид. Необходимо также упомянуть и о биологически активных продуктах нейтрофилов (миелопероксидаза, катионные белки, кислые гидролазы, щелочная фосфатаза, простагландины, лизоцим, низкомолекулярные пептиды и др.), входящих в состав мукозальных секретов (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Witko-Sarsat V. et al.,2000; Murav'ev R.A. et al., 2003), и потенциально способных оказывать влияние на прикрепление кандид к эпителию слизистых оболочек.
Кандиды, подобно другим микроорганизмам, способны стимулировать клетки макроорганизма, вызывая синтез цитокинов (Steele C., Fidel P.L.,2002; Schaller M. et al., 2004). Цитокины играют существенную роль при инфекциях, обеспечивая кооперацию между эффекторами клеточного и гуморального иммунитета (Ярилин А.А.,1999, Маянский А.Н., 2003). Несмотря на многочисленные публикации, характеризующие цитокиновую сеть при кандидозной инфекции, мало внимания уделяется цитокинам, которые продуцируются нейтрофилами. В то же время показано, что данные регуляторные молекулы важны для взаимодействия различных звеньев иммунитета на начальном этапе развития инфекции (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Witko-Sarsat V., 2000).
Немаловажную роль в элиминации С. albicans играет биоцидность нейтрофилов, которая усиливается после прямых и опсонин-опосредованных взаимодействий фагоцитов с кандидами, в частности, с участием опсонинов альтернативного пути активации комплемента (АПАК) (Ройт А. и соавт., 2000). Отсюда представляется важным изучение эффективности АПАК-зависимой опсонизации С. albicans и ее функциональных последствий в системе с нейтрофилами.
В настоящее время акцент в изучении патогенеза кандидоза сместился на исследование механизмов регуляции иммунного ответа при инфекции. Особый интерес представляют внутриклеточные сигнальные пути, такие как система нуклеарного фактора kB и группа митоген-активированных киназ. Они играют важную роль в регуляции активности генов, отвечающих за адаптивные реакции клеток человека, и вовлечены в продукцию иммунорегуляторных и биоцидных факторов (Маянский А.Н. и соавт., 2007; Tian W. et al.,2000; Tak P.P., Firestein G.S.,2001; Tato C. M., Hunter C. A.,2002; Tang N. et al., 2004).
Таким образом, исследование механизмов и факторов, влияющих на взаимоотношение С.albicans с эффекторами первого уровня защиты (мукозальные эпителиоциты, нейтрофилы, система комплемента) позволит расширить представления о причинах развития кандидозной инфекции и возможных путях ее регуляции.
Широкое распространение штаммов C. albicans, обладающих резистентностью к антибиотикам (Выборнова И.В., и др., 2008; Анкирская А.С., и др., 2006; Арзуманян В.Г., Семенов Б.Ф., 2001; Cualco L. et al., 2007; Baddly J.W., Moser S.A., 2004), выдвигает еще одну задачу: поиск фунгицидных (биоцидных) средств, позволяющих преодолеть лекарственную устойчивость кандид.
Цель настоящего исследования
Определить условия и факторы, влияющие на взаимодействие С.albicans с эпителиоцитами слизистых оболочек, нейтрофилами и комплементом, и изучить механизмы их действия.
Задачи исследования
-
Сравнить нейтрофил - стимулирующую активность дрожжевой и мицелиальной форм C.albicans.
-
Оценить активность С.albicans в системе альтернативного пути активации комплемента.
-
Изучить функциональные последствия внутрисосудистой дестабилизации крови, индуцированной C. albicans, в системе нейтрофильного фагоцитоза.
-
Охарактеризовать набор факторов и условий, влияющих на адгезию C. albicans к эпителиоцитам слизистых оболочек.
-
Определить значимость активации внутриклеточных сигнальных путей, сопряженных с нуклеарным фактором kB и системой митогенактивированных киназ для нейтрофилов и буккальных эпителиоцитов при взаимодействии с C. albicans.
-
Оценить эффект некогерентного импульсного излучения на C.albicans в экспериментальных системах in vitro и in vivo.
Научная новизна
Получены новые сведения о патогенности кандид, реализуемой в системах с нейтрофилами, комплементом и мукозальными эпителиоцитами.
Впервые показано, что мицелиальная форма C. albicans обладает большей вирулентостью, чем дрожжевая, реализуемой в системах с нейтрофилами. Мицелиальная форма слабее индуцирует биоцидность фагоцитов и активнее способствует продукции нейтрофилами молекул, дестабилизирующих гомеостаз.
Установлена антиопсоническая активность С.albicans в системе альтернативного пути активации комплемента и определены функциональные последствия данного эффекта при опсонин-опосредованных взаимодействиях кандид с нейтрофилами.
Выявлен и впервые исследован феномен «острой мобилизационной блокады» нейтрофилов, проявляющийся в снижении миграции полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЛ) в зону воспаления в условиях, имитирующих состояние кандидемии (внутрисосудистая дестабилизация крови).
Установлено, что адгезия C. albicans на эпителиоцитах зависит от интенсивности метаболизма, синтеза белка и реактивности цитоскелета буккальных клеток. Показано, что эффективность адгезии C. albicans на эпителиоцитах зависит от интенсивности синтеза белка клетками кандид. Определен вклад различных компонентов мукозальных секретов и эффекторов воспалительного процесса в реализацию адгезии C. albicans на клетках эпителия слизистых оболочек. Показано ингибирующее влияние секреторных метаболитов Staphylococcus aureus на адгезивность C. albicans.
Определен вклад внутриклеточных сигнальных путей, связанных с нуклеарным фактором kB и митогенактивированными киназами (ERK1/2 и р38), в реализацию функционального потенциала нейтрофилов и эпителиоцитов в системах с C.albicans.
Впервые выявлен фунгицидный эффект некогерентного импульсного излучения в отношении C.albicans. Определены основные факторы и механизмы биоцидного эффекта некогерентного импульсного излучения.
Практическая значимость
Оптимизирована экспериментальная тест-система для изучения адгезии C. albicans на эпителиальных клетках. Определены факторы, влияющие на адгезию в системе «C. albicans – буккальные эпителиоциты». Снижение адгезивной активности кандид под действием ингибирующих факторов позволит вносить коррективы в комплексное лечение кандидозов.
Создана экспериментальная модель для изучения функционального потенциала экссудативных нейтрофилов на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови. Определено влияние внутрисосудистой циркуляции C. albicans на кислород-зависимую биоцидность нейтрофилов в очаге острого воспаления.
Разработана методика изучения нейтрофилов крови с помощью атомной силовой микроскопии.
Результаты проведенных исследований позволили обосновать применение высокоэнергетических импульсных воздействий как средство для дезинфекции и антисептики, которое обладает фунгицидным действием и не влияет на базовые показатели гомеостаза макроорганизма. Получено положительное решение о выдаче патента «Способ дезинфекции биологических субстратов и эпителиальных покровов» от 28.03.2008; № заявки 2007118899/15 (020587).
Результаты испытаний, проведенных совместно с инженерами РФЯЦ ВНИИЭФ (г. Саров), легли в основу устройства для генерации некогерентного импульсного излучения «БРИГ», разработанного в 2004 году.
Внедрение результатов работы
Разработанные методы и экспериментальные тест-системы используются при проведении научных исследований, а также в лабораторно-клинической практике ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Устройство для генерации некогерентного импульсного излучения «БРИГ», применяют в медико-биологических и электрохимических исследований в РФЯЦ ВНИИЭФ (г. Саров), НИИ им. Скобельцина при МГУ (г.Москва), а также ЦНИЛ ГОУ ВПО НижГМА Росздрава (г. Нижний Новгород).
Результаты исследования используются при обучении студентов на кафедре микробиологии и иммунологии и в процессе преподавания на циклах повышения квалификации на кафедре профилактической медицины ЦПК и ППС ГОУ ВПО НижГМА Росздрава (г. Нижний Новгород).
Положения, выносимые на защиту
-
Дрожжевая и мицелиальная форма C. albicans обладают различной способностью активировать нейтрофилы. Мицелиальная форма слабее, чем дрожжевая, индуцирует кислород-зависимую биоцидность нейтрофильных гранулоцитов и вызывает более выраженную продукцию нейтрофилами провоспалительных медиаторов (ИЛ-8, ИЛ-6) и иммунорегуляторов (sHLA-I), дестабилизирующих гомеостаз.
-
C.albicans обладают антиопсонической активностью в системе альтернативного пути активации комплемента, которая детерминируется термолабильными компонентами клеточной стенки грибов. Присутствие кандид в кровяном русле приводит к торможению направленной миграции нейтрофилов в очаги воспаления.
-
C. albicans и эпителиоциты слизистых оболочек активно взаимодействуют друг с другом на этапе адгезии кандид. Контакт C. albicans с буккальными клетками зависит от белок-синтезирующей активности кандид, а также усиливается при различных видах метаболической и цитоскелетной активности эпителиоцитов. Существенный вклад в антиадгезивный эффект ротовой жидкости и сыворотки крови вносят антитела, а также температурозависимые факторы, вызывающие необратимые изменения адгезинов C. albicans.
-
Активация в нейтрофилах внутриклеточных сигнальных путей, связанных с нуклеарным фактором kB и митогенактивированными киназами (ERK1/2 и р38), опосредуется специфическими контактами с C.albicans и ведет к увеличению продукции активных форм кислорода фагоцитами. Кандида-индуцированная активация нуклеарного фактора kB в эпителиоцитах усиливает их адгезивность в отношении C.albicans.
-
Высокоэнергетические импульсные искровые разряды миллисекундной длительности, генерирующие некогерентное излучение (НКИ), вызывают дестабилизирующий эффект, приводящий к гибели C.albicans. Деструктивный эффект НКИ селективен: он более выражен в отношении кандид, чем в отношении клеток макрорганизма.
Апробация материалов диссертации
Диссертация апробировалась на расширенном заседании кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО НижГМА Росздрава (г. Нижний Новгород) 6 ноября 2008г.; протокол № 3.
Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на:
IV всесоюзном совещания «Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение» (Москва, 1992), 5-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2001), международной конференции “Proceeding of the Scanning Probe Microscopy-2001 Workshop” (Нижний Новгород, 2001), 1-м, 2-м, 3-м и 4-м Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003; 2004; 2005; 2006), III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); 3-м съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), международном научном семинаре «Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии» (Саров, 2004), VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2005), симпозиуме национального альянса дерматологов и косметологов (Санкт-Петербург, 2007),VI, VII, VIII, IX и XI научно-практической конференции по медицинской микологии (Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2003; 2004; 2005; 2006; 2008), Первом и Втором съездах Микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2002; 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 55 печатных работ, в том числе 19 – в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки, в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций и совещаний. Издано 3 учебно-методических пособия для студентов медицинских ВУЗов, рекомендованных УМО. Одна работа выполнена на уровне изобретения (получено положительное решение о выдаче патента РФ).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 39 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель включает 432 источника литературы, в том числе 106 отечественных и 326 зарубежных авторов.
