Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 .Обзор литературы
1.1. Кандиды: экология, морфо-функциональные особенности и факторы патогенности 9
2.1. Реактивность буккальных эпителиоцитов 27
Глава 2. Материалы и методы исследований 34
Глава 3. Собственные исследования
1. Общая характеристика адгезивной активности Candida albicans
1.1. Стандартизация тест-системы 45
1.2. Сравнение спектра адгезивных реакций С. albicans, полученных из разных экологических ниш (свежевыделенные штаммы) 46
1.3. Сравнение адгезивной,активности музейных и свежевыделенных штаммов C.albicans. 48
1.4. Выбор времени инкубации буккальных эпителиоцитов с C.albicans 48
1.5. Сравнение адгезивной активности живых и убитых С. albicans .49
1.6. Оценка прочности адгезивных контактов между C.albicans и буккальными эпителиоцитами 50
1.7. Показатели естественной и искусственной колонизации буккального эпителия у взрослых и детей 51
2. Изучение метаболической и цитоскелетной активности буккальных эпителиоцитов.
2.1. Влияние температуры на адгезивную активность C.albicans 54
2.2. Влияние блокады гликолиза 56
2.3. Влияние колхицина и цитохалазина В 57
2.3.1. Влияние колхицина 57
2.3.2. Влияние цитохалазина В 59
2.3.3. Влияние обработки С. albicans колхицином и цитохалазином В 60
2.4. Влияние циклогексимида (ингибитор синтеза белка) 61
3. Влияние препарата «Кодивак» на адгезивную активность С. albicans 63
4. Влияние продуктов стафилококков на адгезивные реакции в системе «C.albicans - буккальные эпителиоциты» 65
4.1. S aureus 65
4.1.1. Влияние смеси метаболитов S. aureus на адгезивную активность С. albicans 65
4.1.2. Влияние метаболитов различных штаммов S. aureus на адгезивную активность С. albicans 67
4.2. Изучение механизма снижения адгезивных свойств С. albicans золотистым стафилококком 69
4.3. S.epidermidis 71
4.4. Влияние метаболитов стафилококков на адгезивный потенциал буккальных эпителиоцитов 72
5. Влияние продуктов нейтрофилов на взаимодействие С. albicans с эпителиальными клетками 74
6. Влияние сывороточных факторов на адгезивную активность C.albicans
6.1. Стандартизация тест-системы 78
6.2. Влияние антител 80
6.3.Антиадгезивные факторы, не имеющие отношения к антителам..83
6.4. Влияние комплемента на адгезивную активность С. albicans...85
7. Влияние секрета ротовой полости на адгезивные реакции в системе С. albicans - буккальные эпителиоциты
7.1. Цельная слюна 87
7.2. Значение антител 90
7.3. Влияние муцина на адгезивную активность С. albicans в системе с буккальными эпителиоцитами 93
Заключение 97
Выводы 109
Список литературы 111
- Кандиды: экология, морфо-функциональные особенности и факторы патогенности
- Сравнение спектра адгезивных реакций С. albicans, полученных из разных экологических ниш (свежевыделенные штаммы)
- Влияние циклогексимида (ингибитор синтеза белка)
- Влияние продуктов нейтрофилов на взаимодействие С. albicans с эпителиальными клетками
Введение к работе
Последние годы ознаменовались заметным повышением интереса к эпителию слизистых оболочек. Это связано с признанием координирующей позиции мукозального эпителия в реакциях, обеспечивающих взаимодействие механизмов врожденного (неспецифического) и специфического иммунитета, для инициации и стабилизации воспалительных процессов слизистых оболочек [88, 95, 102, 113, 126, 142, 146, 172, 174]. Мукозальные эпителиоци-ты обладают значительным эффекторным потенциалом в реакциях воспаления и иммунитета, реализуя его в ответ на стимулирующие воздействия как эндогенной (цитокины и пр.) так и экзогенной природы, в частности в системе с микроорганизмами [25, 40, 74, 120, 126, 142, 148, 168, 192].
Отсюда, несомненный интерес вызывает изучение взаимоотношений между эпителиоцитами и такими патогенами как кандиды, поскольку полагают, что кандидоз является результатом нарушения баланса между механизмами клиренса в системе мукозального эпителия и, условиями, обеспечивающими активное размножение и персистенцию грибов на слизистых оболочках [39]. Актуальность данной темы сопряжена еще и с тем, что в настоящее время отмечается рост кандидозных оппортунистических инфекций [20] среди населения, при этом основным патогеном является Candida albicans [39, 59].
Адгезия С. albicans на эпителиоцитах является первым и обязательным этапом развития кандидоза. При этом, на реализацию адгезивного потенциала в системе "кандиды - эпителиоциты " могут оказывать влияние многие факторы, как со стороны кандид, так и со стороны организма хозяина. К последним, в частности, принадлежат секреторные продукты ротовой полости (антитела, гуморальные факторы, продуцируемые эпителиальными клетками).
Известно, что выход кандид за пределы очага первичной колонизации сопровождается выраженным воспалительным процессом, в развитие кото-
5 рого активно вовлечены фагоциты [39]. При этом одним из главных эффекторов воспалительной реакции, обеспечивающих защиту против кандидозной инвазии, служат нейтрофилы, действующие в системе опсонической кооперации с антителами и комплементом [6, 63]. Участие нейтрофильных продуктов во взаимоотношениях кандид с эпителиоцитами остается неизвестным.
Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета, и воспалительной реакции в антикандидозной защите, механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на адгезию кандид изучены недостаточно. Кроме того, существуют противоречивые данные о роли нормальной микрофлоры в реализации адгезивного потенциала в системе «Candida albicans-буккальпые эпителиоциты» [94, 131].
В связи с вышеизложенным модель искусственной колонизации С. albicans на буккальных эпителиоцитах является простым и удобным способом оценки адгезивного потенциала кандид, позволяющим оценить воздействие различных факторов мукозального иммунитета на адгезивные реакции в системе «макроорганизм - микроорганизм».
Цель исследования: Целью настоящего исследования является определение факторов, способных влиять на адгезию в системе «Candida albicans - буккальные эпителиоциты».
Задачи исследования
1. Отработать стандартную тест-систему для изучения механизмов адгезии кандид на буккальном эпителии.
Изучить значение метаболической и цитоскелетной активности клеток в реализации адгезивного потенциала в системе «кандиды - буккальные эпителиоциты».
Изучить влияние бактериальных метаболитов на адгезивные свойства С. albicans.
Определить адгезивную активность С. albicans в условиях взаимодействия с сывороточными факторами и нейтрофилами.
Изучить механизмы антиадгезивной активности секрета ротовой полости в системе «С. albicans - буккальные эпителиоциты».
Изучить адгезивные реакции C.albicans в системах с буккальны-ми эпителиоцитами взрослых и детей.
Научная новизна исследования
Установлено, что буккальные эпителиоциты играют активную роль во взаимоотношениях с кандидами. Адгезия С. albicans зависит от метаболизма, синтеза белка и реакций в цитоскелетной системе буккальпых клеток. Определен вклад различных компонентов мукозального иммунитета (специфические и неспецифические факторы) и сывороточных продуктов (антитела, комплемент и другие неспецифические факторы) в реализации адгезивного потенциала в системе «С. albicans—буккальные эпителиоциты». Определено влияние нейтрофильных компонентов и микробных метаболитов различных штаммов S. aureus и 5". epidermidis на реализацию адгезивного потенциала С. albicans. Исследована зависимость между степенью контаминации буккального эпителия нормальной микрофлорой у взрослых и детей и способностью С. albicans колонизировать буккальные эпителиоциты. Изучено влияние пептидогликано-полисахаридного комплекса Corynebacterium diphtheria на взаимодействие кандид с буккальными клетками.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Отработана стандартная тест-система для изучения кандидозной адгезии, что дает возможность целенаправленного изучения различных факторов, влияющих на адгезию, как со стороны кандид, так и со стороны буккального эпителия. Создана коллекция бактериальных штаммов с известными параметрами адгезии на буккальных эпителиоцитах здоровых доноров. Определены факторы (компоненты ротовой жидкости, сыворотки, физические воздействия) способные влиять на адгезию в системе «С. albicans — буккальные эпителиоциты». Данные об антиадгезивных свойствах изученных компонентов могут использоваться при выборе адекватной стратегии для борьбы с кандидозами в медицинской практике. Изменение адгезивной активности кандид, в частности ее снижение, под действием ингибирующих факторов, позволит вносить коррективы в комплексное лечение кандидозов. Информация о влиянии бактериальных метаболитов и нормальной микрофлоры буккального эпителия у взрослых и детей на адгезивные реакции С. albicans в системах с буккальными эпителиоцитами позволяет дополнить сведения о механизмах взаимоотношения кандид с оральным микробиоцино-зом как в норме, так и при патологии.
Положения, выносимые на защиту
1. Буккальные клетки занимают активную позицию во взаимоотношениях с кандидами. Об этом говорит снижение адгезии С. albicans при торможении метаболитной и цитоскелетной деятельности буккальных эпителиоцитов.
Продукты метаболизма S. aureus оказывают негативное влияние на адгезию С. albicans, вызывая необратимое торможение их взаимодействия с бук-кальными клетками.
Нормальные антитела вносят существенный вклад в антиадгезивный эффект сыворотки и слюны при взаимодействии С. albicans с буккальным эпителием.
В сыворотке и слюне содержатся температурозависимые факторы, вызывающие необратимые изменения адгезинов С. albicans.
Список сокращений
АПАК — альтернативный путь активации комплемента
ДДС - додецилсульфат натрия
ЗФР - забуференный физиологический раствор (рН 7,2-7,4)
ЗФР-Т - забуференный физиологический раствор с добавлением 0,05 % тви-
на-2
ПМЛ - полиморфноядерные лейкоциты
ХЛ - хемилюминесценция
Кандиды: экология, морфо-функциональные особенности и факторы патогенности
Впервые упоминание о кандидозных поражениях (инфекциях) ротовой полости было обнаружено у Гиппократа в 4 веке до н.э. (377 год до н.э.). Местные описания кандидозных поражений сделаны в 1771 и 1784 гг. Candida albicans впервые была выделена от больного туберкулезом в 1844 году, в 1849 году дрожжеподобные грибы были обнаружены при вагинальном кан-дидозе, а в 1853 году - при системной инфекции.
В XX веке серьезное исследование микроскопических грибов рода Candida было начато в Австралии. В 1939 году на 3-м международном Конгрессе микробиологов австралийский исследователь доктор Вергхоут предложил принять термин Candida для возбудителей микозов. Официальное имя рода Candida было утверждено на 8-м ботаническом конгрессе в Париже в 1954 году [177].
Род Candida включает около 150 видов грибов, которые относят к дейтеромицетам, в связи с полным отсутствием половой стадии развития. Некоторые (семь) их этих видов: C.albicans, C.tropicalis, C.krusei, C.kefyr, C.(Torulopsis) globrata, C.guilliermondii, C.parapsilosis признаны с медицинской точки зрения наиболее важными болезнетворными микроорганизмами [39, 58]. С. albicans является наиболее распространенным представителем рода, изолированным от человека и известен как комменсал и как условно-патогенный микроорганизм [3, 59, 177].
Различные виды Candida обитают в разнообразных экологических нишах. Все эти дрожжеподобные грибы широко распространены в природе. Термин «дрожжи», применительно к таксономии грибов, не является офици 10 альным. Под термином «дрожжи» чаще всего понимают грибы семейства Saccharomycetaceae (класс Endomycetes, порядок Ascomycotd), а под «дрож-жеподобными» организмами — формы, размножающие преимущественно почкованием клеток, не подразумевая при этом какого-либо таксономического родства между ними [30]. Так, из более чем 2000 генов, идентифицированных у C.albicans, только 100 (5%) имеют молекулярную гомологию с Sac-charomyces [115]. Дрожжи отличаются от плесневых грибов (плесеней) по двум признакам: во-первых, колонии дрожжей на питательных средах похожи на бактериальные - гладкие, пастообразные, вырастают через 48-72часа; во-вторых - при микроскопировании дрожжей выявляются клетки овальной или круглой формы, разной величины (процесс почкования); размеры клеток - до 10 мкм. Такие же морфологические и культуральные признаки имеются у кандид.
Кандиды могут находиться на объектах внешней среды, на поверхности медицинского инструментария, на предметах домашнего обихода, на игрушках, посуде, в питательном креме для рук, косметике. Они лучше выживают на влажных поверхностях, чем на сухих неживых объектах, но при достаточной степени загрязнения могут сохраняться на последних до 24 часов [36]. C.albicans изолируется с зубных щеток большинства носителей кандид во рту, с зубных протезов [89], катетеров. В больших количествах эти микроскопические грибы обнаруживаются в молочных продуктах: в творожных сырках (78,6%), твороге (66,6%), сметане (75%), сыре (70%) [188]. Кандиды способны сапрофитировать в окружающей среде на субстратах живой и неживой природы (чаще на богатых сахарами фруктах и овощах, особенно несвежих) [145].
С. albicans выделяется от приматов, домашних и других млекопитающих, сумчатых, птиц [59]. У людей C.albicans предпочтительно колонизирует поверхность слизистых (ротоглотка, влагалище). Желудочно-кишечный тракт является главным резервуаром инфекции, при этом C.albicans способна колонизировать практически любую часть желудочно-кишечного тракта, от ротовой полости до перианальных тканей [65, 136]. Вульвовагинальная область колонизирована видами кандид у 40% здоровых женщин [59], уровень колонизации значительно повышается при беременности, активной половой жизни и гинекологической патологии [39]. С.albicans также часто колонизирует человеческий эпидермис, особенно влажную кожу между пальцами рук или ног. Частота выделения кандид от людей зависит от возраста и диеты: ротовая полость — 1,9- 41%, желудочно-кишечный тракт - 0 -55%, влагалище - 2,5- 68% [6].
При носительстве в ротовой полости первое место занимает C.albicans-47-75%, второе - C.tropicalis и C.globrata - 7% [58]. К факторам, которые увеличивают процент носительства кандид, относят: снижение процесса слюноотделения, низкая рН слюны, увеличение концентрации глюкозы в слюне, курение. Отмечено также, что носительство С. albicans у пациентов в стационаре значительно выше, чем у здоровых людей. Так, частота орального носительства у здоровых людей - 17%, у больных в стационарах (без клинических проявлений кандидоза) - 40 - 69%. До сих пор окончательно не доказано: постоянные или разнообразные штаммы могут присутствовать у людей при непрерывном и длительном носительстве. Заметим, что постоянное выделение С. albicans из полости рта еще не является доказательством кандидозной инфекции (см. ниже).
Возбудителем кандидоза чаще всего является С. albicans (до 62% случаев) [6]. У иммунокомпрометированных хозяев кандидозные инфекции поддерживаются резидентными штаммами [138, 195]. Эпидемиологический анализ с использованием отпечатков ДНК биотипов, показал, что большая часть штаммов, ответственных за инфицирование генетически сходны [157, 186]. При исследовании грибов С. albicans, выделенных из разных локализаций, была обнаружена их генетическая неоднородность, при исследовании штаммов, полученных от больных и носителей, - их генетическая однородность с большим потенциалом изменчивости [39]. Во внешней среде С. albicans можно обнаружить в воде и почве, загрязненных экскрементами че 12 ловека или животных, эти же грибы могут загрязнять пищевые продукты, например фрукты и фруктовые соки [39], но из внешней среды C.albicam выделяется реже, чем другие виды кандид, и это может быть следствием ее большей патогенности (адаптация к паразитизму) для человека [177].
Сравнение спектра адгезивных реакций С. albicans, полученных из разных экологических ниш (свежевыделенные штаммы)
Недавно появились сообщения, в которых говориться о том, что адгезия микроорганизмов влияет на реактивность клеток хозяина, приводя к перестройке в системе регуляции генов, в частности генов, отвечающих за синтез цнтокинов [72]. Такого рода контактная болезнетворность имеет большое значение для патогенності! бактерий и грибов, определяя продукцию хемо-кинов, детермнирующих патологический процесс. Нам известны работы, в которых приводятся данные о влиянии адгезии С. albicans на транскрипционные реакции эпителиоцитов, включая реакции в системе NF-кВ, одного из центральных регуляторов внутриклеточного гомеостаза [100].
Наши опыты подтверждают активное участие эпителиальных клеток в адгезивных реакциях С. albicans. Об этом говорят данные, демонстрирующие снижение прикрепления кандид на холоду (выключение клеточного метаболизма), при торможении гликолиза (блокада фторидом натрия) и эксперименты с подавлением синтеза белка (опыты с циклогексимндом). Значение собственного метаболизма С. albicans подтвердилось только в опытах с выключением синтеза белка, когда предварительная обработка живых кандид циклогексимндом снижала показатели адгезии почти на половину.
Эксперименты с ингибиторами цитоскелета позволили установить, что одной из точек приложения активного метаболизма, индуцируемого кандидами при адгезии на буккальных клетках, являются реакции в системах микрофиламентов и микротрубочек (подавление цитохалазином В и колхицином). Отличительной особенностью этих экспериментов было то, что ци-тохалазин В и колхицин гораздо меньше действовали на адгезию убитых кандид: эффект проявлялся только при обработке буккальных клеток, цито-халазин В и колхицин были не активны при действии на С. albicans. Это подтверждает участие элементов живых клеток в адгезивных реакциях с кандидами. В целом, адгезия кандид на буккальных клетках складывается из двух механизмов. Один из них не зависит от уровня метаболической и цитоске-летной активности эпителиоцитов и отвечает примерно за половину реакции. Можно думать, что это пассивный механизм, который не связан с рецепторами кандид, а определяется гидрофобными и электростатическими взаимодействиями. Второй механизм является результатом метаболически активных клеток. Это совокупность реакций, отвечающих за взаимоотношения живых клеток, которые лучше всего проявляются в физиологичных условиях.
При выяснении природы адгезивных рецепторов буккальных клеток нас заинтересовал вопрос об участии в этом процессе так называемых Toll-рецепторов эпителиоцитов. Известно, что различные Toll-молекулы связывают бактериальные липополисахариды, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты, липопротеины, гликолипиды, флагеллин, ДНК, фунгальные манна-ны, вирусные белки и суперантигены [182]. Для многих из Toll-рецепторов характерен структурный консерватизм, предполагающий общность рекогносцировочных реакций [92, 182, 185].
Первое сообщение о Toll-подобных рецепторах человека (TLR-4) сделано в 1997 г. [123], но уже ясно, что они играют важную роль в гомеостазе, обеспечивая эстафетную стыковку врожденного и адаптивного (специфического) иммунитета. Суть TLR-зависимой рекогносцировки сводится к сканированию стимулов, исходящих от разнородных агентов, на основе распознавания их наиболее общих (консервативных) структур - рекогносцировочных образов, отсюда англ. "pattern recognition receptors" [92, 133]. Рекогносцировочный плюрализм TLR связан и с тем, что, кроме непосредственных контактов с агонистамн, они выступают в роли корецепторов, транслируя или усиливая импульсы с других лигандсвязывающих структур [88, 178]. Будучи привилегией макрофагов, нейтрофилов и дендроцитов [92], TLR экс-прессируются и другими клетками, в том числе мукозальными эпителиоци-тами [83, 88, 103]. В литературе имеются единичные сведения в пользу участия TLR-2 и TLR-4 клеток HeLa в качестве стартового сигнала, воспринимающего адгезивные контакты от С. albicans, транслируя их на генетический аппарат клетки путем эстафетной стимуляции NF-кВ и р38 (Deva et al., 2003).
О возможном значении Toll-рецепторов во взаимодействии кандид с буккальными клетками судили по способности «Кодивак»1, пептидо-полисахаридного комплекса С. diphtheriae (который предположительно мог связываться и тем самым блокировать Toll-рецепторы эпителиоцитов), тормозить адгезию кандид.
Ампулу «Кодивака» разводили в 1 мл физраствора, чтобы получить концентрацию действующего начала 3 мг/мл. Препарат смешивали в равных объемах с буккальными клетками (106кл/мл) и после инкубации (30 мин, 37С) проверяли на адгезивную активность с кандидами. Для сравнения испытывали действие «Кодивака» на кандиды в том же режиме.
Результаты, приведенные в табл. 12, показывают отсутствие какого-либо эффекта препарата на систему «буккальные эпителиоциты-кандиды». Это можно расценить как отсутствие влияния поверхностных TLR-структур буккальных клеток в адгезивных реакциях кандид. Дальнейшие исследования должны подтвердить это в опытах с более специфичными реагентами, такими как моноклональные антитела против различных типов TLR.
Влияние циклогексимида (ингибитор синтеза белка)
Последнее время несомненный интерес вызывает изучение взаимоотношений между эпителиоцитами и такими патогенами как кандиды, поскольку полагают, что кандидоз является результатом нарушения баланса между механизмами клиренса в системе мукозального эпителия и, условиями, обеспечивающими активное размножение и персистенцию грибов на слизистых оболочках [3, 39]. Актуальность данной темы сопряжена еще и с тем, что в настоящее время отмечается рост кандидозных оппортунистических инфекций [20, 39] среди населения, при этом основным патогеном является Candida albicans [59].
Адгезия С. albicans на эпителиоцитах является первым и обязательным этапом развития кандидоза. При этом, на реализацию адгезивного потенциала в системе "кандиды - эпителиоциты " могут оказывать влияние многие факторы, как со стороны кандид, так и со стороны организма хозяина. К последним, в частности, принадлежат секреторные продукты ротовой полости (антитела и другие гуморальные факторы, в том числе продуцируемые эпителиальными клетками).
Известно, что выход кандид за пределы очага первичной колонизации сопровождается выраженным воспалительным процессом, в развитие которого активно вовлечены фагоциты [39]. При этом одним из главных эффекторов воспалительной реакции, обеспечивающих защиту против кандидозной инвазии, служат нейтрофилы, действующие в системе опсонической кооперации с антителами и комплементом [63]. Участие нейтрофильных продуктов во взаимоотношениях кандид с эпителиоцитами остается неизвестным.
Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета, и воспалительной реакции в антикандидозной защите, механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на адгезию кандид изучены недостаточно. Кроме того, существуют противоречивые данные о роли нормальной микрофлоры в реализации адгезивного потенциала в системе «.Candida albicans-буккалъиыс эпителиоциты» [94, 131]. В связи с вышеизложенным, предложенная в данной работе модель искусственной колонизации С. albicans на буккальпых эпителиоцитах является простым и удобным способом оценки адгезивного потенциала кандид, позволяющим оценить воздействие различных факторов мукозального иммунитета на адгезивные реакции в системе «макроорганизм - микроорганизм» [49].
Целью настоящего исследования является определение факторов, способных влиять на адгезию в системе «Candida albicans — буккальные эпи-телиоциты».
Нашей первой задачей было исследование вопроса о режиме, в котором следует изучать адгезивные реакции кандид в системах с буккальными клетками. Проведенные исследования позволили установить масштаб штаммовых различий С. albicans в адгезивных взаимоотношениях с буккальными эпителиоцитами человека. Он был достаточно велик для музейных культур (от 6,1 до 30 кандид на одну эпителиальную клетку) и в меньшей степени проявлялся для штаммов, только что выделенных из разных источников (8,5-13,6). Был выбран штамм (С. albicans 601) для проведения дальнейших исследований, который отличался средними, но наиболее постоянными показателями адгезии. Установлен оптимальный режим экспериментов (37С, 30 мин), в условиях которого результаты не зависели от жизнеспособности кандид, не давали вторичного ореола адгезии (за счет коадгезии кандид, не успевших связаться с клетками-мишенями на первом этапе опыта) и обеспечивали прочность связывания (по оригинальному верографин-фиколловому тесту) 60,8 ± 9,0 % . Показатели адгезии у взрослых существенно не отличались от показателей адгезии у детей 6-8 лет по сравнению с нормальной микрофлорой буккалыюго эпителия, которая была в три раза выше в детском возрасте. Эти данные подтверждают возрастные различия естественной колонизации буккальпых клеток [67, 183]. Они не затрагивают их чувствительности к искусственному заселению чужой микрофлорой, в частности грибами, экологически эктопич-ными для данного биотопа. Отсутствие корреляций между уровнем между уровнем естественной и искусственной колонизации в обеих возрастных категориях свидетельствует о том, что состояние нормальной микрофлоры не влияет на адгезивные взаимоотношения в системе «С. albicans -буккальные эпителиоциты».
Последние годы ознаменовались заметным повышением интереса к нетрадиционным функциям мукозалыюго эпителия (эпителия слизистых оболочек). Это связано с признанием его координирующей позиции в реакциях, стыкующих механизмы врожденного (неспецифического) и специфического иммунитета. Мукозальные эпителиоциты обладают значительным эффекторным потенциалом в реакциях воспаления и иммунитета, реализуя его в ответ на стимулирующие воздействия экзогенной (микроорганизмы, аллергены, поллютанты) и эндогенной (цитокины и др.) природы [25, 40, 74, 113, 120, 124, 126, 189]. Оказалось, что мукозальные эпителиоциты обладают значительным эффекторным потенциалом, реализуя его в ответ на стимулирующие воздействия экзогенной (микроорганизмы, аллергены, поллютанты) и эндогенной (цитокины и др.) природы [142, 168, 192].
Недавно появились сообщения, в которых говориться о том, что адгезия микроорганизмов влияет на реактивность клеток хозяина, приводя к перестройке в системе регуляции генов, в частности генов, отвечающих за синтез цитокинов [72]. Такого рода контактная болезнетворность имеет большое значение для патогенності! бактерий и грибов, определяя продукцию факторов, детерминирующих патологический процесс. Нам известны работы, в которых приводятся данные о влиянии адгезии С. albicans на транскрипционные реакции эпителиоцитов, включая реакции в системе NF-кВ, одного из центральных регуляторов внутриклеточного гомеостаза [100].
Влияние продуктов нейтрофилов на взаимодействие С. albicans с эпителиальными клетками
Для изучения природы факторов, не имеющих отношения к антителам, проводили предварительную обработку кандид при 37С и 4С сывороткой, истощенной по антителам. После их отмывания сравнивали активность в адгезивных реакциях с буккальнымн клетками относительно опыта с торможением адгезии цельной (неистощенной) сывороткой. При 4С антиадгезивный эффект истощенной сыворотки был минимальным — 12,3 ± 1,4 %, против 55,8 ± 2,2 % при 37С (р =0,002). Для цельной сыворотки те же показатели были гораздо выше: 54,6 ± 2,7 % (4С) и 73,5 ± 1,4 % (37С) (р 0,005). Обработка 0,1 % ДДС не устраняла антиадгезивный эффект истощенной сыворотки. Это говорило о том, что в сыворотке содержатся факторы, действие которых на кандиды проявляется, во-первых, только при 37С и, во-вторых, не экранировано нековалентно связанными молекулами.
Можно было думать, что такой эффект оказывают факторы системы комплемента, которые (С4Ь, СЗЬ) в процессе активации подвергаются ковалентному связыванию с объектами. Для изучения влияния комплемента проведены опыты с пулами сыворотки, истощенной кандидами (4С, 30 мин). Активность комплемента в истощенных сыворотках под 106 тверждена опытами с опсонизацией зимозана в люминолзависимой хеми-люминесценции нейтрофилов человека.
Установлено, что комплемент не влиял на адгезивную активность кандид. Можно было думать, что температурозависимые компоненты сыворотки, оказывающие антиадгезивное действие, относятся к другим факторам (ферментам?!), структурно модифицирующим адгезины кандид.
Известно, что адгезия С. albicans на буккальных эпителиоцитах зависит от факторов слюны [101, 155, 175]. Слюна способна препятствовать адгезии микроорганизмов на эпителии, но механизмы этого эффекта изучены недостаточно [58, 121]. Так как секрет ротовой полости представляет собой многокомпонентную систему, можно ожидать, что антиадгезивным действием будут обладать различные компоненты слюны, в частности, антитела [81, 91, ПО, 112, 129, 150], муцины [45, 71, 114, 201], катионные белки [78, 84, 152, 203, 204, 206]. В слюне содержится большое количество ферментов [144, 200], способных модифицировать адгезивный аппарат кандид и других микроорганизмов.
Нами исследовано влияние нормальной слюны и ее отдельных факторов (специфических и неспецифических) на показатели адгезивных взаимодействий между С. albicans и буккальными клетками.
Цельная слюна здоровых взрослых доноров вызывала снижение адгезии кандид в 3,1 ± 0,29 раз; остаточный уровень адгезивной активности составлял 36,0 ± 3,05 %. Это говорило о том, что адгезия кандид включает два компонента, один из которых блокируется слюной, а другой не подвержен ее влиянию. Данное обстоятельство согласуется с информацией о неоднородности адгезивного субстрата кандид. В нем участвуют многие поверхностные антигены, которые, учитывая представительство С. albicans в нормальной микрофлоре, должны индуцировать образование саливарных антител. Можно было рассчитывать на их участие в антиадгезивных реакциях, в частности в системе с буккальными клетками.
Действительно, методом иммуноферментного анализа в слюне нормальных доноров были найдены антикандидозные антитела. Максимальные показатели наблюдались для IgG-антител (соотношение опыт/контроль — 12,6 ±1,2). Значения для IgA-антител были примерно такими же, но из-за более высоких цифр в контроле показатели опыт/контроль оказались ниже (4,0 ± 1,3). Содержание IgM-антител было в 3,3 ± 0,9 меньше, чем IgG. После обработки кандид слюной, предварительно истощенной по анти-кандидозным антителам, наблюдали снижение адгезивного эффекта в 1,6 ± 0,2 раз (р 0,05), после обработки цельной слюной в 3,1 ± 0,29 раза. Это говорит о том, что антитела сносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, отвечая за 40 % антиадгезивного эффекта.
В серии экспериментов кандиды предварительно обрабатывали при 4С истощенной слюной и затем изучали их адгезивную активность при добавлении буккальных клеток. Параллельно такую же операцию проводили с цельной слюной. Антиадгезивный эффект при 4С был минимальным - 9,1 ± 0,01% против 23,4 ± 3,4% при 37С (р 0,05). В отличие от этого для цельной слюны снижение показателей было недостоверным (р 0,05). Обработка 0,1% раствором ДДС не приводила к восстановлению исходного адгезивного уровня.
Это говорило о том, что, подобно сыворотке крови, в слюне имеются факторы, действие которых на кандиды проявляется, во-первых, только при 37С и, во-вторых, не экранируется нековалентно связанными молекулами.
Для выяснения природы этих факторов были проведены опыты с муцином (бычий, Sigma, США), рассматривая его как обязательный компонент слюны, который отвечает за часть ее антиадгезивного эффекта [71]. Обработка муцином (1 мг/мл, 37С, 30 мин) снижала адгезивную активность кандид независимо от того, какой компонент системы предварительно преинкубиро-вался с муцином - буккальный эпителий (снижение адгезии до 49,7 ± 2,4 %) или кандиды (48,7 ± 5,3%) (р=0,4561). Обработка 0,1 % раствором ДДС вела к частичному восстановлению исходного адгезивного уровня. Это позволяет говорить об экранирующем (нековалентном) эффекте муцина в системе кан-диды - буккальный эпителий, что не совпадает с нашими данными о 0,1 % ДЦС-устойчивости антиадгезивного эффекта истощенной слюны. Полученные данные говорят о том, что температурозависимые антиадгезины, присутствовавшие в «безантительной» слюне, не имеют отношения к муцину. Предположительно речь идет о факторах ферментной природы, способных вызывать структурные изменения поверхностных компонентов кандид.
Похожие диссертации на Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность Candida albicans в системах с буккальными эпителиоцитами
