Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9-36
Экзотоксин холерных вибрионов и методы определения его активности 9
1. Свойства холерного экзотоксина 9-26
2. Методы определения токсигенной активности холерных вибрионов 26-36
ГЛАВА II. Материалыи методы 37-44
Материалы 37-38
Методы исследования 38-44
1. Методика культивирования холерных вибрионов 33-39
2. Изучение культуральных свойств 39-40
3. Биохимические реакции 40
4. Гистологические методы исследования 41
5 Методика получения гомогенатов 41-42
6. Методика получения фильтратов культур холерных вибрионов 42
7. Биологические методы исследования 42-44
ГЛАВА III. Характеристика местной реакции при внутри-кожном введении живых холерных вибрионов и некоторых их антигенов 45-71
1. Сравнительное изучение кожной реакции при введении живых холерных вибрионов, фильтратов их жидких культур и убитых клеток 45-54
2. Выживаемость холерных вибрионов в коже кролика 54-53
3. Специфичность кожной реакции при внутрикожном введении живых холерных вибрионов 58-61
4. Динамика морфологических изменений при внутрикожном введении живых холерных вибрионов 61-71
ГЛАВА ІV. Влияние различных условий культивирования на токсигенность холерных вибрионов 72-95
1. Культивирование холерных вибрионов на мембрано-агаре 72-74
2. Морфология клеток холерных вибрионов, выращенных на мембраноагаре 75-80
3. Влияние температуры культивирования на образование фактора III холерных вибрионов 80-81
4. Значение среды культивирования для синтеза фактора III холерными вибрионами 81-82
5. Влияние ионов железа и магния на продукцию фактора III холерными вибрионами .,... ,. 82-85
6. Влияние адениннуклеотидов, гиалуроновой и ацетилнейраминовой кислот на синтез фактора III в клетках холерных вибрионов 86-87
7. Влияние пепсина, трипсина, липазы, амилазы, ДНК-азы, РНК-азы и гиалуронидазы на токсигенность холерных вибрионов 87-93
8. Влияние экстрактов ткани тонкой и толстой кишки человека и кролика на синтез холерными вибрио нами фактора III 93-96
ГЛАВА V. Влияние некоторых молекулярных компонентов клеток животных на активность фактора III 97-106
I. Токсигенность холерных вибрионов при совместном введении их с некоторыми низкомолекулярными веществами и биополимерами 97-98
2. Влияние некоторых низкомолекулярных и макромолекулярных компонентов клеток животных на активность препаратов холерного экзотоксина 98-106
ГЛАВА VІ . Методика опрещеленш фактора III в швых холерных вибрионах и ее практическое применение 107-
1. Методика определения фактора ПФ в живых холерных вибрионах 107-108
2. Характеристика различных штаммов холерных вибрионов по продукции фактора ПФ I08-II4
3. Применение методики определения фактора ПФ в живых вибрионах для оценки их вирулентности ..II4-II8
Заключение и9-і28
Выводы 129-130
Литература i3i-i65
- Свойства холерного экзотоксина
- Методика культивирования холерных вибрионов
- Сравнительное изучение кожной реакции при введении живых холерных вибрионов, фильтратов их жидких культур и убитых клеток
- Культивирование холерных вибрионов на мембрано-агаре
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сложная эпидемическая ситуация по холере, достигшая своего апогея в начале 70 х годов, продолжается и в настоящее время ( Felix н., 1980; who, 1980, 1981) главным образом в развивающихся странах Азии, Африки и Латинской Америки, где она все еще представляет серьезную угрозу для здоровья населения. Расширяющиеся международные отношения увеличивают риск заноса холеры в СССР. В связи с этим изучение особенностей микробиологии холеры является одной из актуальных задач.
В патогенезе холеры ведущее место занимают токсины холерных вибрионов. Еще с момента выделения Р.Кохом возбудителя холеры предполагалось, что клиническая картина заболевания связана с интоксикацией. В последующие годы были достигнуты значительные успехи в получении токсигенных штаммов, а также в изучении физико-химических и биологических свойств холерных токсинов (Burrows W., 1968; Белов Л.Г., Мохин К.М,, 1972; Burrows W., Kaur J., 1974; Van Heyningen s., 1976, 1982; Саямов P.M. с соавт., 1983). Токсические субстанции, которые синтезируют холерные вибрионы, по классификации W. Burrows (1965, 1968) делятся на три типа. Наибольшее значение из них представляет токсин второго типа -экзотоксин (холероген) или энтеротоксин.
У холерного экзотоксина обнаружено три свойства. Первое свойство - энтеротоксичность (холерогенность) заключается в способности вызывать диарею у людей и некоторых новорожденных животных при пероральном или внутрикишечном введении ( Finkeistein R.A. et al., 1966; Sack R.B. et al., 1966; Coleman W.H. et al.,
1968; Lepot A., Banwell J.G., 1976; Baselski V. et al., 1977); второе свойство - мембранотоксичность проявляется в способности образовывать папулы при внутрикожном введении - фактор проницаемости сосудов ПФ ( PF по Craig J.Р., 1965, 1966) и третье свойство - вызывать гибель животных при внутривенном введении ( Craig J.P., 1971).
Для определения токсигенности штаммов холерных вибрионов широко используются методы внутрикишечного заражения суспензиями их культур крольчат 8-Ю дневного возраста или взрослых кроликов в лигированные петли тонкой кишки ( De S.H., Chatter;)ее D.H., 1953; Dutta N.K., НаЪЪи М.К., 1955). Определение фактора проницаемости сосудов кожи по J.P.Craig (1965) при изучении токсигенности штаммов холерных вибрионов производится в фильтратах культур. Однако, эта методика имеет недостатки, так как большинство штаммов не синтезирует экзотоксин:, на лабораторных средах. Поэтому до настоящего времени у штаммов холерных вибрионов исследуют энтероток-сические свойства экзотоксина, но не определяют активности фактора проницаемости сосудов кожи.
Цель работы. Основная цель работы заключалась в разработке высокочувствительного метода определения фактора проницаемости сосудов кожи в культурах холерных вибрионов и изучении его активности у штаммов, выделенных из разных источников.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
Разработать метод выявления фактора сосудистой проницаемости кожи в живых культурах холерных вибрионов.
Исследовать влияние различных условий культивирования на синтез ПФ в клетках холерных вибрионов.
Изучить активность ПФ у штаммов холерных вибрионов, выделенных из разных источников.
Составить методические рекомендации по определению фактора
сосудистой проницаемости (Щ) в живых культурах холерных вибрионов.
Научная новизна. Впервые детально разработан метод определения фактора сосудистой проницаемости кожи (ПФ) в культурах живых холерных вибрионов. Выявлены вещества, стимулирующие и ингибирую-щие активность фактора Ш у штаммов холерных вибрионов, определена интенсивность образования фактора Щ в штаммах холерных вибрионов, выделенных из разных источников.
Практическая ценность. Разработан новый метод определения ток-сигенных свойств штаммов холерных вибрионов по активности фактора проницаемости. На этот способ выдано Государственным Комитетом СССР по делам изобретений и открытий авторское свидетельство № 625415 от 26 мая 1978 года. Составлены "Методические рекомендации по определению фактора проницаемости (Щ) в живых культурах холерных вибрионов, которые одобрены Ученым советом ВНИПЧИ "Микроб" и утверждены директором института. Для изучения биохимической активности штаммов были усовершенствованы методы определения проте-олитической и амилазной активности у холерных вибрионов.
Предложенные методы внедрены в работу отдела подготовки специалистов ВНИПЧИ "Микроб", Уральской ПЧС.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:
на научной конференции ВНИПЧИ "Микроб", посвященной III годовщине со дня рождения В.И.Ленина, Саратов, 1981;
на научной конференции ВНИПЧИ "Микроб", посвященной 112 годовщине со дня рождения В.И.Ленина, Саратов, 1982;
на научной конференции ВНИПЧИ "Микроб", Саратов, 1984.
Публикация. По теме диссертации опубликовано 5 работ и получено авторское свидетельство: "Способ определения экзотоксиген-ных штаммов холерных вибрионов" - К 625415 от 26 мая 1978 года.
Положения выдвигаемые на защиту:
Новый метод определения активности фактора проницаемости Ш у живых холерных вибрионов.
Условия культивирования холерных вибрионов для выявления фактора ПФ.
Активность фактора Ш у штаммов холерных вибрионов, выделенных из разных источников.
Свойства холерного экзотоксина
В последние десятилетия достигнуты значительные успехи в изучении токсинов холерного вибриона. По классификации W.Burrows (1965, 1968) токсины холерного вибриона делятся на три типа. Тип I - эндотоксин, термостабильная недиализабельная субстанция, летальная для мышей, вызывает геморрагические реакции с кровоизлияниями в куриных эмбрионах, не вызывает холероподобного синдрома. Тип П - экзотоксин, недиализабельная, термолабильная субстанция, не устойчивая к физическим и химическим факторам воздействия. При введении внутрикишечно или per ов экспериментальным животным вызывает развитие холероподобного синдрома, при введении в кожу животных возникает отек ( De S.H., 1959; Dutta ет.к. et al., 1959; Craig J.P., 1965; Dutta U.K., 1969; Finkelstein R. et al ,, 1966; Coleman W.H. et al., 1968; bewis A., Freeman В., 1969; Finkelstein R., LoSpalluto J.,1969; Зыкин Л.Ф., 1971; Guerrant R.L. et al., 1972; Адамов A.K., Тихонов Н.Г., 1976; ЭмдинаИ.А., Алексеева Л.П., 1984). Тип Ш - термостабильная дианизабельная субстанция, которая угнетает активный транспорт натрия через почечный эпителий. Действие выражается в ингибировании поглощения ги-пуровой кислоты клетками почек в культурах ткани. Существование токсина Ш типа оспаривается некоторыми исследователями (beitch J.G. et al., 1966; 1967, 1968; Grady G.F. et al., 1968; Horthrup R.S. et al., 1968).
S.C.Sanyal et al» (1983) обнаружили у холерных вибрионов новый термолабильный экзотоксин. Наиболее интенсивно изучаются токсины I и П типа. Установлено, что эндотоксин I токсин I типа) представляет собой макромолекуляр-ный комплекс, состоящий из трех основных компонентов: полисаха-ридного, липоидного и протеидного (Gallut «т., 1954; Коробкова Е.И., I959;Jenkin C.R., 1959;Gallut J., I960; Shrivastava D.L., I960;Kaur J., Shrivastava D.b., I964;Verwey W.F. et al., 1965; Watanabe Y.W. and Verwey W.F., 1965; Коровкина Г.В., 1971; Яговкин Э.А., 1972; Jeneon K.E., 1972; рубцов И.В. с соавт., 1975; Джапаридзе М.Н. с соавт., 1980; Яговкин Э.А., 1981, 1981а; Адамов А.К., 1981; Kabir Sh., 1982).
Как и эндотоксин некоторых других грамотрицательных микроорганизмов, эндотоксин холерного вибриона обладает пирогенными (Ефимцева Е.П., 1962) и дерматотоксическими свойствами (Лобанов В.В., 1971). Эндотоксин оказывает влияние на внутриклеточный метаболизм (Мальцев В.Н., 1968; Киселев П.И., 1971; Огаренко Н.Б., 1972, 1972а, 1975; Адамов А.К. с соавт., 1972, 1981), вызывает увеличение активности некоторых трансаминаз в крови людей и животных ( Burrows W.,1968; Горькова А.В. с соавт., 1974), подавляет дыхание изолированных митохондрий клеток печени белых крыс и активность НАД-зависимых дегидрогеназ цикла Кребса (Джапаридзе М.Н. с соавт., 1969; Адамов А.К. с соавт., 1972; Огаренко Н.Б., 1975). По данным М.Н.Джапаридзе с соавт. (1969) угнетающее действие эндотоксина на дыхание митохондрий наиболее интенсивно в присутствии малата, оксалацетата, L -кетоглутарата и пирувата.
Эндотоксин холерных вибрионов в эксперименте на животных обладает летальным эффектом для мышей ( Jenkin C.R. and Rowley 1959; Колесник B.C., Осипенко И.И., 1969; Лобанов В.В. с соавт., 1971; Яговкин Э.А. с соавт., 1972; Савкина Л.Н. с соавт., 1974). Под действием эндотоксина повышается проницаемость крове-ткане-вого барьера (Глазеров В.З., 1970) , увеличивается выделение ка-техоламинов (Киселев П.И., 1971). Холерный эндотоксин не вызывает накопления жидкости в кишечнике кроликов, но повышает концентрацию ионов калия в его содержимом (Первухина Н.К., Голубев A.M., 1981). Он устойчив к протеазе ( Ganguly R. et al.f 1967; Адамов А.К., 1981).
Холерный экзотоксин (токсин П типа), холероген или энтероток-син является одним из ведущих патогенетических факторов в развитии холерной диареи. Поэтому основное внимание ученых в последние годы было сосредоточено на выделении токсина П типа в чистом виде, изучении его структуры и реакции с макроорганизмом на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.
W.Burrows (1968) к токсинам П типа отнес холероген и фактор проницаемости капилляров кожи. Рассматривая некоторые свойства этих токсинов, он отмечает, что холероген в фильтратах инактиви-руется быстрее, чем фактор сосудистой проницаемости. Методом хроматографии на колонках с ДЭДЭ-целлюлозой можно элюировать три фракции: I - холероген; 2 фракция - с холерогенностью и фактором проницаемости; 3 фракция - только фактор проницаемости ( Chaterjee D.H. et al., 1972).
Методика культивирования холерных вибрионов
В практической диагностике холеры применяют различные модификации ELISA -метода. Например, ультрачувствительный энзим - радиоиммунный метод (Гаврилова Е.М. с соавт., 1979; Harris С.С, et al.t 1979).
Иммуноферментные методы высокочувствительны. Они позволяют выявлять менее 0,05 нг/мл токсина ( Ouchterlony 0., 1980). Холероген и его фрагменты обладают антигенной активностью, которую можно определить, используя антитоксическую сыворотку, посредством различных реакций: иммунодиффузии в геле ( Ohtomo я. et al., 1976; Савельев В.Н. с соавт., 1982), связывания комплемента (РСК) (Лобанов В.В., 1978), агрегат-гемагглютинации (РАГА) (Бароян О.В. с соавт., 1979), пассивного иммунного гемолиза (РІМГ) (Гайлонская И.Н. с соавт., 1980; Жукова Э.В. с соавт., 1981), непрямой гемагглютинапии (Ерохин Е.П. с соавт., 1974; Бебуришвили Е.М., 1980).
Наиболее простыми являются реакции иммунодиффузии в геле ( Ohtomo К, et al», 1976) с использованием специфических иммунных сывороток. Но они обладают сравнительно низкой чувствительностью, приблизительно I мг/мл токсина, а при использовании моноспецифических иммунных сывороток до 0,05 мг/мл ( Ouchterlony О,, 1980).
Более высокую чувствительность проявляют методы агрегат-гемагглютинации (РАГА) (Бароян О.В. с соавт., 1979), непрямой гемагглютинапии (Ерохин Е.П. с соавт., 1974; Бебуришвили Е.М., 1980), в которых применяют эритроциты сенсибилизированные антителами или очищенными препаратами экзотоксина (токсоида).
Сравнительно недавно предложена реакция пассивного иммунного гемолиза для определения энтеротоксина холерных вибрионов (РІШГ) (Жукова Э.В. с соавт., 1981). В этом методе в качестве индикатора систем антиген-антитело используют гемолиз эритроцитов в присутствии комплемента. Чувствительность метода от I до 100 нг, но для его выполнения необходимы очищенные препараты экзотоксина.
Кроме того используют радиоиммунные тесты, которые основаны на количественном определении радиоактивности после взаимодействия иодированных иммуноглобулинов с токсином холерного вибриона ( Harris S.S. et al., 1979; Shah D.B. et al., 1982). Эти методы обладают способностью выявлять малые дозы токсина и его фрагментов (I нг). Широкое практическое применение радиоиммунных методов связано с определенными трудностями, так как для их выполнения требуется дорогостоящее оборудование, а работа с радиоактивным материалом - специальных условий.
Определенный интерес представляют методы с использованием ганг-лиозидов. Известно, что разные по химической структуре ганглиози-ды избирательно связываются с некоторыми микробными токсинами, и, следовательно, могут быть использованы для их специфической индикации. Рядом авторов было доказано, что холерный экзотоксин способен на 95% связываться с ганглиозидами Gm (Holmgren J,, 1973). Поэтому с помощью ганглиозидов Gm1 можно идентифицировать холеро-ген в реакции преципитации (Езепчук Ю.В., 1977). Ее принцип заключается в том, что после связывания с ганглиозидами холероген может оседать из раствора. Внешнее проявление взаимодействия выражается в образовании осадка на дне пробирки.
Модификацией метода является реакция двойной диффузии в геле, которая основана на способности антигена и ганглиозидов диффузно распространяться в геле, формируя линию преципитации. Предложенный способ прост, но обладает низкой чувствительностью, так как обнаруживает не менее 3000 нг энтеротоксина холерного вибриона (van Heyningen s., 1977).
Е.П.Голубинский с соавт. (1980, 1981) использовали феномен связывания ганглиозидов Gnu с токсином для определения токсигенности холерных вибрионов. Они установили, что нехолерогенные штаммы эльтор вибрионов связывают ганглиозиды в пределах 1,4 4,0 мкг IT -ацетилнейраминовой кислоты/10 микробных клеток. Холерогенные штаммы холерных вибрионов (классических и эльтор) фиксируют ганглиозиды в пределах 5,664-8,0 мкг N -ацетилнейраминовой кислоты/10 микробных клеток.
Л.А.Долматова с соавт. (1981) для выявления холерного энтеро-токсина и его компонентов предложили использовать эритроциты, сенсибилизированные ганглиозидсодержащим комплексом. Иммунологические методы высоко чувствительны, они не позволяют выявлять токсической активности энтеротоксина в исследуемом материале, а указывают лишь на антигенную принадлежность.
Таким образом, в настоящее время предложено большое количество различных методов тестирования активности холерного энтеротоксина. Из приведенных литературных данных видно, что они не одинаковы по чувствительности, воспроизводимости и точности получаемых результатов. Каждый метод имеет свои преимущества, но все пробирочные методы, в основном, предусмотрены для титрования активности препара-о тов энтеротоксина. Кроме того, существующие в настоящее время методы определения активности холерного экзотоксина in vitro в отличие от биологических методов не дают возможности дифференцировать холерогенную активность экзотоксина и фактор сосудистой проницаемости. При определении токсигенности холерных вибрионов используют, как правило, биологические модели, такие как введение культуры в лигированные петли тонкого кишечника взрослого кролика по методу s.lUDe и G.с. Chatter;) ее (1953), внутрикишечное введение культуры кроликам 8-Ю дневного возраста по- методу N.K.Dutta им.к.НаЪЪи (1955). Это объясняется тем, что подавляющее большинст- во штаммов холерных вибрионов не синтезирует экзотоксин на имеющихся лабораторных питательных средах.
Фактор сосудистой проницаемости выявляется в стерильных фильтратах или токсических фракциях (штаммов-продуцентов токсина) в кожной пробе на взрослых кроликах, по отеку лапки крысы или белой мыши, В литературе мы не нашли данных о методике выявления Ш в живых культурах холерных вибрионов. Отсутствие информативного теста для выявления фактора Ш в культурах холерных вибрионов является основной причиной недостаточности изученности образования фактора Ш штаммами, выделенными из разных источников. В связи с этим было проведено изучение влияния различных факторов на токсигенность холерных вибрионов и разработана методика определения токсигенности холерных вибрионов по фактору проницаемости холерного экзотоксина
LINK3 Сравнительное изучение кожной реакции при введении живых холерных вибрионов, фильтратов их жидких культур и убитых клеток LINK3 В первой серии опытов была изучена динамика кожной реакции на введение живых клеток холерных вибрионов. Исследования проводили с 8 штаммами холерных вибрионов (4 - биовара холера и 4 - биовара эльтор). Культуры выращивали 18-20 часов на казеиновом агаре при 37. В физиологическом растворе хлористого натрия рН 7,2 го - 46 товили взвеси холерных вибрионов, содержащие 2 млрд.микробных тел в мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им.Тарасевича. Полученные суспензии разводили до концентрации 50 млн.микробных тел в 0,1 мл и вводили внутрикожно взрослому кролику. Методика введения культуры описана в главе П. В качестве контроля испытывали холерный токсин в одной и двух кожных дозах в 0,1 мл. Учет кожной реакции производили через 6,24,48 и 72 часа, измеряя диаметр папулы. За положительный результат принимали размер папул не менее 5 мм. Материалы опытов суммированы в табл.1.
Как следует из представленных на таблице I данных, кожная реакция при введении штаммов холерных вибрионов биовара эльтор четко выражена уже через 6 часов с момента их введения (размеры папул до 7,3 мм в диаметре); к 24 часам кожная реакция достигала максимальных величин (до 9,8 мм); через 48 часов реакция затухала, папулы сокращались в размерах, уменьшалась гиперемия и к 72 часам видимая кожная реакция практически отсутствовала. При введении нетоксигенных штаммов холерных вибрионов мы не наблюдали резкого увеличения размера кожной папулы. Диаметр кожной папулы через 6 и 24 часа не превышал 3-5 мм и к 48 часам реакция полностью исчезала. Кожная реакция на введение холерного токсина раз вивалась в те же сроки, что и при введении живых культур, но через 6 часов после инъекции была менее выражена.
Эти данные послужили основанием к учету результатов внутрикож-ной пробы с живыми культурами холерных вибрионов в последующих опытах через 24 часа. При этом отмечено, что разные штаммы в дозе 50 млн м.т. отличаются по интенсивности вызываемых ими кожных реакций (таблица I).
Во второй серии опытов проводили сравнительное исследование токсигенности живых холерных вибрионов, фильтратов их жидких культур и убитых клеток при внутрикожном введении. Чтобы исследовать токсигенность убитых клеток холерных вибрионов, необходимо было выбрать вибриоцидный агент, не обладающий свойством инакти-вировать холерный экзотоксин. Антибиотики стрептомицин и тетра-циклин для этих целей не пригодны, так как в вибриоцидных дозах снижают активность холерного экзотоксина (Тихонов Н.Г., Адамов А.К., 1982). В качестве вибриоцидного вещества нами было использовано азотнокислое серебро. Для выбора дозы азотнокислого серебра, действующей вибриоцидно, но не инактивирующей холерного экзотоксина, были поставлены опыты с живыми холерными вибрионами и препаратами холерного экзотоксина. Результаты исследования вибриоцидного действия азотнокислого серебра и его влияния на фактор Ш суммированы в таблицах 2 и 3.
Из приведенных в таблицах 2 и 3 данных следует, что в концентрации 5 мкг/мл (0,5мг$) азотнокислое серебро проявляет вибриоцид-ное действие и не инактивирует фактор сосудистой проницаемости Ш). В концентрации 50-100 мкг/мл при 20С, азотнокислое серебро в течение 20 часов инактивировало фактор кожной проницаемости.
Сравнительные опыты с живыми, убитыми клетками холерных вибрионов и фильтратами их жидких культур ставили по следующей методике. В опытах использовали 16 штаммов холерных вибрионов,из них 8 биовара эльтор и 8 биовара холера. Для постановки внутрикожных проб с живыми культурами штаммы холерных и эльтор вибрионов выращивали в 1% пептонной воде в течение 3-4 часов, затем высевали на казеиновый агар. Через 18-20 часов инкубирования при 37С культуры смывали забуференным физиологическим раствором хлористого натрия. По оптическому стандарту мутности ГИСК им.Тарасевича концентрацию клеток вибрионов путем разбавления суспензии физиологическим раствором доводили до 2 млрд.микробных тел в мл. Из этой суспензии готовили рабочие разведения, содержащие 500, 250,
Культивирование холерных вибрионов на мембрано-агаре
Нами были проведены сравнительные исследования токсигенности культур при выращивании на агаре, покрытом целлофановой пленкой и без нее. В последующем питательную агаровую среду, покрытую целлофановой мембраной,будем называть мембраноагаром.
Опыты ставили по следующей методике. Из агаровой культуры отбирали колонии в S-форме, которые засевали в 1% пептонную воду рН 7,6. Через 3-4 часа инкубации (при 37С) культуру пересевали на мембраноагар, который готовили по методике, описанной во П главе. С этой целью 0,1 мл бульонной культуры наносили на мембрану и равномерно распределяли по поверхности пленки стеклянным шпателем. Контролем служили посевы на ту же питательную среду, но без целлофановой мембраны. Опытные и контрольные посевы инкубировали при 37С 18-20 часов. Посевы смывали 2 мл физиологического раствора хлористого натрия рН 7,2. Часть смыва (1,5 мл) центрифугировали при 6000 об/мин 20 минут, супернатант фильтровали через мембранный фильтр № 3, из оставшейся смытой культуры (0,5 мл) готовили рабочие суспензии, содержащие от 50 до 1,56 млн микроб - 73 ных клеток в 0,1 мл. Живые микробные клетки и фильтраты агаровых культур вводили по 0,1 мл внутрикожно взрослому кролику. В опытах использовали 4 штамма биовара холера и 4 штамма биовара эльтор.
Результаты экспериментов, обобщенные в таблице 8 показали, что выращивание холерных вибрионов на мембраноагаре способствует накоплению экзотоксина в клетках вибрионов, за исключением двух штаммов (9469, 846), которые не проявляли холерогенной активности и при заражении ими крольчат.
При введении в кожу кролика фильтратов культур холерных вибрио нов, выращенных на мембраноагаре, выявлена активность фактора Щ у всех взятых в опыт штаммов. Наиболее активные по фактору Ш фильтраты были получены из штаммов эльтор 822, 606, 983 и биовара холера 5693. Фильтраты смыва культуры, выращенной на агаре без мембраны, не обладали активностью в коже кролика, за исключением штамма 569Б и 606. Контроль специфичности.действия, полученных фильтратов проводили с помощью антитоксической сыворотки. К 0,2 мл фильтрата добавляли 0,2 мл антитоксической сыворотки в разведении 1:200, инкубировали 30 минут при 37С и по 0,1 мл вводили внутрикожно кролику.
Фильтраты обладали специфическим действием, так как смеси фильтратов с антитоксической сывороткой при введении кролику не вызывали образования кожной папулы. Сравнение двух методов выращивания показало преимущество использования мембраноагара для выявления токсигенных штаммов холерных вибрионов. Во всех дальнейших исследованиях культуры выращивали на мембраноагаре. на основании данных электронной микроскопии высказали предположение о взаимосвязи между морфологией клеток холерного вибриона и токси-нообразованием. В связи с этим представлялось важным изучить морфологию микробных клеток, выращенных на мембраноагаре.
В опытах использовали 12 штаммов холерных вибрионов с различной токсигенностью. Морфологию микробных клеток изучали в мазках, приготовленных из 18-20 часовых агаровых культур, выращенных на мембраноагаре и на агаре без мембраны. Клетки окрашивали по Граму и изучали в световом микроскопе, обрабатывали люминесцентной сывороткой и просматривали в люминесцентном микроскопе, готовили мазки по методике, описанной ниже и изучали в электронном микроскопе.
В мазках токсигенных штаммов (569В, 978, 983), выращенных на мембраноагаре и окрашенных по Граму, наряду с клетками, имеющими типичную для холерного вибриона форму, встречались единичные клетки, отличающиеся более крупными размерами. На фоне бледно окрашенных слегка увеличенных клеток, отмечались укороченные клетки несколько раздутые с одного конца; в некоторых мазках округлые клетки сгруппировывались. В клетках более крупного размера наблюдали мелкую зернистость. В мазках, приготовленных из тех же штаммов, но выращенных без мембраны обнаруживалось значительно меньше раздутых бледноокрашенных клеток.
