Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ HELICOBACTER PYLORI (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). 9
1.1. Общая характеристика микроорганизма Helicobacter pylori 9
1.2. Факторы патогенности Н. pylori 15
1.2.1. Факторы вирулентности Н. pylori. 15
1.2.2. Особенности патогенеза хеликобактерной инфекции 21
1.2.3. Механизмы персистенции Helicobacter pylori 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
2.1. Характеристика культур микроорганизмов 33
2.2. Методы выделения и идентификации Helicobacter pylori 33
2.3. Методы определения факторов персистенции Н. pylori 34
2.3.1. Определение антилизоцимной активности хеликобактерий 34
2.3.2. Определение антиинтерцидной («антиинтерфероновой») активности хеликобактерий 35
2.3.3. Определение антикомплементарной активности хеликобактерий 36
2.4. Метод изучения внутривидового антагонизма Helicobacter pylori 38
2.5. Метод получения изогенных клонов Н. pylori по изучаемому признаку 39
2.6. Метод изучения влияния факторов персистенции Н. pylori на фагоцитоз полиморфноядерными лейкоцитами 40
2.7. Определение чувствительности Н. pylori к антибиотикам 42
2.8. Метод определения влияния антибиотиков на факторы персистенции Н. pylori 42
2.9. Статистическая обработка результатов 43
ГЛАВА 3. СПОСОБ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРНОЙ ИНФЕКЦИИ 44
ГЛАВА 4. ФАКТОРЫ ПЕРСИСТЕНЦИИ HELICOBACTER PYLORI 55
4.1. Способность Н. pylori к инактивации факторов естественной резистентности макроорганизма 55
4.2. Внутривидовой антагонизм Н. pylori 61
4.3. Роль факторов персистенции Н. pylori в процессе фагоцитоза полиморфноядерными лейкоцитами 64
4.4. Регуляция факторов персистенции Н. pylori антибактериальными препаратами 78
ГЛАВА 5. СВЯЗЬ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ Н. PYLORI С ПАТО-
МОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ В ТКАНЯХ 92
5.1. Связь биологических свойств Н. pylori с воспалительными изменениями в тканях 92
5.2. Связь биологических свойств Н. pylori с пренеопластическими изменениями в тканях 101
5.3. Разработка способа прогнозирования пренеопластических осложнений гастроэзофагеальной рефлюксной болезни 106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
ВЫВОДЫ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125
- Общая характеристика микроорганизма Helicobacter pylori
- Характеристика культур микроорганизмов
- СПОСОБ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРНОЙ ИНФЕКЦИИ
- Способность Н. pylori к инактивации факторов естественной резистентности макроорганизма
- Связь биологических свойств Н. pylori с воспалительными изменениями в тканях
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ведущее место среди гастродуоденальной патологии в настоящее время занимают болезни органов пищеварения, ассоциированные с инфекцией Helicobacter pylori [24]. Гастроэнтерологи и исследователи всего мира начали изучать проблему хеликобактериоза с 1983 года, когда австралийскими учеными B.Marshall и J.Warren был впервые описан новый микроорганизм H.pylori [120]. За прошедшее время были изучены его свойства, описаны многие звенья патогенеза заболеваний, развивающиеся при инфекции Н. pylori, определены методы диагностики и оптимальные схемы лечения [119]. Не вызывает сомнения этиологическая роль Н. pylori в механизмах индукции воспаления в слизистой оболочке желудка. Многочисленными исследованиями показана связь между персистенцией Н. pylori и риском развития язвенной болезни, аденокарцино-мы, В-клеточной мальтомы и хронического гастрита [67,57,141].
Однако многие аспекты проблемы хеликобактериоза до настоящего времени недостаточно изучены и освещены. Несмотря на более чем 20 летний период изучения Helicobacter pylori, недостаточно изученным остается вопрос о механизмах персистенции данного микроорганизма в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки. Как известно, основными условиями персистенции микроорганизмов в той или иной эконише являются: состояние их индифферентности к воздействиям внешних факторов физико-химической природы; обеспечение стабильных антагонистических эффектов в биоценозе; сохранение жизнеспособности популяции за счет приобретения устойчивости к защитным механизмам хозяина [9]. Описана способность хеликобактерий противостоять действию соляной кислоты в слизистой оболочке желудка за счет продукции уреазы, обеспечивающей гидролиз мочевины с образованием аммиака, и наличия униполярно расположенных жгутиков, обеспечивающих подвижность микроорганизма [73, 89]. Неисследованными остаются вопросы
5 межклеточного взаимодействия Н. pylori в биоценозе и способность инакти-вировать гуморальные факторы естественной резистентности хозяина.
Одной из проблем клинической гастроэнтерологии является эрадикация Helicobacter pylori в слизистой оболочке инфицированных лиц [20]. Несмотря на достижения современной фармакотерапии, постоянно растет число сообщений о возрастании резистентности этого микроорганизма к антибактериальным препаратам, увеличивается частота рецидивов и реинфекции [112, 80, 140]. Открытым остается вопрос о влиянии компонентов антибактериальной терапии на феномен персистенции хеликобактерий.
Изучение механизмов бактериальной персистенции хеликобактерий может способствовать как раскрытию патогенетических особенностей заболеваний, где Н. pylori принадлежит ведущая роль, так и наметить новые подходы к диагностике и лечению этих заболеваний.
Поиску ответов на поставленные вопросы посвящена представленная диссертационная работа.
Цель и задачи исследования
Цель работы - изучение биологической роли факторов персистенции Helicobacter pylori у инфицированных лиц (больных язвенной болезнью и хроническим гастритом) и их использование в бактериологической диагностике хеликобактерной инфекции.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
Изучить механизмы персистенции Н. pylori, ответственные за инактивацию гуморальных факторов неспецифической резистентности макроорганизма и обеспечивающие антагонистические эффекты в биоценозе.
Оценить роль факторов персистенции Н. pylori в процессе фагоцитоза полиморфноядерными лейкоцитами.
Изучить действие антибактериальных препаратов, компонентов современных схем эрадикационной терапии, на факторы персистенции Н. pylori.
Выявить связь биологических свойств Н. pylori с морфологическими изменениями в слизистой оболочке желудка.
Разработать методические подходы по улучшению бактериологической диагностики хеликобактерной инфекции.
Научная новизна
Н. pylori обладает комплексом биологических свойств, ответственных за инактивацию механизмов естественной резистентности макроорганизма - ан-тилизоцимной, антикомплементарной и антиинтерцидной активностями. Ан-тилизоцимная и антикомплементарная активности играют протективную роль для хеликобактерий в процессе фагоцитоза полиморфноядерными фагоцитами. Гетерогенные штаммы хеликобактерий способны вступать между собой в антагонистические взаимоотношения.
Разработан новый способ бактериологической диагностики хеликобактерной инфекции, основанный на способности лизоцима осуществлять гидролиз мукополисахаридов слизи в биопсийном образце, способствуя выходу микроорганизмов в жидкую питательную среду.
Установлено, что предлагаемые с целью эрадикации хеликобактерной инфекции антибактериальные препараты разнонаправлено действуют на экспрессию персистентных свойств Н. pylori. Метронидазол приводит к повышению уровня антилизоцимной и антикомплементарной активностей выделенных клинических изолятов хеликобактерий. Снижение антилизоцимной и антикомплементарной активностей наблюдается при добавлении амоксициллина и кларит-ромицина. Ципрофлоксацин, норфлоксацин, эритромицин и тетрациклин на факторы персистенции хеликобактерий влияния не оказывают.
Антилизоцимная и антикомплементарная активности Н. pylori являются информативными маркерами степени активных воспалительных изменений в слизистой оболочке желудка.
Разработан способ прогнозирования пренеопластических осложнений га-строэзофагеальной рефлюксной болезни, основанный на определении антили-
7 зоцимной активности Н. pylori, выделенного со слизистой пищевода (Положительное решение о выдаче патента на изобретение №2003104928/14(005111) от 11.02.2003).
Практическая ценность
Впервые оценена роль персистентного потенциала Н. pylori в патогенезе хеликобактерной инфекции. Персистенция возбудителя в слизистой оболочке желудка определяется наличием комплекса биологических свойств, ответственных за инактивацию эффекторных механизмов естественной резистентности и обеспечивающих антагонистические эффекты в биоценозе.
Практическое значение исследования заключается в возможности использования факторов персистенции хеликобактерий в качестве информативных маркеров степени выраженности инфекционного процесса. Предложен способ прогнозирования пренеопластических осложнений гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, основанный на определении антилизоцимной активности Н; pylori, выделенного со слизистой пищевода. Способ позволил выявить пре-неопластические осложнения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни на ранней стадии их проявления при отсутствии клинических симптомов и эндоскопических признаков, провести своевременно дополнительные методы исследования, начать адекватное лечение и предотвратить утяжеление заболевания.
Разработан новый способ бактериологической диагностики хеликобактерной инфекции, основанный на способности лизоцима осуществлять гидролиз мукополисахаридов слизи в биопсийном образце, способствуя выходу микроорганизмов в жидкую питательную среду. Способ позволил сократить длительность бактериологической диагностики хеликобактерной инфекции в среднем до 3,5 дней, снизить ее трудоемкость и себестоимость.
8 Положения, выносимые на защиту
Персистенция Н. pylori в слизистой оболочке желудка определяется наличием комплекса биологических свойств, ответственных за инактивацию эффекторных механизмов естественной резистентности и обеспечивающих антагонистические эффекты в биоценозе.
Признаки хеликобактерий, обеспечивающие противодействие факторам естественной противоинфекционной резистентности, являются информативными маркерами патоморфологических изменений в тканях.
Апробация работы
Результаты проведенных исследований доложены XVIII-й Всероссийской конференции с Международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, 2002), 1-м Всероссийском Съезде Российского общества эндоскопии пищеварительной системы (Москва, 2002), 6-го Московского международного конгресса по эндоскопической хирургии (Москва, 2002), Восьмой Российской Гастроэнтерологической неделе, (Москва, 2002), IV Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2003).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, получено Положительное решение о выдаче патента на изобретение №2003104928/14(005111) от 11.02.2003 «Способ диагностики пренеопластических осложнений гастроэзофа-геальной рефлюксной болезни».
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, а также указатель литературы, включающий 35 отечественных и 131 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 13 таблицами и 23 рисунками.
Общая характеристика микроорганизма Helicobacter pylori
В настоящее время известно более 19 видов представителей рода Helicobacter, обнаруживающихся у различных животных и птиц (табл. 1). Некоторые из них могут иметь нескольких хозяев. На поверхности слизистой оболочки желудка человека, кроме H.pylori, нередко выявляются H.cinaedi и H.heilmami [138]. Местом постоянного обитания этих микроорганизмов является слизистая оболочка желудка кошек и собак. Попадая в желудок человека, эти микроорганизмы могут участвовать в развитии острой воспалительной реакции. Однако, в отличие от H.pylori, они легко выводятся из организма при проведении адекватного лечения. Другие виды рода Helicobacter встречаются у человека намного реже или не встречаются вообще [70].
Изучение биологических характеристик Н. pylori показало, что микроорганизм представляет собой спиралевидные микроаэрофильные грамнегатив-ные палочки, размером 0,5-1,0 мкм в ширину и 2,5-5,0 мкм в длину [89]. При культивировании на твердых или жидких питательных средах хеликобактерии нередко приобретают округлую (кокковую) форму, которая представляет собой U-образно свернутые палочки, с концов соединенные мембранной структурой [127]. Кокковая форма метаболически активна, однако теряет способность к размножению в условиях in vitro [59]. Н. pylori содержит обычно 4-6 униполярно расположенных жгутиков, которые определяют подвижность бактерии [85].
В настоящее время расшифрована и секвенирована нуклеотидная последовательность генома Н. pylori [91]. Размер генома хеликобактерий колеблется в пределах 1,6-1,7 Mb. Содержание G+C составляет 34,1-37,5 mol% [52]. Геном содержит около 1600 генов, из которых 10% кодируют информацию о ферментах, необходимых для жизнедеятельности микроорганизма, а 40% генов -продукты с неизвестной функцией [31]. Геном хеликобактерий на 58% гомологичен с другими бактериями [54]. Более 40% штаммов хеликобактерий имеют плазмиды, однако в них не содержатся уже изученные факторы вирулентности [87].
Характеристика культур микроорганизмов
Материалом для исследования послужили 156 клинических изолятов Helicobacter pylori, выделенных из биоптатов слизистой оболочки желудка при проведении фиброэзофагогастродуоденоскопии от 174 пациентов в возрасте 16 до 72 лет с различной патологией верхнего отдела пищеварительного тракта (гастрит, эзофагит, язвенная болезнь, пищевод Барретта, рак желудка и др.)
Широкая распространенность инфекции Н. pylori и связь ее с развитием хронического гастрита, язвенной болезни, MALT-омы и рака желудка делают ее одной из главных проблем медицины, важнейшим условием успешного решения которой является точная диагностика пилорического хеликобактериоза.
Современная бактериологическая диагностика обладает наибольшей (до 100%) специфичностью из всех существующих методов диагностики H.pylori, не дает ложноположительных результатов [132, 155]. Однако метод относится к дорогостоящим, трудоемким и не дает возможности ответить на вопрос о наличии Н. pylori ранее, чем через неделю. Это влечет за собой промедление с назначением соответствующей терапии и делает бактериологическую диагностику хеликобактерной инфекции недоступной для практического здравоохранения [24]. Но лишь бактериологическая диагностика Н. pylori позволяет не только идентифицировать микроорганизмы, но и изучить их свойства, в частности, оценить чувствительность к различным антибактериальным препаратам [144]. В условиях возрастающей антибиотикорезистентности H.pylori бактериологический метод представляет особую ценность при обследовании больных, уже получивших один или два неудачных курса эрадикационнои терапии, так как изучение индивидуальной чувствительности к антибиотикам позволяет сформировать оптимальную схему лечения [21]. Все вышеизложенное актуализирует исследования по усовершенствованию бактериологической диагностики хеликобактерной инфекции.
В связи с этим, на первом этапе нами был разработан новый способ бактериологической диагностики Н. pylori.
Наиболее близким к разрабатываемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является известный способ бактериологической диагностики хеликобактерной инфекции. Во время проведения фиброэзо-фагоскопии из препилорического отдела осуществляют забор биопсийного материала, который помещают в транспортную среду Стюарта и направляют в бактериологическую лабораторию в течение ближайших 2-4 часов. Перед посевом на питательные среды проводят ручную гомогенизацию биопсийных образцов в 0,5 мл стерильного физиологического раствора с соблюдением всех правил асептики. Далее производят посев гомогенизата на селективную питательную среду Колумбия-П-агар (BBL, США) с добавлением 10% дефибрини-рованной бараньей крови и селективной добавки из антибиотиков (амфотери-цин-В 10 мг/мл, ванкомицин 10 иг/л, триметоприм 5 мг/мл, сульфометоксазол 25 мг/мл). Чашки помещают в анаэростат GasPak 100 (BBL, США) с газогенераторными пакетами CampyPak Plus (BBL, США). Пробы инкубируют в мик-роаэрофильных условиях со сниженным парциальным давлением кислорода и увеличенным содержанием СОг при 37С в течение 72-168 часов. Выросшие колонии микроорганизмов идентифицируют на основании культуральных, тинкториальных и биохимических свойств (коммерческая тест-система Api-Campy, Biomerieux, Франция) (рис. 2).
Способность Н. pylori к инактивации факторов естественной резистентности макроорганизма
Способностью инактивировать фермент лизоцим обладали 133 (85,4±12,5%) штамма хеликобактерий. Антиинтерциднои активностью обладали 40 (25,6±6,2%) штаммов Н. pylori. Антикомплементарная активность выявлена у 106 штаммов хеликобактерий (65,4±8,5%). Средний уровень антилизо-цимной активности составил 1,23±0,3 мкг/мл, причем для большинства штаммов (76±4,2%) значение признака колебалась от 1 до 2 мкг/мл. Средний уровень экспрессии антиинтерциднои активности составил 1,19±0,2 ед.. У 80±7,1% выделенных клинических изолятов Н. pylori АИА либо отсутствовала, либо значение ее составляло от 1 до 2 ед. Антикомплементарная активность у выделенных штаммов хеликобактерий в среднем составляла 0,43±0,1 анти-ЛЕК 106/с, у большинства (84±8,2%) штаммов регистрировались низкие значения АКА - до 0,5 анти-ЛЕК 106/с.
Величина ошибки классической «чашечной» методики определения анти-лизоцимной активности составляет 1 мкг/мл. Учитывая, что, средний уровень антилизоцимной активности составляет менее 2 мкг/мл, для повышения чувствительности метода нами использовались баранья сыворотка, используемая в качестве добавки в средах для культивирования Н. pylori, предварительно инактивированная термической обработкой при температуре 57С в течение 30-40, минут. Это позволило увеличить чувствительность метода определения антилизоцимной активности до 0,5 мкг/мл.
Для более детального изучения «секреторных» факторов персистенции Н. pylori нами был проведен популяционный анализ ряда клинических штаммов по изучаемым признакам. Обусловлено это тем, что применение фенотипиче-ских методов характеризует популяцию в целом. Популяционный анализ позволяет охарактеризовать уровень персистентных факторов у клонов, формирующих популяцию, определить их соотношение и однородность популяции по изучаемым признакам, индекс разнообразия популяции по факторам персистенции. В дальнейшем полученные данные позволят определить изменения соотношения клонов с различным уровнем признака под воздействием субин-гибиторных концентраций антибактериальных препаратов.
С целью проведения популяционного анализа мы рассевали штаммы до единичных колоний с последующей их репликацией по Lederberg [113] на чашки со средой, содержащей различные концентрации лизоцима для определения антилизоцимной активности и интерцида для определения антиинтер-цидной активности. Для проведения популяционного анализа в отношении антикомплементарной активности клоны Н. pylori после механического разделения пересевались в жидкую питательную среду с последующим определением признака методом [13].
class5 СВЯЗЬ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ Н. PYLORI С ПАТО-
МОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ В ТКАНЯХ class5
Связь биологических свойств Н. pylori с воспалительными изменениями в тканях
Для изучения связи свойств хеликобактерий с морфологическими изменениями в тканях забор биопсийного материала осуществляли с передней стенки препилорического отдела и тела желудка в области малой кривизны. Биоптаты направлялись на морфологическое исследование с целью выявления степени воспалительных изменений в тканях и бактериологическое исследование с целью обнаружения и изучения свойств Н. pylori. Характер морфологических изменений оценивался с использованием полуколичественного метода — трехстепенной визуально-аналоговой шкалы. Активность воспаления оценивали по степени полиморфно-ядерной клеточной инфильтрации тканей. Степень хронического воспаления оценивали по выраженности лимфоцитарно-мононуклеарной клеточной инфильтрации тканей [2].
Биоптаты для бактериологического исследования помещались в транспортную среду (Шедлер-бульон) и транспортировались в течение 2-4 часов в лабораторию. Кусочки тканей подвергались механической дезинтеграции с последующим посевом на селективную питательную среду - Columbia-11-агар (BBL, США) с 10% дефибринированной бараньей кровью и селективной добавкой из антибиотиков (амфотерицин-В 10 мг/мл, триметоприм 5 мг/мл, сульфо-метоксазол 25 мг/мл).
Количественное содержание хеликобактерий определяли по числу выросших колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения.
У выделенных клинических изолятов хеликобактерий определяли факторы персистенции (антилизоцимную, антикомплементаную и антиинтерцидную активности), показатели внутривидового антагонизма (маркеры бактерицино-генности (МБГ) и бактерициночувствительности (МБЧ)), а также гемолитическую активность.
Результаты, демонстрирующие связь биологических свойств хеликобактерий с активностью воспаления в биоптатах (выраженность полиморфно-ядерной клеточной инфильтрации) представлены в таблице 11. Как видно из таблицы результатов при увеличении полиморфно-ядерной клеточной инфильтрации тканей происходило достоверное снижение показателя микробной обсемененности тканей. Так при первой степени активности воспалительных изменений в биоптатах обсемененность тканей составила 4,0±0,3 lg КОЕ/г.
